移植實驗動物模型病理學

郭暉（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所，器官移植教育部重點實驗室，國家衛(wèi)生計生委器官移植重點實驗室，湖北 武漢 430030）

器官移植研究是以實驗為基礎的研究項目，其中包括多種移植外科術式的探索、器官保存方式、排斥反應、免疫抑制以及免疫耐受機制的研究等，需要進行大量不同類型的實驗研究。移植模型研究中的病理學觀察是判斷移植術式的可行性、器官保存方式的優(yōu)劣和研究移植免疫機制的重要環(huán)節(jié)[1]。

1 移植動物模型的基本類型

1.1 依據供、受者遺傳背景的差異分類：移植動物模型依據供、受者的品系組合可以分為同種同品系移植、同種異品系移植和異種移植[2]。同種同品系移植術常作為移植模型中的對照；同種異品系移植用于觀測同種異體移植中的多種排斥反應及免疫耐受模型的建立；異種移植主要用于探討異種器官應用于人體移植的可能性等。

1.2 依據移植部位分類：按移植部位的不同可以分為原位移植、異位移植和靜脈輸注移植[3]。其中原位移植是指將供者的器官移植到受者體內原來的解剖位置，進行此類移植需將受者器官切除；異位移植指供者的器官移植到與受者體內原解剖位置不同的其他位置；靜脈輸注移植主要為細胞移植，如輸血、脾細胞輸注和胰島細胞移植等。

1.3 依據移植物類型分類：按移植物的類別可以分為細胞移植、組織移植和器官移植。細胞移植主要包括輸血、脾細胞移植、骨髓移植、胰島細胞移植、干細胞移植等；組織移植中常見為皮膚移植、血管移植和角膜移植等；器官移植包括腎移植、肝移植、心臟移植、胰腺移植、肺移植和小腸移植等。

移植動物模型中應用的動物主要包括小鼠、大鼠、兔、犬、豬和獼猴、狒狒等非人靈長類動物。這些動物在建立移植動物模型的研究中各有特點，可根據研究目的、經費情況和動物管理的難易程度予以選擇。其中，小鼠已作為移植免疫學研究的首選動物，首先，目前已篩選繁殖出多種遺傳背景良好，且能獲取多種穩(wěn)定轉基因和基因敲除的小鼠，同時小鼠更容易誘導移植免疫耐受；其次，在技術方面，針對小鼠的生物學探針、單克隆抗體和其他實驗試劑的生產和應用遠遠多于其他實驗動物；同時小鼠的價格優(yōu)廉、體積小而且便于實驗操作。大鼠在移植研究中因其體積較大，適合作為需要進行血管吻合、淋巴管吻合以及神經吻合等顯微外科操作的移植模型，相對于小鼠來說更易于操作及掌握；犬科動物是大動物移植模型的首選，已廣泛用于移植實驗外科各個方面，在研究新的移植手術方式等方面更具有優(yōu)勢；豬的器官和血管解剖結構、生理功能和免疫特性與人類相似，體積較大、經濟且易于飼養(yǎng)，也廣泛應用于各種器官移植動物模型實驗中；非人靈長類動物應用于移植研究中的動物包括黑猩猩、大黑猩猩、猩猩、狒狒、獼猴和食蟹猴等，其進化程度高，在生理結構和功能方面與人類最為接近，是各種移植治療、免疫抑制和免疫耐受誘導方案成功應用于臨床的最后一道關鍵實驗環(huán)節(jié)，但因其飼養(yǎng)困難，價格昂貴，常用于移植學發(fā)展的前沿研究，如異種移植研究中嘗試將經過生物工程改造的豬器官首先移植給非人靈長類動物，以期最終可成功移植給人類來解決移植器官短缺的問題。

2 移植實驗動物模型選擇的基本原則

移植實驗動物模型的選擇主要包括供受體組合的選擇和移植器官類型的選擇兩個方面。

2.1 移植模型中動物的選擇：針對不同的實驗目的選用不同的實驗動物。例如嚙齒類動物容易誘導耐受，常用于此類研究；而大動物解剖結構與人體相似，常用于外科技術研究；排斥反應的研究則根據實驗的需要，兩類動物均可以選擇。此外，選用具有強排斥反應的模型，可用于免疫耐受的研究，從而展示處理因素的有效性。選用弱排斥模型，可迅速建立免疫耐受模型，通過加入處理因素而打破耐受，如Matzinger進行危險信號理論研究時，就選用了弱排斥模型[4]。

不同品系的動物，參與移植免疫應答的機制不同，產生免疫應答反應的強弱也不同[5]。以小鼠為例，其誘導免疫耐受的難易程度為：C57BL/6＞BALB/C＞DBA/2＞CBA＞C3H。即使兩種近交系小鼠互為供受者，移植物排斥反應發(fā)生的時間也不同[6]。此外，不同品系的動物可發(fā)生不同的排斥反應，如以C3H小鼠作為供者，分別移植給C57BL/6小鼠（Th1參與為主）和BALB/C小鼠（Th2參與為主），前者引起典型急性細胞性排斥反應，而后者則引起急性血管性排斥反應。如果研究目的是Th1細胞相關細胞因子或CD8+T細胞介導的排斥反應時，應選擇C57BL/6小鼠；如果研究Th2細胞相關細胞因子或CD4+T細胞介導的排斥反應時，則選擇BALB/C小鼠。如進行移植免疫反應機制研究，應分別標明所用動物供受者的不同主要組織相容性復合物（MHC），只有當MHC存在明顯差異時，研究得出的免疫反應抑制或耐受結果才有意義。

2.2 移植模型中移植器官的選擇：不同器官的移植難度不同，這點在小動物模型中尤為明顯，在選擇移植器官類型時應避免片面追求技術難度和檢測指標的“時髦”，這些均是選用移植模型方面的誤區(qū)。移植研究中動物模型選擇的基本原則是：① 只要能充分說明問題，選用的動物模型越簡單越好，觀測指標越簡潔越好。能用皮膚移植就不要選用心臟移植，不要單純?yōu)榱俗非蠹夹g含量或時髦的觀測指標而本末倒置。越來越多的研究證據表明，器官切取、保存以及器官植入過程中對移植物造成的損傷與免疫反應密切相關，損傷引起機體釋放炎癥因子等危險信號[7-9]，可能觸發(fā)免疫應答的始動因子，因而盡可能減少移植物損傷對于獲得良好的實驗結果具有重要意義；② 移植術后產生的感染也會增強特異性免疫反應，影響移植物的存活時間，這點在皮膚移植方面尤為突出。嚴格地說，如果移植模型不是一個潔凈的模型，不宜進行移植免疫反應研究。因此，在無菌操作、熟練掌握移植技術以及減輕損傷和感染的同時，必須建立嚴格的對照，盡量排除可能的污染因素，使其對結果的影響降至最低；③ 誘導免疫耐受的難易程度亦因不同臟器而異，由難到易依次為皮膚、小腸、心臟、胰島、腎臟、肝臟。這與某些免疫學因素有關，如組織特異性抗原和移植物內抗原提呈細胞的含量等，也與移植物本身的解剖結構與生理功能具有一定的聯系[10]。許多成功誘導心臟移植物免疫耐受的方案對同一供者來源的皮膚沒有作用，設計實驗研究應基于上述選擇動物模型的原則。

3 移植實驗動物模型病理學

移植動物模型研究中，為準確分析研究結果，除進行移植物大體肉眼觀察和功能指標檢測外，病理組織學檢查更能反映移植物的真實情況，是結果分析中必不可少的環(huán)節(jié)。

3.1 移植實驗動物模型中病理學研究的作用與內容：病理學觀察是移植實驗動物模型研究中結果分析的最佳手段，應貫穿于所有類型的移植研究中。其基本的研究作用與內容包括：① 觀察移植術式研究中的移植物存活情況，判斷該術式的可行性與安全性；② 在復制的移植排斥反應實驗動物模型中，觀察體液免疫與細胞免疫反應損傷的參與因子，協助排斥反應機制研究；③ 觀察并記錄各種類型排斥反應的組織病理學特點，為排斥反應的診斷提供依據；④ 觀察各種器官保存液的效果與時限，評估其保存損傷；⑤ 研究移植物血管病等慢性排斥反應的機制以及治療策略；⑥ 研究異種移植的可行性及其特殊類型排斥反應的病理學表現等。

3.2 移植實驗動物模型病理學觀察的注意事項：在移植實驗動物病理學觀察中需要注意的基本要點包括：① 在進行各種移植病理學模型觀察之前，應充分了解移植模型的建立思路、實驗目的、手術方法和術后免疫抑制等處理措施及動物存活時間等基本情況，便于有針對性地進行研究；② 熟悉各種移植實驗動物基本的解剖學與組織學結構特點；③ 掌握各種移植模型排斥反應等的病理學變化特征；④ 熟練運用動物解剖、取材、制片等基本技術，以獲得最滿意的實驗動物標本與切片，避免實驗動物研究低于人體病理學診斷從而草率處理標本的觀念，避免人為假象的形成干擾結果判斷；⑤ 對每項實驗課題應建立詳細而全面的實驗病理診斷與報告以及組織學圖像資料；⑥ 對于研究生的移植實驗動物模型研究，應在實驗前應對實驗動物解剖、標本獲取、固定保存、選擇合適的染色以及免疫組織化學染色方法等技術方面進行指導，以期獲得準確的組織學結果；⑦ 移植病理研究者應主動參與移植動物模型的解剖，在解剖過程中可以肉眼直接觀察移植物的改變，為鏡下觀察奠定基礎；⑧ 了解移植學的新進展以及移植病理學的新方法。

3.3 各種移植實驗動物模型的病理學特點

3.3.1 皮膚移植模型：小動物模型中同種皮膚移植常用于免疫預致敏手段，也可以作為實驗動物形成免疫無能后通過脾細胞輸注驗證其細胞免疫功能的恢復情況。其排斥反應主要表現為移植皮膚真皮及表皮鱗狀上皮內淋巴細胞浸潤以及皮膚組織內的血管內皮炎。真皮組織內浸潤的淋巴細胞散在于真皮結締組織內，也可位于毛囊、汗腺周圍以及毛囊與汗腺上皮。鱗狀上皮層內可見淋巴細胞浸潤以及部分上皮細胞壞死。嚴重者可見大部分皮片壞死。其主要的鑒別為感染，后者表現為移植皮片存在大量的中性粒細胞甚至膿細胞的浸潤。

3.3.2 心臟移植模型：小動物同種異體心臟移植模型在移植實驗研究中應用最多[11]。小鼠和大鼠心臟移植的排斥反應組織學表現基本相同，而小鼠移植心臟中可見由于血管吻合不良、狹窄、扭曲等手術技術因素形成的心肌組織廣泛的缺血性梗死，可見大片心肌組織呈缺血性壞死，壞死灶周邊可見明顯的由大量中性粒細胞或膿細胞形成的炎癥反應帶，外圍可殘存少許心肌組織。如果為急性排斥反應，在心肌間質內可見不同數量的淋巴細胞浸潤（圖1），嚴重者可見局部心肌細胞壞死，甚至消失。心臟移植模型中典型的急性排斥反應者可見明顯的心肌內冠狀動脈分支內膜炎及內皮空泡變甚至內膜水腫（圖2），管腔狹窄。對于小鼠或大鼠的異種心臟移植來說，肉眼可見移植心臟明顯腫大，呈暗紅色或紫紅色（圖3），心臟剖面甚至呈暗褐色出血狀。鏡下見心肌間質明顯水腫以及出血，大量中性粒細胞浸潤，大量心肌細胞壞死，靜脈分支或少許動脈分支內可見纖維素樣血栓栓塞。同種心臟移植的慢性排斥反應即冠狀動脈血管病，可見心肌組織內冠脈分支明顯的血膜增生甚至管腔閉塞（圖4）。

圖1 實驗性移植心臟急性排斥反應，圖示移植心臟心肌間質內淋巴細胞浸潤（HE×200）

圖2 移植心臟急性排斥反應的冠狀動脈分支血管內膜炎（HE×200）

圖3 小鼠異種移植心臟大體標本，圖示移植心明顯腫大，呈暗紅色或紫紅色（手術顯微鏡下觀察）

圖4 實驗性心臟移植慢性排斥反應，移植心臟冠狀動脈分支內膜明顯增生（HE×200）

3.3.3 腎移植模型：同種腎移植模型中可見與人體移植腎排斥反應類似的組織學表現，其排斥反應病變以及程度劃分均可以參考人體移植腎的相關特點與標準。在獼猴等靈長類動物的同種腎移植急性排斥反應中，腎組織內出現大量淋巴細胞浸潤、腎小管上皮炎（圖5）以及血管內膜炎，可見腎盂與輸尿管明顯水腫，鏡下可見黏膜移行上皮以及黏膜下組織內明顯的淋巴細胞浸潤，提示腎盂以及輸尿管損傷也是排斥反應的重要方面，而在臨床人體腎移植中，一般對其注意不夠。

實驗研究中也常應用大鼠等動物腎動脈階段性阻斷的方式研究腎臟的缺血和缺血/再灌注損傷機制及其組織學與超微結構的變化?？梢娔I組織中腎小管上皮壞死甚至大片缺血性壞死的現象。

3.3.4 肝移植模型：肝移植模型是最為復雜的一種移植模型，主要用于肝移植的術式研究、肝臟保存后的移植以及肝臟特殊免疫特惠機制的研究等。大動物如豬或犬的肝移植動物模型對于臨床肝移植前手術技術的熟練掌握及肝臟保存液的研究尤其重要，其中豬的肝臟解剖及生理與人體極其相似，已成為臨床肝移植術前必備的實驗模型之一。移植肝的存活時間與手術吻合技術處理的好壞具有很大的聯系，技術不熟練常導致移植肝組織大面積區(qū)域性缺血壞死。而實驗動物移植肝的排斥反應與人體肝移植類似，急性排斥反應主要表現為門管區(qū)炎癥和小葉間膽管的炎性損傷（圖6）；慢性排斥反應呈門管區(qū)小葉間膽管的缺失（圖7）。肝臟也常應用于阻斷血流方法進行缺血和缺血/再灌注損傷以及治療對策的研究，結合其模型可以進行肝細胞凋亡等免疫組織化學染色。

3.3.5 胰腺移植模型：臨床胰腺移植手術技術復雜，大動物的胰腺移植模型研究對于摸索與熟練移植胰腺外分泌胰管的處理技術非常重要。而小動物胰腺移植實驗模型對于在建立糖尿病模型后研究胰腺移植的治療作用、移植胰腺內分泌功能的作用機制以及移植胰腺功能檢測指標等方面具有價值。

大鼠胰腺移植后發(fā)生急性排斥反應時，在胰腺組織間質內出現大量淋巴細胞浸潤以及胰腺導管上皮炎（圖8），同時往往可見外分泌腺泡組織的溶解性壞死。嚴重的急性排斥反應可見血管分支的血管內膜炎。慢性排斥反應時可見胰腺外分泌腺泡組織廣泛纖維化，動脈分支可見典型的移植物動脈血管病。

3.3.6 小腸移植模型：大鼠小腸移植模型中，急性排斥反應時可見移植小腸明顯腫脹，腸壁增厚，小腸黏膜增厚而蒼白。鏡下可見黏膜層明顯水腫，廣泛的黏膜上皮糜爛甚至脫落，黏膜層內有大量淋巴細胞浸潤及隱窩上皮炎。同時黏膜下層、肌層內也可見散在浸潤的淋巴細胞，發(fā)生典型的急性排斥反應時可見腸壁黏膜下層、肌層以及外膜層內動脈血管分支內膜炎。

3.3.7 血管移植模型：在器官移植實驗研究中，血管移植的動物模型不僅可以用于移植免疫學研究[12]，還可以應用于慢性移植物血管病的研究，尤其對于后者來說，血管移植模型是最好的研究途徑。慢性排斥反應導致的慢性移植物失功的主要特征性變化是慢性移植物血管病，設計一個能有效反映其病理變化的模型，對于此類疾病發(fā)病機制的研究具有非常重要的作用[13]。常規(guī)采用Lewis大鼠作為供者，Brown-Norway大鼠作為受者（兩種MHC完全不匹配的近交系大鼠），進行胸腹主動脈移植，這是一種簡化的慢性移植物血管病模型，與以前的模型相比，手術操作更為簡單，基本能反映人類移植物動脈血管病的病理改變，并可以采用多種干預措施進行治療性研究，因此，對于慢性移植物血管病的發(fā)病機制、病理組織學特征以及治療研究都是首選的模型。在這一模型中可見移植物血管在術后早期典型的急性排斥反應所致的動脈內膜炎，還可以觀察到急性排斥反應中參與的免疫細胞類型（圖9）、動脈內膜增生情況以及采取不同的治療措施后對動脈內膜增生即慢性移植物血管病的治療作用。

圖5 移植腎急性排斥反應，圖示腎小管上皮內淋巴細胞浸潤呈腎小管上皮炎（PAS×400）

圖6 大鼠移植肝急性排斥反應，匯管區(qū)內淋巴細胞浸潤以及小葉間膽管上皮炎 （HE×200）

圖7 大鼠移植肝慢性排斥反應，匯管區(qū)內小葉間膽管消失（HE×200）

圖8 大鼠胰腺移植后急性排斥反應，胰腺小葉間導管上皮炎（HE×200）

圖9 移植動脈急性排斥反應的動脈內膜炎，內膜內浸潤的淋巴細胞經免疫細胞化學染色多數為CD8+（免疫組化×200）

移植動物模型實驗研究是移植研究的基礎，貫穿于移植外科術式、器官保存、排斥反應機制、免疫抑制藥物和免疫耐受機制等基礎研究中，而其病理學觀察是判斷移植術式的可行性、器官保存方式的優(yōu)劣和研究移植免疫機制不可缺少的內容。在實施移植動物模型研究及其病理學觀察之前應對動物模型的類型進行劃分、實驗動物的選擇原則等具有充分的了解。因移植動物模型的病理學改變主要以免疫性炎癥病變?yōu)楹诵?，故而在病理學觀察時應把握其病變在不同移植器官和組織中的表現特征而予以準確的診斷和分析。