非轉(zhuǎn)流條件下豬原位肝移植模型的建立及評(píng)價(jià)

楊洋，淮明生，韓俊峰，高偉（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 3009）

豬肝臟移植的開展對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究及臨床肝移植的發(fā)展十分重要。由于肝臟大小及解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，豬肝臟移植模型的建立為我們提供了一個(gè)理想的練習(xí)新外科技術(shù)的平臺(tái)[1-2]。傳統(tǒng)的體外靜脈轉(zhuǎn)流技術(shù)雖減輕了機(jī)體無肝期的血流動(dòng)力學(xué)失衡，但也帶來一些缺點(diǎn)，如血管受損、血栓形成、操作繁瑣等[3-4]。因此，需要建立一種高度標(biāo)準(zhǔn)化、易于復(fù)制、方便操作且具有較好重復(fù)性和穩(wěn)定性的大型動(dòng)物原位肝移植模型。在改進(jìn)手術(shù)技巧和縮短無肝期的基礎(chǔ)上，我們于2015年2月至2015年6月在無靜脈轉(zhuǎn)流條件下建立豬原位肝移植模型，為進(jìn)一步研究積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康巴馬小型豬（由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不限，6～8月齡，體量為15～20 kg，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為供體和受體，于無靜脈轉(zhuǎn)流條件下對(duì)巴馬小型豬27只行原位肝移植術(shù)。術(shù)前禁食24小時(shí)，禁水12小時(shí)。

1.2 術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉：供體采用基礎(chǔ)麻醉方法，經(jīng)臀大肌注射10 mg/kg氯胺酮、0.4 mg/kg地西泮及0.03 mg/kg阿托品，以戊巴比妥鈉30 mg/kg維持。受體在基礎(chǔ)麻醉的基礎(chǔ)上，通過耳緣靜脈建立靜脈通路，給予1 mg/kg氯化琥珀膽堿注射液行麻醉誘導(dǎo)，然后行氣管插管經(jīng)麻醉機(jī)給予間歇正壓通氣，快速吸入體積分?jǐn)?shù)為3%～4%的七氟烷3～5分鐘后，降低七氟烷的吸入體積分?jǐn)?shù)至2%～3%維持麻醉。調(diào)控吸氧體積分?jǐn)?shù)為30%～50%，流量為1 L/min，維持潮氣量（VT）為10 ml/kg，呼吸頻率為16～18次/分，吸呼比為1∶2。間斷靜脈注射0.1 mg/kg維庫溴銨維持肌松。

1.3 供體手術(shù)及供肝修整：麻醉滿意后，將供豬仰臥位固定于恒溫手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒鋪巾后取腹部大十字切口進(jìn)腹，于髂血管分叉處向上游離腹主動(dòng)脈約2 cm處并帶入7號(hào)絲線。游離左右三角韌帶。解剖肝門，游離肝動(dòng)脈、門靜脈及膽總管。游離肝固有動(dòng)脈及肝總動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈，切斷并結(jié)扎胃右動(dòng)脈、胃十二指腸動(dòng)脈及脾動(dòng)靜脈，注意有無變異的肝動(dòng)脈，切斷并結(jié)扎肝十二指腸韌帶和肝胃韌帶的殘余組織。游離門靜脈主干及腸系膜上靜脈近端并帶入7號(hào)絲線。游離膽總管，于近十二指腸處切斷。解剖肝下下腔靜脈至腎靜脈水平，切斷肝后韌帶，于膈下游離腹主動(dòng)脈并帶入7號(hào)絲線。游離完成后輸注3 mg/kg肝素抗凝血，輸注肝素2～3分鐘后將灌注管路分別置入腹主動(dòng)脈和腸系膜上靜脈，快速灌注4℃的乳酸林格液3 000 ml，同時(shí)阻斷膈下腹主動(dòng)脈并剪開膈肌，距膈肌孔上方的2 cm處離斷肝上下腔靜脈，于腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈，肝周用碎冰屑降溫，邊灌注邊調(diào)整肝臟位置并進(jìn)行肝臟按摩，使肝臟各葉均得到充分灌注。乳酸林格液灌注完畢后，繼續(xù)灌注4℃的UW器官保存液1 500 ml，灌注完畢后，切下肝臟置于4℃的UW器官保存液中進(jìn)行修整。修整時(shí)注意保留適當(dāng)?shù)难荛L(zhǎng)度以備吻合，切除膽囊并沖洗膽道，剪除多余膈肌組織。修整完畢后將供肝保存于4℃的UW器官保存液中。

1.4 受體手術(shù)：受體取上腹反“L”形切口入腹以免損傷尿道。游離肝周韌帶及血管，離斷肝動(dòng)脈，以靜脈阻斷鉗分別阻斷門靜脈、肝上及肝下下腔靜脈，緊貼肝臟離斷門靜脈、肝上及肝下下腔靜脈，移出受體肝臟，妥善修整各血管斷端后將供肝置入受體腹腔，以5-0 Prolene線快速吻合供受體的肝上下腔靜脈，吻合同時(shí)經(jīng)門靜脈灌注4℃乳酸林格液以排出供肝內(nèi)殘余的UW器官保存液以及避免供肝溫度過高。然后以6-0 Prolene線吻合門靜脈，注意門靜脈打結(jié)固定時(shí)應(yīng)預(yù)留0.5～1.0 cm“生長(zhǎng)因子”，以防止血管開放后出現(xiàn)狹窄。吻合完畢后門靜脈結(jié)束無肝期，經(jīng)肝下下腔靜脈放血100 ml后夾閉肝下下腔靜脈并開放肝上下腔靜脈，以5-0 Prolene線吻合肝下下腔靜脈并開放。確切止血后分別以8-0 Prolene線及6-0 PDS吻合肝動(dòng)脈及膽總管。再次確認(rèn)無出血后，放置腹腔引流管并關(guān)腹。

1.5 術(shù)中監(jiān)護(hù)與處理：受體豬麻醉后持續(xù)心電監(jiān)護(hù)，經(jīng)右側(cè)頸部切口游離頸內(nèi)靜脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。經(jīng)頸內(nèi)靜脈行三通管插管，以監(jiān)測(cè)術(shù)中中心靜脈壓（CVP）以及作為術(shù)中和術(shù)后給藥和補(bǔ)液的通路，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插管并監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（MAP）和心率。無肝期前加快補(bǔ)液速度，使CVP提高至8～10 cmH2O（1 cmH2O＝0.098 kPa）正常上限水平。無肝期開始前5分鐘靜脈持續(xù)給予多巴胺5～15 μg /（kg·min），進(jìn)入無肝期后繼續(xù)應(yīng)用多巴胺，配合適當(dāng)補(bǔ)液以維持MAP在50～60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）左右，待新肝期血壓穩(wěn)定后逐步減量停用。結(jié)束無肝期時(shí)使用甲潑尼龍10 mg/kg減輕新肝缺血/再灌注損傷，靜脈滴注5%碳酸氫鈉5 ml/kg和10%葡萄糖酸鈣溶液10 ml，以糾正新肝期代謝性酸中毒和高鉀對(duì)心肌的毒性作用。開放門靜脈后經(jīng)肝下下腔靜脈放出血液100 ml，無肝期時(shí)門靜脈內(nèi)積聚了大量高鉀物質(zhì)及酸性代謝產(chǎn)物。

1.6 術(shù)后管理及觀察指標(biāo)：術(shù)后持續(xù)24小時(shí)監(jiān)測(cè)心率、動(dòng)脈血壓及CVP，靜脈輸液8～100 ml/（kg·d），靜脈滴注頭孢呋辛鈉1.5 g/d進(jìn)行抗感染治療3天，術(shù)后48小時(shí)開始進(jìn)食。

主要觀察指標(biāo)：① 供肝冷缺血時(shí)間、無肝期時(shí)間和手術(shù)時(shí)間；② 術(shù)中CVP、平均動(dòng)脈壓、pH值、剩余堿及血清鉀變化；③ 動(dòng)物術(shù)后1天、3天及7天的存活率，解剖死亡動(dòng)物以明確其死亡原因。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0版統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)間差異采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 手術(shù)情況及術(shù)后存活率：27只非轉(zhuǎn)流條件下豬原位肝移植手術(shù)中，供肝平均冷缺血時(shí)間為（125.3±20.4）分鐘，平均無肝期為（20.6±2.3） 分鐘，平均手術(shù)時(shí)間為（178.7±26.3）分鐘。

術(shù)中平均失血量為（236.4±18.82）ml，輸血量均為400 ml。無術(shù)中死亡，術(shù)后1天死亡1只，死亡原因?yàn)榧毙苑嗡[；術(shù)后4天死亡1只，死亡原因?yàn)榉嗡ㄈ?；術(shù)后6天死亡1只，死亡原因?yàn)楦骨桓腥?；其?4只受體豬存活時(shí)間均超過1周。術(shù)后3天和7天的存活率分別96.3%（26/27）和 88.9%（24/27）。

2.2 術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)、動(dòng)脈血?dú)饧吧笜?biāo)變化（表1）：術(shù)中受體豬的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化明顯，與無肝期前相比，無肝期時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心率明顯加快，血清K+顯著升高（P＜0.05），MAP、CVP、pH值及剩余堿則明顯下降 （P＜0.05）。手術(shù)結(jié)束時(shí)，MAP及CVP恢復(fù)，經(jīng)藥物調(diào)整后血清K+水平下降，酸堿度逐漸恢復(fù)。

表1 肝移植術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)、血?dú)饧吧笜?biāo)變化（±s）

表1 肝移植術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)、血?dú)饧吧笜?biāo)變化（±s）

注：與無肝期比較，aP＜0.05

剩余堿（mmol/L）無肝期前 92.00±9.64 94.53±7.87 5.83±0.58 7.40±0.02 4.13±0.37 0.64±2.02無肝期 148.00±7.74a 52.34±5.73a 1.52±0.33a 7.31±0.03a 4.82±0.52a -8.34±3.70a新肝期 140.00±8.29a 78.03±9.51a 3.74±0.42a 7.26±0.05a 5.45±0.55a -4.33±2.67a手術(shù)結(jié)束 123.00±6.71a 88.35±9.18 5.56±0.65 7.38±0.04 4.77±0.41a -1.15±2.05時(shí)段 心率（次/分）MAP（mmHg） （cmH2O） pH值 血清K+（mmol/L）CVP

3 討 論

在肝移植實(shí)驗(yàn)研究中，理想的動(dòng)物模型應(yīng)接近臨床實(shí)際情況，能模擬臨床肝移植的全部過程，同時(shí)應(yīng)易于操作，方便復(fù)制，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。豬肝膽系統(tǒng)的解剖生理與人類非常相似，是研究人類肝移植的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。以往報(bào)道的豬原位肝移植手術(shù)過程復(fù)雜，創(chuàng)傷大、出血多、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、術(shù)后恢復(fù)慢，術(shù)中及術(shù)后早期并發(fā)癥及病死率高，長(zhǎng)期生存者較少[5-6]。因長(zhǎng)時(shí)間麻醉、手術(shù)及體外靜脈轉(zhuǎn)流等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，各實(shí)驗(yàn)對(duì)象之間的可比性和重復(fù)性差。且所用豬體積較大，操作不便，動(dòng)物生長(zhǎng)迅速，肝臟體積、出入肝血管及膽管口徑變化較快，不適于大樣本含量的系列實(shí)驗(yàn)研究。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用標(biāo)準(zhǔn)化程度高，基因純合度和相似系數(shù)高的巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，減少了動(dòng)物間的個(gè)體差異。研究表明在這一生長(zhǎng)發(fā)育階段肝臟的質(zhì)量、體積、出入肝的血管膽管口徑比較恒定，這些均有利于進(jìn)行肝移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]。同時(shí)對(duì)既往豬原位肝移植手術(shù)過程進(jìn)行了一系列改進(jìn)，在非體外靜脈轉(zhuǎn)流條件下行原位肝移植。簡(jiǎn)化了手術(shù)步驟，有效避免了長(zhǎng)時(shí)間麻醉、手術(shù)及體外靜脈轉(zhuǎn)流等因素對(duì)受體全身生理的干擾。本研究中無肝期時(shí)間和手術(shù)時(shí)間顯著縮短，術(shù)中失血量和輸血量顯著減少，而手術(shù)成功率和動(dòng)物存活率則顯著提高。

非轉(zhuǎn)流下原位肝移植手術(shù)的關(guān)鍵是維持無肝期血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定[8]。本模型在非體外靜脈轉(zhuǎn)流條件下建立，無肝期平均動(dòng)脈壓和CVP急劇下降，應(yīng)依靠血管活性藥物，配合適量輸液將動(dòng)脈血壓維持在低水平穩(wěn)定狀態(tài)，避免過多的液體負(fù)荷，肝血流恢復(fù)后，血流動(dòng)力學(xué)即逐漸得到糾正。內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和代謝紊亂的糾正對(duì)于非轉(zhuǎn)流下原位肝移植的成功同樣關(guān)鍵。無肝期肝功能缺失，新肝期初始階段肝功能尚未恢復(fù)，導(dǎo)致酸性代謝產(chǎn)物降解能力大大下降，加之移植肝在灌注后大量酸性代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，因此，肝臟移植期間易發(fā)生較明顯的血生化改變和代謝性酸中毒。應(yīng)盡量縮短無肝期手術(shù)時(shí)間，電解質(zhì)紊亂及代謝性酸中毒的預(yù)防和及時(shí)糾正，是手術(shù)中監(jiān)測(cè)和治療的重要內(nèi)容。門靜脈開放后從肝下下腔靜脈放血100 ml，同時(shí)輸入碳酸氫鈉糾正酸中毒，靜推葡萄糖酸鈣對(duì)抗高鉀，對(duì)糾正電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂十分必要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過技術(shù)改進(jìn)，控制無肝期時(shí)間，并根據(jù)無肝期前后血液動(dòng)力學(xué)波動(dòng)的特點(diǎn)加強(qiáng)圍手術(shù)期的處理，使無肝期的血壓維持在滿意的水平，是取得較高存活率和穩(wěn)定性豬原位肝臟移植模型的關(guān)鍵。