黃酒酒曲中霉菌篩選及其制曲研究

俞劍燊,楊昳津,夏永軍,胡 健,方逸群,艾連中*

(1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;3.上海黃酒工程技術(shù)研究中心,上海 200093)

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黃酒酒曲中霉菌篩選及其制曲研究

俞劍燊1,3,楊昳津2,3,夏永軍2,3,胡 健1,3,方逸群1,3,艾連中2,3*

(1.上海金楓酒業(yè)股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;3.上海黃酒工程技術(shù)研究中心,上海 200093)

摘要：從上海地區(qū)黃酒企業(yè)的主發(fā)酵液、麩皮、生麥曲和自然塊曲中分離出22株霉菌,經(jīng)透明圈平板初篩和制曲實(shí)驗(yàn)復(fù)篩,得到3株高產(chǎn)糖化酶、淀粉酶和蛋白酶的曲霉菌株BR84、BR88和BR100。BR84和BR100菌株混合制曲有最高的酶活力,糖化酶、液化酶和蛋白酶活力分別達(dá)1099.82、80.65、284.44 U/g。以篩選出的曲霉進(jìn)行混合制曲并進(jìn)行黃酒模擬發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)混合制曲發(fā)酵黃酒中還原糖和氨氮的生成速率顯著高于純種制曲的。

關(guān)鍵詞：黃酒;制曲;霉菌；篩選；混合菌種;酶活力

黃酒是以糯米、小米和玉米等谷物為主要原料,經(jīng)過(guò)蒸煮、糖化、發(fā)酵、壓榨、過(guò)濾、煎酒、陳化等工藝而制成的釀造酒[1]。黃酒含有多種氨基酸、維生素、多肽以及活性多糖等活性成分?！耙喳溨魄?用曲釀酒”是中國(guó)黃酒的特色,麥曲在黃酒釀造中有“酒之骨也”的美稱[2]。麥曲質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到黃酒的產(chǎn)量和質(zhì)量,在黃酒發(fā)酵中,麥曲具有復(fù)合糖化粗酶制劑的功能,并且賦予了黃酒獨(dú)特的色、香、味。

麥曲分為自然塊曲和生麥曲,前者采用自然接種發(fā)酵的方式制得,后者是在傳統(tǒng)制曲的基礎(chǔ)上發(fā)展而成,利用熟料接種純種霉菌進(jìn)行培養(yǎng)[3]。自然塊曲網(wǎng)羅了多種微生物,含有豐富的微生物群落和酶系,釀成的酒口味醇厚,香氣較濃,但曲中主要酶類的活性都較低;生麥曲中淀粉酶活性得到了顯著提高,但由于菌種單一,酶系簡(jiǎn)單,釀成的黃酒口味寡淡,雜味較重[4]。霉菌是酒曲中的主要微生物,提供豐富的微生物酶系,主要有:液化酶(也稱α-淀粉酶)、糖化酶(也稱葡萄糖淀粉酶)和蛋白酶[5]。淀粉酶把淀粉質(zhì)原料分解為低分子可發(fā)酵性糖,為酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在為微生物的生長(zhǎng)、繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí),也是黃酒中風(fēng)味物質(zhì)形成的前體。

近年來(lái),黃酒企業(yè)隨著新舊工藝的切換與轉(zhuǎn)變,其在生產(chǎn)上使用的霉菌由于時(shí)間過(guò)久不斷出現(xiàn)退化的現(xiàn)象,因而篩選性能優(yōu)良的霉菌菌株是黃酒生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題。而通過(guò)多菌種混合制曲,有望改善黃酒麥曲的品質(zhì)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1原料主發(fā)酵液、麩皮、生麥曲、自然塊曲，由上海金楓酒業(yè)股份有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基YPD瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。淀粉酶透明圈培養(yǎng)基:可溶性淀粉5 g/L、NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。蛋白酶透明圈培養(yǎng)基:脫脂乳20 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。

1.1.3主要試劑3,5-二硝基水楊酸、福林酚試劑、可溶性淀粉、三氯乙酸、酪氨酸等,均為分析純。

1.1.4主要儀器3-18 K型離心機(jī),德國(guó)Sigma公司; PB-10普及型pH計(jì),德國(guó)Sartorius公司;分光光度計(jì),上海美普達(dá)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1霉菌分離、純化與保藏在收集到的樣品中加入一定量的無(wú)菌生理鹽水，進(jìn)行振蕩,制成10倍至106倍的稀釋液；然后進(jìn)行涂布,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；挑取可疑單菌落，多次純化后接入試管斜面上，于4 ℃下保存。

1.2.2平板透明圈法將經(jīng)分離純化后的霉菌分別點(diǎn)植于產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的平板上,在可溶性淀粉與脫脂乳粉被霉菌分泌的淀粉酶與蛋白酶分解后,對(duì)淀粉酶平板用碘液進(jìn)行顯色,菌落周圍產(chǎn)生透明圈,透明圈直徑越大,表明菌株具有越強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶或蛋白酶的能力。

1.2.3制曲實(shí)驗(yàn)將麩皮與水以1∶1.5的比例進(jìn)行配料,攪拌均勻后在121 ℃下滅菌20 min；在自然冷卻后,以10%的接種量接入由斜面制成的孢子懸浮液,攪拌均勻后置于28 ℃下培養(yǎng)；在培養(yǎng)18～20 h后長(zhǎng)出菌絲時(shí)進(jìn)行第一次搖瓶,之后每隔一段時(shí)間搖瓶一次；待孢子成熟時(shí),培養(yǎng)結(jié)束,全過(guò)程需時(shí)約72 h。提取粗酶液，測(cè)定所制得種曲的糖化酶、液化酶以及酸性蛋白酶的活力。

1.2.4霉菌的分子鑒定根據(jù)參考文獻(xiàn)[6],提取基因組DNA,并用作PCR擴(kuò)增的DNA模板。rDNA-ITS序列擴(kuò)增以及測(cè)序所用的引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[8],由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL): ddH2O 13.0 μL,10×Taq Buffer 2.0 μL,上游引物(20 μmol/L) 0.5 μL,下游引物(20 μmol/L)0.5 μL, Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL, dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/L) 1.0 μL,模板1.0 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.5黃酒的模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)稱取1000 g糯米，浸泡2 d,蒸熟后置于2 L廣口試劑瓶中,加入水700 mL、麥曲100 g、酒母200 mL,拌勻,置于28 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵 4 d，然后再轉(zhuǎn)移至 15 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)酵11 d。在發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣,將發(fā)酵醪液過(guò)濾并離心后取上清液進(jìn)行常規(guī)釀造指標(biāo)的測(cè)定。

1.3分析方法

1.3.1糖化酶活力的測(cè)定 酶活定義:1 g曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液在40 ℃、pH 4.6條件下每分鐘分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖為1個(gè)酶活單位,以U/g表示。具體測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.3.2液化酶活力的測(cè)定采用鈍化法[8]測(cè)定。酶活定義同1.3.1。

1.3.3酸性蛋白酶活力的測(cè)定采用劉穎等[9]的測(cè)定方法。酶活定義:1 g曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液在40 ℃條件下麥面中水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活單位,以U/g表示。

1.3.4酸度的測(cè)定參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662─2008,采用NaOH直接滴定法[10]。

1.3.5還原糖的測(cè)定以3,5-二硝基水楊酸法[11]測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖濃度。

1.3.6乙醇含量的測(cè)定具體參照黃媛媛等[12]的測(cè)定方法。

2結(jié)果與分析

2.1黃酒酒曲中霉菌的分離篩選結(jié)果

從收集到的黃酒酒曲中共分離出22株霉菌,通過(guò)產(chǎn)淀粉酶和產(chǎn)蛋白酶的初篩培養(yǎng)基以透明圈法進(jìn)行初篩,結(jié)果如表1所示。由表1可知：有11株具有產(chǎn)淀粉酶能力的菌株和9株具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株；其中有6株既能產(chǎn)淀粉酶也能產(chǎn)蛋白酶的菌株,分別為BR84、BR86、BR88、BR92、BR97和BR100。

2.2單菌株制曲的酶活力比較

對(duì)初篩得到的6株菌制曲后,提取粗酶液進(jìn)行酶活力的測(cè)定,結(jié)果如圖1所示。相較于BR86、BR92和BR97菌株, BR84、BR88和BR100菌株的糖化酶活力高出了100 U/g,表明由這3個(gè)菌株制得的曲分解淀粉為低分子可發(fā)酵性糖的能力較強(qiáng)。BR97菌株具有最高的酶活力,達(dá)到91.13 U/g,比其他5個(gè)菌株平均高出20 U/g。BR88具有最高的酸性蛋白酶活力,為290 U/g; BR100菌株次之,為242.22 U/g; BR84和BR86菌株的蛋白酶活力較低,分別為53.89和56.67 U/g; 而BR92和BR97的蛋白酶活力很低，分別僅為2.78和5.56 U/g。

經(jīng)過(guò)蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶活力的綜合比較,可知BR84、BR88和BR100三株菌有較為突出的酶活性。其中, BR84具有較高的糖化酶活力,酸性蛋白酶活力一般; BR88具有較強(qiáng)的糖化酶活力和酸性蛋白酶活力,α-淀粉酶活力一般； BR100的糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶活力均較高。為了進(jìn)一步探究混合菌株的制曲效果,選出BR84、BR88和BR100進(jìn)行混合制曲。

注：“+”表示透明圈明顯；“-”表示沒(méi)有透明圈。

2.3混合制曲的酶活力比較

對(duì)BR84、BR88和BR100進(jìn)行兩兩組合混合制曲,酶活力比較結(jié)果如圖2?？芍?混合菌株制曲的蛋白酶和淀粉酶活力較單菌株制曲均有了顯著的提高。其中BR100和BR84+BR100兩組麥曲具有較為突出的糖化酶活力,分別為1023.87和1099.82 U/g，明顯高于BR84、BR88、BR84+88、BR88+BR100的糖化酶活力,為720～890 U/g。BR84+BR100組麥曲具有最高的α-淀粉酶活力,為80.65 U/g；其余5組菌株制曲的α-淀粉酶活力則較為相近。BR84+BR100組麥曲亦具有最高的酸性蛋白酶活力,為284.44 U/g; BR84和BR84+BR88次之,均為201.11 U/g; BR88+BR100組麥曲的酶活力最低,僅為54.4 U/g。

綜上所述, BR84+BR100組麥曲具有較為突出的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力,故以該組菌株組合制曲后進(jìn)行黃酒模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn),探究組合制曲對(duì)黃酒釀造結(jié)果(酒度、酸度、還原糖和氨氮含量)的影響。

2.4分子鑒定結(jié)果

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用,核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)也被廣泛地應(yīng)用于真菌的分類與鑒定。對(duì)篩選結(jié)束后得到的BR84、BR88和BR100菌株進(jìn)行基因組DNA的提取,使用引物ITS1/ITS4對(duì)上述3株菌進(jìn)行擴(kuò)增,電泳圖譜如圖3所示。其中BR100菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較BR84和BR88菌株的高,3株菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為600 bp,與ITS目標(biāo)序列的長(zhǎng)度一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,利用序列BLAST搜索NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù),獲取與其同源的其它酵母菌株的ITS序列,確定BR84為黃曲霉(Aspergillusflavus), BR88為米曲霉(Aspergillusoryzae), BR100為黃曲霉(Aspergillusflavus)。

2.5黃酒模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在混合制曲與工廠菌株制曲后進(jìn)行黃酒模擬實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)如表2。由表2可以看出：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),黃酒的酒度、酸度和氨氮含量均逐漸增加,還原糖含量則逐漸降低；在發(fā)酵結(jié)束后,兩組黃酒的酒度并沒(méi)有顯著性差異；還原糖含量在發(fā)酵初期迅速降低，爾后表現(xiàn)為緩慢減少。BR84和BR100混合制曲發(fā)酵得到的黃酒,其酸度含量在發(fā)酵全程中均比工廠菌株高出3%～9%,氨氮含量則高出38%～95%。在發(fā)酵1 d后,混合制曲組的還原糖含量為158 g/L,而工廠菌株組為124 g/L,前者比后者高出了27.42%,這主要是由于混合菌株制曲的淀粉酶系活力明顯高于工廠菌株制曲的酶系活力。在黃酒釀造過(guò)程中呈典型的邊糖化邊發(fā)酵的“雙邊發(fā)酵”,發(fā)酵初期是酵母菌生長(zhǎng)代謝最為活躍的時(shí)期；高糖化力的混合制曲組黃酒在發(fā)酵初期酵母菌對(duì)底物利用較為充分,因此有較高的酒度、酸度和氨氮含量。

3結(jié)語(yǔ)

麥曲是傳統(tǒng)黃酒糖化發(fā)酵的重要物質(zhì)基礎(chǔ),也是奠定黃酒風(fēng)格的重要保障。其中含有豐富的微生物及酶系,對(duì)黃酒發(fā)酵的質(zhì)量和黃酒的風(fēng)味都起到舉足輕重的作用。從黃酒的發(fā)酵液、麩皮、小麥、生麥曲和自然塊曲中分離曲霉等主要糖化菌,通過(guò)純種制曲和混合菌種制曲并測(cè)定酶活力，進(jìn)行篩選后進(jìn)行了黃酒模擬小試試驗(yàn)。結(jié)果表明,混合菌種制曲,既能保持黃酒既有的工藝特色,又能提高原料的利用率,增加營(yíng)養(yǎng),可用于黃酒釀造的規(guī)?；a(chǎn)。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Studies on Screening of Mycetes from Koji for Chinese Rice Wine and Koji-making

YU Jian-shen1,3, YANG Yi-jin2,3, XIA Yong-jun2,3, HU Jian1,3, FANG Yi-qun1,3, AI Lian-zhong2,3*

(1. Shanghai Jinfeng Wine Limited Company, Shanghai 200120, China; 2. College of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Engineering Research Center of Chinese Rice Wine, Shanghai 200093, China)

Abstract：Twenty two strains were isolated from the main fermentation broth, bran, raw wheat koji and natural koji, three strains of mycetes named BR84, BR88 and BR100 which had high activity of amylase and protease were selected by the method of transparent circle and koji-making from Shanghai Jinfeng Wine Limited Company. The enzyme activities of the kojis made by mixed strains were measured and the koji made by BR84 and BR100 strains had the highest enzyme activity, saccharifying enzyme, liquefied and protease enzyme activity were 1099.82, 80.65, 284.44 U/g, respectively. Found that the formation rate of reducing sugar and ammoniacal nitrogen were significantly higher than that of pure starter-making.

Key words：Chinese rice wine; Koji making; Mycete; Screening; Mixed-strains; Enzyme activity

收稿日期：2015-10-27

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(133919N1000);上海理工大學(xué)橫向項(xiàng)目(js-010-zx004);上海市研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(JWCXSL1402)。

作者簡(jiǎn)介：俞劍燊(1974─),男,江蘇無(wú)錫人,高級(jí)工程師,碩士,從事釀造微生物選育研究工作。*通訊作者：艾連中。

中圖分類號(hào)：TQ925.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)05-0079-04