微載體培養(yǎng)技術(shù)在豬用病毒性疫苗研制中的應(yīng)用進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，馬力，李峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

微載體培養(yǎng)技術(shù)在豬用病毒性疫苗研制中的應(yīng)用進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，馬力，李峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

微載體培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)下疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。文章綜述了微載體培養(yǎng)技術(shù)在豬用病毒性疫苗中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為獸醫(yī)科技工作者和廣大養(yǎng)殖業(yè)主更好地了解該技術(shù)及通過該技術(shù)制備豬用疫苗，也為合理應(yīng)用疫苗及有效地預(yù)防和控制疾病提供參考。

微載體；生物反應(yīng)器；疫苗；應(yīng)用進(jìn)展

微載體（Microcarrier）是指在細(xì)胞培養(yǎng)中使用的直徑為60～250 μm的一類無毒性、非剛性、密度均一、透明可懸浮的微球顆粒[1]。其能使貼壁依賴性的細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下貼附在表面呈單層生長(zhǎng)，這極大地?cái)U(kuò)增了細(xì)胞貼附面積，可以在較短時(shí)間內(nèi)得到大量的細(xì)胞，更利于大規(guī)模培養(yǎng)和收集細(xì)胞。1967年荷蘭學(xué)者Van率先開發(fā)了微載體系統(tǒng)，創(chuàng)建了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入了高密度培養(yǎng)階段[2]。2008年，我國(guó)將動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)病毒性疫苗列為“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目，以推動(dòng)實(shí)現(xiàn)疫苗生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的革新和升級(jí)[3]。農(nóng)業(yè)部自2012年2月1日起，已停止受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥GMP驗(yàn)收申請(qǐng)[4]。由于應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體培養(yǎng)技術(shù)具有高比表面積、細(xì)胞產(chǎn)量高，便于監(jiān)測(cè)、控制和取樣，生產(chǎn)規(guī)模易于放大，不易染菌等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可減少勞動(dòng)力，提高生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模自動(dòng)化生產(chǎn)，因此，該技術(shù)無論在人用還是獸用疫苗領(lǐng)域均得到了飛速發(fā)展。

1 微載體培養(yǎng)技術(shù)

貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上進(jìn)行增殖的培養(yǎng)方法，適用于一切貼壁細(xì)胞。在實(shí)際生產(chǎn)中具有貼壁生長(zhǎng)特性的細(xì)胞種類較多，如CHO細(xì)胞、ST細(xì)胞和Vero細(xì)胞等[5]。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法包括方瓶、轉(zhuǎn)瓶、多層平板培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)等。方瓶、轉(zhuǎn)瓶和多層平板培養(yǎng)在產(chǎn)品研發(fā)的中、早期使用比較普遍。但是由于其不能有效監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，操作比較繁瑣，貼附面積具有限制性，傳質(zhì)和傳氧差，每一瓶都是一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，其細(xì)胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度均不同，導(dǎo)致疫苗批次間差異大、操作勞動(dòng)強(qiáng)度高，隱性污染也會(huì)引起高內(nèi)毒素等，在大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)使用中受到很大的限制。而微載體培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)徹底克服了傳統(tǒng)工藝表面積不足的限制，能在有限的空間內(nèi)提供巨大的表面積，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)操作的自動(dòng)化控制，降低了污染的機(jī)會(huì)，減少了人力的投入，并且細(xì)胞在良好的生理狀態(tài)下生長(zhǎng)，可以獲得高密度貼壁細(xì)胞，具有現(xiàn)代化大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的顯著優(yōu)勢(shì)。微載體培養(yǎng)技術(shù)自誕生起經(jīng)過近50年的研究改進(jìn)，目前已日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程領(lǐng)域的生產(chǎn)和科研，生產(chǎn)具有重要商業(yè)價(jià)值和實(shí)用意義的細(xì)胞產(chǎn)品及生物制品，如白蛋白、病毒疫苗和基因工程產(chǎn)品等。

微載體培養(yǎng)技術(shù)中所采用的微載體通常是直徑為60～250 μm的固體小珠[6]。微載體材料按其來源可分為兩大類：人工合成聚合物和天然聚合物及其衍生物[7]。早期微載體多采用人工合成聚合物，如聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。這種微載體重復(fù)性和力學(xué)性能可以達(dá)到較高水平，但缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，影響細(xì)胞在其表面的黏附、生長(zhǎng)。近年來，越來越多的研究者嘗試用天然聚合物及其衍生物來制備微載體。天然聚合物來源豐富，在功能適應(yīng)性、組織相容性、理化性能、生物降解性、造價(jià)等方面優(yōu)于人工合成材料，兼?zhèn)洳牧蠈W(xué)和生物學(xué)的特性。在用于制備微載體的天然聚合物中，研究較多的主要有明膠、膠原、纖維素、甲殼質(zhì)及其衍生物以及海藻酸鹽[8]。微載體根據(jù)物理學(xué)特性主要分為固體微載體和液體微載體兩類，以前者為常見，又可分為實(shí)心微載體和大孔/多孔微載體。目前適用于微載體系統(tǒng)的生物反應(yīng)器有生產(chǎn)型、中試型和實(shí)驗(yàn)型。國(guó)內(nèi)外相繼研制了數(shù)種適合進(jìn)行微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)及灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)等。

2 微載體培養(yǎng)技術(shù)在豬用疫苗研制中的應(yīng)用

2.1 豬瘟

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。豬瘟的防制歷來是全世界豬瘟存在國(guó)非常重視的課題，為此各國(guó)都投入了大量的人力、物力，并取得了很大的成績(jī)。疫苗接種是控制豬瘟的重要手段。王延輝等（2010）[9]利用有限稀釋法從現(xiàn)有ST細(xì)胞系中克隆出一株對(duì)CSFV疫苗株具有高敏感性的克隆細(xì)胞株STK，并且初步研究了該克隆株對(duì)病毒增殖的穩(wěn)定性。將該克隆株用微載體培養(yǎng)后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示該克隆株對(duì)CSFV疫苗株的增殖具有明顯的優(yōu)勢(shì)，病毒滴度可達(dá)107.0TCID50/mL。為CSFV傳代細(xì)胞疫苗的開發(fā)提供了基本保障。漆世華等（2013）[10]采用生物反應(yīng)器微載體技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)豬瘟疫苗，微載體的使用密度為2～25 g/L，采用批式、流加或灌注培養(yǎng)的方式生產(chǎn)的病毒液效價(jià)高，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶工藝相比，收獲的病毒液滴度增加了5～10倍，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定，不存在安全性問題。

2.2 豬偽狂犬病

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的豬的急性傳染病。該病在豬群中呈暴發(fā)性流行。引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，公豬不育，新生仔豬的大量死亡，肥育豬呼吸困難、生長(zhǎng)停滯等，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。張智明等（2012）[11]建立了應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)PRV的方法，細(xì)胞活力≥90%、活細(xì)胞密度≥1×107cells/mL，病毒液TCID50≥108.0。其生產(chǎn)過程銜接緊密、順暢，規(guī)模放大容易，生產(chǎn)周期短，占用場(chǎng)地小，環(huán)境污染少且易于處理，病毒液收獲方便，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定，可顯著降低生產(chǎn)成本、提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。

2.3 豬細(xì)小病毒病

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎兒死亡、重吸收、流產(chǎn)、木乃伊胎等，但母豬不表現(xiàn)明顯的癥狀。近年來，PPV強(qiáng)毒株的出現(xiàn)使得此病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率急劇增加，且范圍在不斷擴(kuò)大。目前，豬細(xì)小病毒病的預(yù)防方式主要以接種滅活疫苗為主。高效的滅活疫苗和佐劑能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生大量的病毒中和抗體。這些抗體能有效預(yù)防野毒株的感染。目前，大多疫苗生產(chǎn)企業(yè)仍采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)模式進(jìn)行病毒生產(chǎn)，存在批次間差異大、占地面積多、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)。李智力等（2015）[12]通過對(duì)PPV感染時(shí)間（Time of infection,TOI）、感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection,MOI）和收毒時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了基于PK-15細(xì)胞反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)的工藝，在5 L反應(yīng)器上最大病毒滴度達(dá)到107.2TCID50/mL。PPV在PK-15細(xì)胞增殖的過程中，因PPV對(duì)溫度敏感，當(dāng)病毒滴度達(dá)到最大值后不能維持，而是持續(xù)下降，因此確定合適的收毒時(shí)間對(duì)PPV生產(chǎn)至關(guān)重要。通過研究PK-15細(xì)胞接種PPV后胞外代謝特性，首次發(fā)現(xiàn)乳酸對(duì)葡萄糖得率與病毒滴度的正相關(guān)性，當(dāng)PPV滴度處于最大值時(shí)，乳酸對(duì)葡萄糖得率也達(dá)到最大值，并從能量和代謝的角度予以闡述，這將為PPV以及其他病毒收毒時(shí)間的確定提供重要依據(jù)。

2.4 豬流行性乙型腦炎

豬流行性乙型腦炎又名日本乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一種急性人獸共患傳染病。豬主要特征為高熱、流產(chǎn)、死胎和公豬睪丸炎。劉漢平等（2011）[13]、岳雷等（2013）[14]先后建立了利用微載體系統(tǒng)和生物反應(yīng)器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，使傳統(tǒng)病毒滴度提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質(zhì)量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

2.5 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床癥狀的高度接觸傳染性腸道疾病，尤其對(duì)2周齡以內(nèi)的仔豬具有很高的致死率，死亡率可達(dá)100%。該病呈世界性分布，是現(xiàn)今引起仔豬發(fā)病和死亡的主要原因之一，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于TGEV仍缺乏有效的臨床治療藥物，采用疫苗免疫接種是主要的預(yù)防措施。鄒勇等（2005）[15]系統(tǒng)地研究了微載體工藝生產(chǎn)TGEV的條件。ST最佳細(xì)胞生長(zhǎng)條件為低糖DMEM生長(zhǎng)液、4.5×104cells/mL細(xì)胞接種密度和5 mg/mL微載體濃度，TGEV最佳生產(chǎn)條件為含0.2%LH的低糖DMEM、5.5 lgTCID50/0.2 mL接種劑量和細(xì)胞生長(zhǎng)第3天為接種時(shí)間。按此最佳條件在5 L反應(yīng)器中生產(chǎn)的TGEV效價(jià)為11.0 lgTCID50/0.2 mL，比方瓶工藝高兩個(gè)滴度。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，微載體工藝生產(chǎn)的TGEV稀釋10倍后免疫效果與方瓶工藝一致。周燕等（2005）[16]通過孔板培養(yǎng)系統(tǒng)以及微載體和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)，研究了MOI、TOI和病毒維持液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和TGEV增殖的影響。結(jié)果表明，MOI影響細(xì)胞生長(zhǎng)速率和單位細(xì)胞病毒產(chǎn)量，TOI影響細(xì)胞對(duì)病毒的敏感程度以及胞內(nèi)病毒的增殖速率；豐富的維生素、氨基酸等物質(zhì)有利于病毒效價(jià)的提高；采用微載體和生物反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)TGEV，病毒效價(jià)可達(dá)11.3 lgTCID50/0.2 mL，比方瓶培養(yǎng)系統(tǒng)提高約100倍。邱文英等[17]（2013）為了大規(guī)模生產(chǎn)TGEV抗原，采用生物反應(yīng)器及微載體進(jìn)行ST細(xì)胞的培養(yǎng)，待微載體上的ST細(xì)胞長(zhǎng)滿至單層后接種TGEV。共使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)3批TGEV抗原，每批培養(yǎng)過程中分別調(diào)節(jié)初始細(xì)胞密度至2.14×106個(gè)/mL、1.83×106個(gè)/mL和2.02×106個(gè)/mL，微載體濃度為3 g/L、6 g/L和9 g/L。結(jié)果表明應(yīng)用生物反應(yīng)器及微載體培養(yǎng)得到抗原的病毒含量均達(dá)到108.0TCID50/mL，明顯高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒含量。何錫忠等（2014）[18]通過生物反應(yīng)器制備TGEV，研究了微載體濃度、MOI、TOI和病毒維持液對(duì)病毒效價(jià)的影響，結(jié)果表明，分別以1∶500稀釋種毒（8.0 lgTCID50/mL）后接種、接種72 h的ST細(xì)胞、5 mg/mL微載體濃度和維持液低糖DMEM＋0.2% LH的參數(shù)培養(yǎng)方式效果最為理想。

2.6 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diahorrea virus,PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的一種腸道傳染病。該病常導(dǎo)致10日齡以內(nèi)仔豬100%的死亡率，為世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)目前重要的腹瀉疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是目前預(yù)防該病最好的措施。王建超等（2003和2004）[19-20]通過研究攪拌速度、pH、血清濃度等環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞貼壁的影響以及細(xì)胞接種密度、微載體濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，對(duì)應(yīng)用微載體技術(shù)和生物反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)PEDV的可行性進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，攪拌轉(zhuǎn)速、pH、血清濃度均對(duì)Vero細(xì)胞在CT-3微載體上的貼壁率和均勻分布有影響；當(dāng)接種密度為15.0×104/mL時(shí)，即每1 mg微載體接種5.0×104細(xì)胞時(shí)，可以獲得較高的細(xì)胞密度；隨著微載體濃度的提高，最高細(xì)胞密度也增加；在CelliGen反應(yīng)器中，采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件，細(xì)胞密度可達(dá)到174.0×104/mL，是方瓶培養(yǎng)的3.5倍，每個(gè)細(xì)胞的PEDV含量與方瓶培養(yǎng)相當(dāng)，制備的疫苗免疫原性好。為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)PEDV疫苗提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。姜艷平等（2015）[21]為了探索PEDV在微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞上的增殖效果，采用2 L生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞和PEDV繁殖，并摸索細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖的最佳條件，檢測(cè)病毒滴度，與方瓶培養(yǎng)的病毒滴度進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，當(dāng)微載體為5 g，種子細(xì)胞數(shù)約3.05×107個(gè)，采用灌注式培養(yǎng)，Vero細(xì)胞經(jīng)72 h長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞數(shù)約為3.02×109個(gè)，此時(shí)用滴度為104.45TCID50/mL的PEDV 1 mL感染Vero細(xì)胞，培養(yǎng)96 h，微載體上80%細(xì)胞脫落時(shí)收毒，培養(yǎng)的PEDV具有較高的病毒滴度。相同病毒在微載體系統(tǒng)與方瓶上進(jìn)行同步傳代，經(jīng)檢測(cè)病毒滴度均有提高，但在微載體系統(tǒng)上培養(yǎng)的PEDV最高滴度可達(dá)到106.05TCID50/mL，明顯高于方瓶培養(yǎng)。這為研究PEDV能更好適應(yīng)Vero細(xì)胞，提高PEDV產(chǎn)量提供技術(shù)支持。

2.7 豬藍(lán)耳病

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的主要方法是使用疫苗進(jìn)行免疫防控，而提高病毒增殖滴度是疫苗生產(chǎn)的一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。Marc-145細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)室中用于PRRSV增殖的細(xì)胞宿主，同時(shí)也是目前豬藍(lán)耳病疫苗的生產(chǎn)用細(xì)胞株。生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞及PRRSV增殖技術(shù)整個(gè)生物過程控制精確，易于重復(fù)，保證了疫苗產(chǎn)品批次間質(zhì)量的一致性，并具備了規(guī)模放大的可能性。穆光慧等（2010）[22]通過研究攪拌程序、細(xì)胞接種密度、微載體濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，探索Marc-145細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)條件。結(jié)果表明，細(xì)胞接種密度為4.28×105cells/mL時(shí)，病毒滴度可達(dá)到107.5TCID50/mL，表明利用微載體增殖PRRSV是可行的。梅建國(guó)等（2012）[23]應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞生產(chǎn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV），并通過工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了病毒抗原的高效生產(chǎn)。馮磊等（2012）[24]采用分批式培養(yǎng)方法研究了Marc-145細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)及PRRSV增殖工藝。結(jié)果表明，在3 g/L的微載體用量下，采用3×105cells/mL的初始接種密度及培養(yǎng)至第3天進(jìn)行換液操作工藝可以獲得最佳的Marc-145細(xì)胞生長(zhǎng)效能。采用MOI為0.05的接毒比例及接毒后48 h收獲毒液可獲得最高的PRRSV增殖效價(jià)。在5 L反應(yīng)器中重復(fù)驗(yàn)證上述工藝，獲得較為穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果，最大細(xì)胞密度均可高于2×106cells/mL，PRRSV的增殖效價(jià)均高于108.0TCID50/mL。為PRRSV疫苗的生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。楊雷等（2013）[25]研究表明，用生物反應(yīng)器微載體灌注培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞制備PRRS疫苗工藝可行，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，有較好的應(yīng)用前景。喬自林等（2014）[26]建立了微載體培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞增殖PRRSV的多次收毒工藝，在微載體培養(yǎng)條件下Marc-145細(xì)胞增殖PRRSV時(shí)多次收毒方式所獲符合標(biāo)準(zhǔn)的病毒液是正常收毒方式的兩倍以上，提高了微載體和種子細(xì)胞的利用率，降低疫苗的生產(chǎn)成本。

2.8 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）為代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周齡的仔豬。PCV2的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病因之一。PCV2感染可以導(dǎo)致動(dòng)物免疫抑制，從而增強(qiáng)對(duì)其他多種病原體的易感性，使病情更加復(fù)雜化。目前疫苗免疫仍是控制PCV2感染引起相關(guān)疾病的重要手段。在疫苗的研制中，病毒抗原含量對(duì)免疫效果影響較大。由于PCV2在細(xì)胞中不產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），體外增殖能力差，增殖滴度不高，因此篩選高滴度病毒株和提高PCV2在細(xì)胞中的增殖滴度是PCV2疫苗研究的關(guān)鍵。何錫忠（2009和2010）[27-28]研究了反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶、方瓶不同培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)PCV2，對(duì)轉(zhuǎn)瓶不同參數(shù)下的病毒效價(jià)情況進(jìn)行優(yōu)化比較，最終參數(shù)分別以1∶10稀釋種毒后接種、接種24 h的PK-15細(xì)胞、5～7 mg/mL微載體濃度和維持液低糖DMEM+0.2%水解乳蛋白（LH）的培養(yǎng)方式效果最為理想。高金良（2013）[29]為了克服PCV2體外繁殖能力差、增殖滴度低的缺點(diǎn)，利用微載體貼壁細(xì)胞具有高比表面積，細(xì)胞產(chǎn)量高、便于監(jiān)測(cè)、控制和取樣，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易污染等優(yōu)點(diǎn)，初步探討利用轉(zhuǎn)管微載體培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2。結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)管培養(yǎng)PK-15細(xì)胞數(shù)是普通方瓶培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的10倍左右，接毒120.8MOI組在接毒后100 h時(shí)病毒含量達(dá)到最高5.53E+06 copies/μL，可以提高病毒滴度1.65倍左右。表明利用微載體培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2是可行的，為提高病毒增殖滴度和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效價(jià)疫苗抗原提供了技術(shù)依據(jù)。喬云龍等（2014）[30]建立了利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)PCV2滅活疫苗的方法，通過對(duì)微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有效提升了PCV2滅活疫苗的生產(chǎn)效率以及免疫保護(hù)效力。楊霞等（2015）[31]為提高PCV2的增殖規(guī)模及單位體積內(nèi)的病毒滴度，利用轉(zhuǎn)管微型反應(yīng)器，采用熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)PCV2在PK-15細(xì)胞中復(fù)制特性和增殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)管（內(nèi)置0.6 g紙片載體）中接種約2.98×107個(gè)PK-15細(xì)胞，培養(yǎng)7 d細(xì)胞增至1.93×108～2.0×108個(gè)，并確定培養(yǎng)7 d時(shí)為最佳接毒時(shí)間；病毒的最佳接種劑量為120.8 MOI，最佳收毒時(shí)間為接毒后的100 h。細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)與糖耗間呈明顯平行關(guān)系，在細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)（168 h）平均每個(gè)細(xì)胞耗糖量為3.09×10-8g/24 h，可以根據(jù)糖耗量的多少推測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和數(shù)量。相同培養(yǎng)液中利用轉(zhuǎn)管微型反應(yīng)器培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2最終獲得的病毒液毒價(jià)比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)毒價(jià)提高1.65倍。本研究為PCV2在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)提供了參考依據(jù)。

3 存在的問題與展望

由于微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，其與生物反應(yīng)器相結(jié)合進(jìn)行培養(yǎng)具有系統(tǒng)化、自動(dòng)化的可操作系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)外研究人員在微載體的研究與制備方面做了大量工作，因此隨著科研方法的不斷改進(jìn)，微載體系統(tǒng)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)必將有更為廣闊的應(yīng)用前景。但微載體系統(tǒng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)還存在一定的限制因素[32]。如微載體雖在某些方面進(jìn)行了改善，但總體上還不能很好地同時(shí)滿足操作簡(jiǎn)便、系統(tǒng)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)合理、生物相容性好以及對(duì)細(xì)胞的機(jī)械保護(hù)等諸多要求；在培養(yǎng)過程中，人們往往忽略了微載體對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)作用，不能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過程的階段性調(diào)控；現(xiàn)有的生物反應(yīng)器系統(tǒng)不能同時(shí)滿足規(guī)?；?、剪切力小及混合性能好等特點(diǎn)。相信隨著科研人員對(duì)微載體材料進(jìn)行表面改性來調(diào)節(jié)其力學(xué)和生物降解性能，將生物力學(xué)和材料科學(xué)的相關(guān)成果移植于細(xì)胞工程領(lǐng)域，必將實(shí)現(xiàn)微載體技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)的仿生化、自動(dòng)化和精巧化水平，推進(jìn)該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝技術(shù)的革新是我國(guó)獸用生物制品行業(yè)升級(jí)換代的必然趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在走向全懸浮培養(yǎng)的終極階段，微載體培養(yǎng)技術(shù)必將在漫長(zhǎng)的過渡階段為提高我國(guó)疫苗質(zhì)量、有效地發(fā)揮疫苗在我國(guó)防控政策中的基礎(chǔ)性作用，從而對(duì)推動(dòng)我國(guó)從疫苗生產(chǎn)大國(guó)走向疫苗生產(chǎn)強(qiáng)國(guó)等方面起著重要的示范作用和社會(huì)意義。

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（編輯：富春妮）

新一屆全國(guó)動(dòng)物防疫智庫組成

為深入貫徹中辦、國(guó)辦《關(guān)于加強(qiáng)中國(guó)特色新型智庫建設(shè)的意見》精神和農(nóng)業(yè)部關(guān)于加強(qiáng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展新型智庫建設(shè)的要求，進(jìn)一步發(fā)揮委員會(huì)作用，提升動(dòng)物科學(xué)決策水平，1月8日，第二屆全國(guó)動(dòng)物防疫專家委員會(huì)在北京宣布成立。

2009年，農(nóng)業(yè)部成立第一屆全國(guó)動(dòng)物防疫專家委員會(huì)，這是我國(guó)動(dòng)物防疫智庫的雛形。本屆全國(guó)動(dòng)物防疫專家委員會(huì)選聘了夏咸柱等65名同志為委員會(huì)委員，其中包括8名院士。專家成員中除了獸醫(yī)專業(yè)領(lǐng)域外，還涵蓋了經(jīng)濟(jì)、科技、質(zhì)檢、林業(yè)和公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。本屆專家委員會(huì)分設(shè)動(dòng)物傳染病、獸醫(yī)公共衛(wèi)生、獸醫(yī)流行病學(xué)、外來動(dòng)物疫病、動(dòng)物流感、口蹄疫和血吸蟲病7個(gè)專家組。

出席成立大會(huì)的農(nóng)業(yè)部副部長(zhǎng)于康震強(qiáng)調(diào)，成立專家委員會(huì)是保障“十三五”現(xiàn)代畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要，動(dòng)物防疫專家委員會(huì)要當(dāng)好防控決策的智囊團(tuán)，要成為獸醫(yī)理論創(chuàng)新的思想庫，引領(lǐng)國(guó)際獸醫(yī)工作的風(fēng)向標(biāo)，是解釋宣傳防疫政策的專家團(tuán)。在推進(jìn)動(dòng)物防疫工作過程中，有一些重大問題需要進(jìn)行深入系統(tǒng)研究，諸如動(dòng)物防疫法律法規(guī)問題，動(dòng)物防疫體制機(jī)制問題，動(dòng)物防疫隊(duì)伍能力問題，以及獸醫(yī)技術(shù)與管理創(chuàng)新問題。新一屆專家委員會(huì)要圍繞“十三五”獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展的目標(biāo)任務(wù)梳理問題、提出對(duì)策。

（轉(zhuǎn)自中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào)[N]，2016-01-10）

Progress on Application of Microcarrier Culture Technology in Viral Vaccine of Swine

ZHUANG Jinqiu,MEI Jianguo,MA Li,LI Feng,SHEN Zhiqiang
(Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,China)

Microcarrier culture technology is the key technology in the production of vaccines.It reviews the progress on application of the technology in viral vaccine of swine,in order for veterinary science and technology workers and the vast majority of aquaculture owners better understanding of the technology and prepared by the technique of swine vaccine so as to provide references for rational use of vaccine and effective prevention and control of the disease.

microcarrier;bioreactor;vaccine;progress on application

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0124-05

2016-03-03

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，副研究員，碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制工作. E-mail:zhuangjinqiu2003@163.com

沈志強(qiáng)，研究員，博士.E-mail:bzshengzq@163.com