高效液相色譜法檢測食品中大豆蛋白方法研究

□ 潘仲樂　黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

高效液相色譜法檢測食品中大豆蛋白方法研究

□ 潘仲樂黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

大豆是我國傳統(tǒng)食物,在許多東南亞國家的飲食結構中占有十分重要的地位。近些年,隨著對大豆食品的深入研究，大豆異蛋白保健功能越來越受到大家關注。大豆蛋白的組成成分與牛奶蛋白質(zhì)有一定的相似。而其在營養(yǎng)價值方面，甚至可以和動物蛋白等同，在基因結構上最接近人體氨基酸，所以是最具營養(yǎng)的植物蛋白質(zhì)。因此，本文通過高效液相色譜法來研究大豆中的蛋白質(zhì)。

因為大豆蛋白中隱藏著外啡肽的片段，就使大豆肽食品中可能含有外啡肽，所以對大豆肽食品進行外啡肽的檢測十分有必要。采取高效液相色譜這種方法，以酪啡肽為標準進行了流動相的選擇、柱壓和靈敏度等條件的研究和探索，得出的檢測結果是波長為220 nm，柱溫為25℃。與標準品對照保留時間和面積，得出酸性蛋白酶中含有目標外啡肽。

高效液相色譜法的基本概述

高效液相色譜法又可以叫做高分離度液相色譜、高速液相色譜、高壓液相色譜等。它就是在生物化學和分析高級的化學中經(jīng)常用到的柱狀分析儀器。而高效液相色譜是色譜法中一個非常重要的分支，將液體作為流動的相，運用高溫高壓的輸液系統(tǒng)，將具有極性不同的不混合溶劑或者比例不一樣的混合溶劑都一起泵入裝固定相的色譜柱內(nèi)。等到色譜柱里各種成分被分離完畢之后，再運用檢測器對其進行細致的檢測，以此來達到對試樣的具體分析。這種方法可以既有效又方便地從醫(yī)學、化學、工業(yè)學、農(nóng)業(yè)學和法檢等許多學科中得出科學研究需要的數(shù)據(jù)材料，這種方法已經(jīng)成為我國重要的分離和分析技術手段。

食品中大豆蛋白的檢測材料與方法

實驗材料準備

實驗中所需要的儀器：高效液相色譜儀器HP1100型；pHs-3c精密儀（上海雷磁儀）。色譜柱為C18柱，規(guī)格是 250 mm× 4.6mm,5μm。試驗中所用水均為超純水,試劑必須是分析純。大豆蛋白的標準品。還需要大豆異黃酮的標準儲備液體：要求精確稱取標準的大豆苷元2.60 mg，染料木黃酮2.70 mg，將兩者分別融入甲醇或者色譜純內(nèi)，并用甲醇固定溶液到5 mL，然后將其放入冰箱里冷凍保存。其中，大豆苷元的濃度要求為520 μg/mL,染料木黃酮的濃度要求為540 μg/mL。對于大豆異黃酮的混合使用液，用之前需要采取一定量的標準儲備液，并用甲醇充分稀釋。0.01 mol的乙酸銨溶液需要用冰乙酸調(diào)至pH值達到4.5才可以。對甲醇的要求為重蒸餾、抽濾而且需要用前超聲波來對其脫氣。

樣品的測定

實驗的樣品經(jīng)過研磨、粉碎的加工之后，將其均勻的混合，并準確地稱取一定量的樣品，加0.5 mol的鹽酸溶液加至大約30 mL然后混勻，在沸水中加熱回流3個小時，在進行冷卻，接著用0.5 mol/L的鹽酸溶液定容到50 mL，混勻。用一定量的水解樣液，用其將乙醇溶解后定容至25 mL，然后將其搖勻。用0.3 μm的有機濾膜過濾，作為待測樣品。同繪制標準曲線一樣的色譜檢測條件下分析待測的樣品10 μL，來測試樣品中大豆苷元染料木黃酮的色譜面積,以確保時間的穩(wěn)定性和峰面積的定量性。

檢測的選擇條件

實驗的樣品溶液首先要通過0.5 mol/L的鹽酸液對其進行回流，然后水解3個小時，這樣做的原因是使樣品中的大豆蛋白轉變?yōu)橛坞x的狀態(tài)。隨后被溶解的大豆苷元和染料木黃酮也可以進入有機的溶劑中，但它們卻不能溶于水里。在酸被水解之后，就能夠用甲醇或者乙醇溶中的游離狀態(tài)的大豆蛋白質(zhì)。筆者把這3種溶劑進行詳細的對比，通過這種方式比較了解幾種不同形態(tài)的食品酸水解溶液，同時也對染料木黃酮和大豆苷元的溶解情況進行細致的分析。通過分析可以發(fā)現(xiàn)這3者中，乙醇的提取效果是最好的。但由于在同一水解液中加入乙醇的量不相同，這會對等待測試的樣品溶解有一定的不良影響。這時就需要取適量的水解溶液，在其中加入不同量的乙醇，等其溶解之后再對色譜進行詳細的分析和研究。最后實驗證明：當樣品水解液被乙醇稀釋達3倍左右時，就可以完全提取出大豆苷元和染料木黃酮這兩種物質(zhì)。

標準曲線的繪制

分別吸取10 μL不同濃度的大豆異黃酮混合標準使用液，并對其進行色譜分析,以甲醇-0.01 mol/L乙酸銨緩沖溶液作為流動的相,流速為每分鐘1 mL，柱溫盡量保持在2℃，并在254 nm的部位進行檢測，測量標準溶液中大豆苷元和染料木黃酮的色譜面積。把大豆異黃酮的濃度數(shù)作為坐標軸中的橫坐標,色譜峰面積作為縱坐標，以此來繪制色譜峰的標準曲線或者進一步得出線性回歸方程。

實驗結果的分析與討論

樣品提取的選擇條件

此次實驗對4種不同的食品樣品進行了測試，改變了水解時鹽酸的濃度。通過實驗可以證明，鹽酸的酸度對大豆苷元的提取作用不是很大，但對提取染料木黃酮卻有著較大的影響。當鹽酸的濃度比0.5 mol還要高時，染料木黃酮的所提取量就有所降低。當鹽酸酸度達到0.5 mol/L，這時候?qū)煞N待測樣品的提取效果都較好。水解時鹽酸濃度對兩種實驗樣品的影響，將待測食品樣品在0.5 mol/L的鹽水中用沸水加熱，然后分別將它們水解和回流不同的時間范圍控制在0.5～ 4小時。實驗結果表明：回流2小時以上時，樣品中大豆異黃酮已經(jīng)完全水解。此次實驗運用回流3小時水解，分別于40、60、80℃和沸水中回流3小時水解樣品中的大豆異黃酮，結果展示出了樣品中的染料木黃酮和大豆苷元含量隨著溫度的升高而升高。

色譜的優(yōu)化條件

對流動相進行選擇，對于大豆異黃酮的測定，可以采用乙腈緩沖液作為流動相，但其中乙腈的價格比較昂貴，而且毒性較大。由于甲醇具有粘度較小、柱壓而且價格便宜適用范圍廣的優(yōu)點，所以常常被用于色譜分析的流動相。這種方法利用甲醇-0.01mol的乙酸銨緩沖體系用作流動相，對其進行分離。流動相的pH值對待測的兩種大豆樣品的分離有所影響。用冰乙酸來調(diào)節(jié)乙酸銨，乙酸銨溶液的pH值為3~6，它們分別與甲醇的比例混合，然后作為流動的相。試驗表明，當緩沖溶液的pH值達到4~6時，待測兩組的樣品色譜峰就會完全分離,分離的程度大于2.0。改變流動相甲醇乙酸銨pH4.5中甲醇的比例為30%～80%。對待測樣品進行色譜的檢測，結果表示：當流動相中的甲醇比例低于65%，這時兩種物質(zhì)就已經(jīng)可以達到很好的分離效果。同時，考慮到了有可能受樣品中雜質(zhì)的影響，此實驗選用的流動相，其中甲醇與0.01 mol的乙酸銨緩沖溶液混合的比例為60︰40，染料木黃酮的保留時間為9分鐘，大豆苷元的保留時間分別為6分鐘。對于流速和柱溫的選擇，流動相的流速對待測組分的分離有著直接的影響。本實驗分別采用每分鐘0.5~1.2 mol的流速，對待測組分進行有效的分離分析。結果顯示：流速越大保留的時間越小，但柱壓卻隨之變大，這種方法對于色譜柱有一定的損耗，流速減小的情況分析時間就會延長,且色譜峰變寬。本實驗采用1.0 mol/min的流速。在15~50℃的范圍內(nèi)對柱溫進行改變，這種實驗對待測樣品的分離影響并不是很大，但由于柱壓和柱溫的反比關系，導致色譜柱的使用壽命明顯降低。因此，實驗中柱溫不宜過低,本法次測試是25℃。

線性范圍的試驗

在此次試驗的色譜條件下，大豆苷元和染料木黃酮的濃度與面積之間存在著良好的線性關系。最佳的線性范圍是大豆苷元在0.5~520 μg,染料木黃酮在0.5~540 μg。大豆苷元的線性回歸方程為y=32.5x-1.37,而染料木黃酮為y=49.6x-4.47，用低濃度的混合標準使用液重復進行測試11次，得出色譜峰面積的3倍標準差，所對應濃度作為此方法的檢出限制，而大豆苷元的檢出限為0.05 μg,染料木黃酮為0.04 μg。對于這種方法的精密度采用以下方式測定，取3種濃度不一樣的混合標準使用液,按照此次試驗選定的色譜標準進行色譜的測定,以峰面積作為定量,計算兩種待測樣品的相對標準偏差。

方法準確度的試驗

此次試驗選定的實驗條件是對3種食品樣品加標回收的檢測，以此來評價這種方法的準確程度。結果證明兩種待測樣品的回收率范圍是大豆苷元94.1%~109.4%，平均的加標回收率是102%，而染料木黃酮的是91.4%~113.1%，平均加標的回收率102.6%。

兩種樣品分別采用超聲波提取的方法和室溫提取的方式，通過實驗知道兩種提取方法的提取效率是相同的，本實驗采取了對室溫提取，這樣不僅可以降低能源的消耗，還可以降低檢測成本。將大豆樣品分別放在室溫下，提取5~25分鐘，每隔五分鐘一次，實驗結果表明15分鐘以后游離氨基酸總量停止增長，所以提取時間做好為15分鐘。將所配制的5種濃度的氨基酸標準混合液進行測定，以各氨基酸峰面積為縱坐標，氨基酸濃度為橫坐標進行線性回歸的分析來得到回歸方程。各種氨基酸的濃度在每分鐘5~900 mol范圍內(nèi)時，其才具有良好的線性關系,這時的相關系數(shù)r在0.999 1~0.999 9之間。以信噪比計算最小限制，準確地稱取已測定出的游離氨基酸，其含量大豆樣品有6份，分別以游離氨基酸含量的80%、100%和120%左右加入標準液，然后對樣品進行提取。測得各氨基酸的回收率在96.32%~102.25%之間，相對的標準偏差為1.52%~4.30%。

樣品的測定結果

本實驗選定的條件分別對豆粉、豆奶、豆腐干和保健食品這4種樣品進行測定,為了保證峰面積的定量和時間的定性,需要分別對這4種樣品中大豆異黃酮的含量進行準確的計算。對10份大豆蛋白質(zhì)樣品進行游離氨基酸含量的檢測,所需的樣品總量為3.499~12.14 mg,平均含量為7.78 mg。9種必需氨基酸組氨酸和賴氨酸等等占總量的11.02%~25.97%。而大豆品種的不一樣和同一品種的游離氨基酸含量之間存在著較大差異性，這樣可以給大豆資源的保存、利用和評價提供科學的依據(jù)。10份樣品氨酸的含量都不低，占總量的27.69%~71.71%，其中9個樣品甚至達到40%以上，由于精氨酸有控制體內(nèi)細胞的退化降低血氨和增加肌肉活力的作用,因此將大豆應用于這些具有保健功能的食品，應該可以開拓廣闊的發(fā)展前景。

結語

本本研究細致地探討了部分食品樣品中大豆蛋白的檢測提取方法，對調(diào)查大豆及其所生產(chǎn)的制品和保健食品中大豆蛋白的含量提供了有效的分析方法，為進一步研究食物雌激素大豆蛋白對人體健康的影響充分提供了實驗手段。這種實驗方法不僅具有線性好、范圍寬的優(yōu)點，檢測的準確度還很高，分析時間僅需14分鐘，并且樣品前處理非常簡單。這種高效液相色譜法適合大豆及其他食品中蛋白質(zhì)含量的測定。