R59022調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大

柳玉梅，尹　園，張貴平，張海寧

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，廣東 廣州　511436)

?

R59022調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大

柳玉梅，尹園，張貴平，張海寧

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，廣東 廣州511436)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R322.11；R329.24；R542.202.2；R977.3

摘要：目的研究甘油二酯激酶(DGK)的抑制劑R59022對(duì)心肌細(xì)胞自噬及內(nèi)皮素 1 (ET-1) 誘導(dǎo)的心肌肥大的影響，并探討其可能機(jī)制。方法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，ET-1誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大；Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)、beclin-1、p62的表達(dá)以及Akt的磷酸化及非磷酸化蛋白表達(dá)；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)心肌肥大基因腦鈉肽(BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)的mRNA表達(dá)水平；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積。結(jié)果ET-1作用乳鼠心肌細(xì)胞24 h明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，并誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I、beclin-1的表達(dá)增強(qiáng)，p62表達(dá)減弱。自噬抑制劑氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)減小心肌細(xì)胞表面積，下調(diào)肥大基因BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)，改善ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，而自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(RAPA)則促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大；R59022預(yù)處理增加ET-1誘導(dǎo)的LC3-II/I、beclin-1的表達(dá)，增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬,同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的增大，BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平的增加，促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；對(duì)Akt表達(dá)的結(jié)果顯示，ET-1明顯下調(diào)Akt的磷酸化水平，R59022對(duì)此有促進(jìn)作用。結(jié)論R59022增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制可能與抑制Akt的激活，從而抑制mTOR通路的活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)皮素1；心肌細(xì)胞；心肌肥大；自噬；甘油二酯激酶；R59022

心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心臟應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷緩慢產(chǎn)生的一種代償機(jī)制，常伴隨蛋白質(zhì)合成增加、心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和細(xì)胞器的功能障礙，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、膠原纖維形成的肌節(jié)增加及胚胎基因的再表達(dá)，是先天性心臟病、高血壓、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病共有的病理過程。自噬(autophagy)是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,Atg)的調(diào)控下，利用溶酶體降解自身受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過程。自噬是生物維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定的共同機(jī)制，廣泛參與了各種生理和病理過程[1]。研究表明[2-3]，自噬參與調(diào)控心肌肥大，但其具體作用及機(jī)制目前尚不明確。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCRs)/甘油二酯(diacylglycerol,DAG)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信號(hào)通路在調(diào)控心肌肥大的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮非常重要的作用。甘油二脂激酶(diacylglycerol kinase,DGK)是DAG的磷酸激酶，通過磷酸化DAG，減少DAG的可利用性，可以削弱DAG對(duì)PKC的激活，是負(fù)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。我們以往的研究顯示[4]，DGK在心肌組織分布的主要亞型DGK-ζ 明顯抑制內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)誘導(dǎo)的心肌肥大，但其機(jī)制尚未完全闡明。新近有研究表明，DGK的抑制劑R59022能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞株NG108-15的自噬[5]，提示DGK可能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，進(jìn)而影響心肌肥大。為研究DGK 調(diào)節(jié)的心肌細(xì)胞自噬在心肌肥大中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先觀察了 R59022對(duì)ET-1誘導(dǎo)的原代乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響，并探討其可能分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物出生1~3 d的清潔級(jí)SD大鼠,♀♂不拘，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK粵2013-0002。

1.1.2主要試劑高糖DMEM、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco；ET-1、R59022、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、氯喹(chloroquine,CQ)、三甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)、胰蛋白酶、F-actin-鬼筆環(huán)肽等試劑均購(gòu)自Sigma；雷帕霉素(rapamycin, RAPA)購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司；LC3、beclin-1、p62、p-Akt、Akt 、p-AMPK、AMPK等抗體以及ECL發(fā)光液均購(gòu)自Cell Signaling Technology；β-actin購(gòu)自Bioworld；逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa；PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1新生大鼠原代心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)及藥物處理出生1~3 d SD大鼠，無菌開胸取心臟，剪碎，胰酶反復(fù)多次消化后，收集消化的心肌細(xì)胞懸液，于4 ℃離心收集細(xì)胞。用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞，差速貼壁法除去貼壁的成纖維細(xì)胞，未貼壁的心肌細(xì)胞以合適密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿或孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h后，以ET-1(10-7mol·L-1)作用細(xì)胞24 h誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大，CQ(5 μmol·L-1)、3-MA(5 mmol·L-1)、RAPA(10 nmol·L-1)和R59022(10-5mol·L-1)分別于加入ET-1前0.5 h加入，以觀察其對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及心肌肥大的影響。

1.2.2Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)藥物處理后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，剪取目的條帶，以脫脂奶粉室溫封閉1 h，隨后加入LC3、beclin-1、p62、p-Akt、Akt、β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，TBST洗膜后，用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，Quantity one軟件分析灰度值，以目的條帶的灰度值與β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積藥物處理后，除去培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)固定、破膜、封閉后，用TRITC-鬼筆環(huán)肽避光孵育以標(biāo)記F-actin，于熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。每組隨機(jī)選取30個(gè)細(xì)胞，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計(jì)算心肌細(xì)胞表面積。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)心肌肥大標(biāo)記物BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平TRIzol裂解細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件：95 ℃變性 3 min,95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán), 72 ℃ 延伸 10 min。反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 mg·L-1)，用BI2000凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的基因條帶的積分光密度值(IOD)與β-actin的 IOD之比確定目的基因BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬如Fig 1所示，給予ET-1分別作用心肌細(xì)胞0~12 h，ET-1對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I、beclin-1及p62表達(dá)沒有明顯影響，但與0 h相比，ET-1作用細(xì)胞24 h明顯誘導(dǎo)LC3-II/I、beclin-1表達(dá)上調(diào)(P<0.05,Fig1A、1B)，并使p62表達(dá)明顯降低(P<0.05,Fig 1B)；預(yù)先給予自噬溶酶體的抑制劑CQ抑制溶酶體降解后，較未經(jīng)CQ預(yù)處理細(xì)胞相比，ET-1作用各時(shí)間點(diǎn)LC3-II/I的表達(dá)有增加趨勢(shì)，且在24 h明顯增加(P<0.01,Fig 1A)，表明ET-1明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬及自噬流。

2.2自噬抑制劑及激動(dòng)劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響如Fig 2所示，與control組相比，ET-1明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞表面積增加(P<0.01,Fig 2A)及肥大基因BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平的上調(diào)(P<0.01,Fig 2B、2C)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大；自噬抑制劑CQ、3-MA對(duì)上述指標(biāo)發(fā)揮明顯抑制作用(P<0.01,Fig 2A、2B)，而自噬激動(dòng)劑RAPA則發(fā)揮明顯的促進(jìn)作用(P<0.01,Fig 2A、2C)。提示自噬激活促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

2.3R59022促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬如Fig 3所示，與control組相比，ET-1作用于心肌細(xì)胞24 h，LC3-II/I及beclin-1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01)；R59022預(yù)處理明顯促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的上述指標(biāo)上調(diào)(P<0.05,P<0.01)。

2.4R59022促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大如Fig 4所示，R59022預(yù)處理促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增加(P<0.01,Fig 4A)及BNP、β-MHC 的mRNA表達(dá)水平的上調(diào)(P<0.05,Fig 4B)，促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

2.5R59022下調(diào)Akt的磷酸化水平如Fig 5所示，與control組相比，ET-1明顯下調(diào)Akt的磷酸化水平(P<0.05,Fig 5A)，R59022預(yù)處理促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平的下調(diào)(P<0.05,Fig 5A)；而對(duì)AMPK的磷酸化水平，ET-1及R59022均未見明顯影響(P>0.05,Fig 5B)。

3討論

心肌肥大是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵組成部分，是導(dǎo)致心源性猝死和心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)明顯升高的危險(xiǎn)因素[6]，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全明確。ET-1是公認(rèn)的促肥大因子[7]，通過與其特異性的受體結(jié)合,在介導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8]。本研究結(jié)果證實(shí)，ET-1作用原代乳鼠心肌細(xì)胞24 h明顯增大心肌細(xì)胞表面積，增加肥大基因BNP、β-MHC 的mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞肥大。

Fig 1　Effects of ET-1 on expression of autophagy-related proteins(n=3~8)

A: Effects of ET-1 on expression of LC3II/I in the presence or absence of CQ pretreatment; B:Effects of ET-1 on expression of beclin-1 and p62.*P<0.05vsET 0 h;#P<0.05,##P<0.01vsET+CQ 0 h;△P<0.05vsET 24 h

Fig 2　Effects of 3-MA,CQ and RAPA on ET-1-induced myocardial hypertrophy(n=3~4)

A: Effects of 3-MA,CQ,RAPA on cardiomyocyte size; B: Effects of 3-MA,CQ on mRNA levels of BNP and β-MHC; C: Effects of RAPA on mRNA levels of BNP and β-MHC.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET

Fig 3　Effects of R59022 on expression of autophagy-related proteins(n=6)

Fig 4　Effects of R59022 on ET-1-induced myocardial hypertrophy(n=3~4)

A: Effects of R59022 on cardiomyocyte size; B: Effects of R59022 on mRNA levels of BNP and β-MHC.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsET.

Fig 5　Effects of R59022 on expression of Akt and AMPK(n=4~5)

A:Effects of R59022 on expression of Akt; B: Effects of R59022 on expression of AMPK.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsET.

近年的研究顯示，自噬參與調(diào)控心肌肥大的發(fā)生發(fā)展，但其對(duì)心肌肥大的具體作用目前尚不明確。有研究認(rèn)為自噬激活起促進(jìn)心肌肥大的作用[9]，也有研究認(rèn)為自噬激活對(duì)心肌肥大起保護(hù)作用[10]。造成自噬在心肌肥大中作用不同，甚至相反的原因可能是疾病的誘因、損傷程度及自噬的水平不同。自噬的發(fā)生主要包括三個(gè)階段：第一階段，自噬誘導(dǎo)因素刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或細(xì)胞膜等形成自噬前體；第二階段，在Atgs的參與下，自噬前體延伸, 包裹需要降解的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器, 形成自噬體；第三階段，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，降解產(chǎn)物并參與機(jī)體代謝。從自噬前體的形成到內(nèi)容物降解的整個(gè)流程即自噬流(autophagy flux)。在自噬的發(fā)展過程中，beclin-1是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵因子，參與調(diào)控自噬前體的產(chǎn)生。在自噬被誘導(dǎo)后，由原位于胞質(zhì)中的LC3I與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)偶合，形成始終穩(wěn)定錨定在自噬體膜上的LC3II，標(biāo)志著自噬體的形成，因此，研究者以往多以beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)或者以綠色熒光蛋白標(biāo)記LC3等方法間接反映自噬的活性。然而，自噬體數(shù)量的增加不能完全反映自噬的活性，因?yàn)樵斐勺允审w數(shù)量增加的原因可能是自噬的激活，還可能是自噬溶酶體的降解障礙導(dǎo)致自噬體無法降解而堆積，所以新近研究多以自噬流評(píng)價(jià)自噬[11-12]。本研究中，我們檢測(cè)了自噬標(biāo)志性蛋白LC3、beclin-1的表達(dá)，還檢測(cè)了可以反映自噬流通暢性的自噬相關(guān)蛋白p62，以及通過觀察CQ在溶酶體水平阻斷自噬的降解后LC3的表達(dá)水平來評(píng)價(jià)自噬水平。結(jié)果顯示，ET-1明顯誘導(dǎo)LC3II/I、beclin-1蛋白表達(dá)的增加，促進(jìn)p62蛋白的降解。并且，在用CQ阻斷自噬降解后，LC3II/I的表達(dá)水平較未經(jīng)CQ處理的細(xì)胞相比明顯增加，提示ET-1誘導(dǎo)心肌肥大過程中明顯伴隨自噬水平的上調(diào)。為了進(jìn)一步明確自噬在ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中的作用，本研究觀察了自噬抑制劑3-MA、CQ和自噬激動(dòng)劑RAPA對(duì)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果顯示，3-MA、CQ抑制自噬可以明顯改善ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，而RAPA激活自噬則進(jìn)一步促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，提示自噬激活參與調(diào)節(jié)ET-1誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大。

研究表明，Gq介導(dǎo)的磷脂酰肌醇信號(hào)通路在心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DGK是磷脂酰肌醇信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過磷酸化DAG，可以削弱DAG對(duì)該信號(hào)通路的激活，在抑制心肌肥大發(fā)展過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體的胞內(nèi)信號(hào)目前尚不完全清楚。有研究報(bào)道，DGK的抑制劑R59022能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞株NG108-15自噬[5]。我們對(duì)心肌纖維化的研究結(jié)果亦顯示[13]，DGK參與調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞自噬和纖維化，提示DGK亦可能通過參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，進(jìn)而影響心肌肥大過程。因此，本研究首先觀察了DGK的抑制劑R59022對(duì)心肌細(xì)胞肥大及自噬的影響。我們的結(jié)果顯示，R59022預(yù)處理促進(jìn)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)對(duì)ET-1誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白LC3II/I、beclin-1的表達(dá)水平的上調(diào)亦有促進(jìn)作用，提示R59022可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)了ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

目前已經(jīng)明確的調(diào)控自噬的信號(hào)通路主要分為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依賴型途徑和非mTOR依賴型途徑。mTOR作為自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活化后可抑制自噬的發(fā)生，是自噬的主要負(fù)調(diào)控因子[14]。目前認(rèn)為mTOR信號(hào)通路上游的刺激因子主要是胰島素、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、能量以及壓力。生長(zhǎng)因子和胰島素的刺激可以激活PI3K，PI3K進(jìn)一步活化其下游關(guān)鍵效應(yīng)因子Akt，Akt直接磷酸化mTOR的Ser2448 位點(diǎn)，激活mTOR，從而抑制自噬。磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)則是細(xì)胞能量感受的總開關(guān)，通過mTOR信號(hào)通路和非mTOR信號(hào)通路如p53、ULK1[15]、avicin D[16]等調(diào)控細(xì)胞自噬與凋亡，在細(xì)胞的代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，ET-1誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大過程中，Akt的磷酸化水平明顯下調(diào)，R59022對(duì)此有促進(jìn)作用，但是ET-1和R59022并不影響AMPK的磷酸化水平，提示R59022增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制可能與抑制Akt的激活，從而抑制mTOR通路的活化有關(guān)，而AMPK信號(hào)可能并不參與R59022的自噬促進(jìn)作用，但其分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步明確。

參考文獻(xiàn)

[1]林超,劉兆國(guó),錢星,等. 自噬在心血管疾病中的作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014,30(10):1347-9.

[1]Lin C, Liu Z G, Qian X, et al. Research progress on the role of autophagy in cardiovascular diseases[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(10):1347-9.

[2]Oyabu J,Yamaguchi O,Hikoso S,et al.Autophagy-mediated degradation is necessary for regression of cardiac hypertrophy during ventricular unloading[J].BiochemBiophysResCommun,2013,441(4):787-92.

[3]Dai D F,Rabinovitch P.Mitochondrial oxidative stress mediates induction of autophagy and hypertrophy in angiotensin-II treated mouse hearts[J].Autophagy,2011,7(8):917-8.

[4]Huang Y,Zhang H,Shao Z,et al.Suppression of endothelin-1-induced cardiacmyocyte hypertrophy by PPAR agonists:role of diacylglycerol kinase zeta[J].CardiovascRes,2011,90(2):267-75.

[5]Takita T,Konuma T,Hanazato M,Inoue H.Diacylglycerol kinase inhibitor R59022-induced autophagy and apoptosis in the neuronal cell line NG108-15[J].ArchBiochemBiophys,2011, 509(2):197-201.

[6]Frey N,Olson E N.Cardiac hypertrophy:the good,the bad,and the ugly[J].AnnuRevPhysiol,2003,65:45-79.

[7]Li H,Gao S,Ye J,et al.COX-2 is involved in ET-1-induced hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes: role of NFATc3[J].MolCellEndocrinol,2014,382(2):998-1006.

[8]孔令雷,顏玲娣,宮澤輝.內(nèi)皮素系統(tǒng)與心肌肥厚[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2008,24(9):1127-30.

[8]Kong L L,Yan L D,Gong Z H.Endothelins system and myocardial hypertrophy[J].ChinPharmacolBull,2008,24(9):1127-30.

[9]Rawat D K,Alzoubi A,Gupte R,et al.Increased reactive oxygen species,metabolic maladaptation,and autophagy contribute to pulmonary arterial hypertension-induced ventricular hypertrophy and diastolic heart failure[J].Hypertension,2014,64(6):1266-74.

[10]Liu C,Xue R,Wu D,et al. REDD1 attenuates cardiac hypertrophy via enhancing autophagy[J].BiochemBiophysResCommun,2014,454(1):215-20.

[11]Lavandero S, Troncoso R,Rothermel B A,et al.Cardiovascular autophagy:concepts,controversies,and perspectives[J].Autophagy,2013,9(10):1455-66.

[12]Zhang Y,Xu X,Ren J.MTOR overactivation and interrupted autophagy flux in obese hearts:a dicey assembly[J]？Autophagy,2013,9(6):939-41.

[13]鄒剛玲,柳玉梅,張海寧.自噬對(duì)AngII誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及遷移的影響及機(jī)制[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2015,31(3):407-11.

[13]Zou G L,Liu Y M,Zhang H N.Effect of autophagy on AngⅡ-induced proliferation and migration of cardiac fibroblasts[J].JGuangdongPharmUniv,2015,31(3):407-11.

[14]Mizushima N,Levine B,Cuervo A M,Klionsky D J. Autophagy fights disease through cellular self-digest[J].Nature,2008,451(7182):1069-75.

[15]Wang S,Song P,Zou M H. AMP-activated protein kinase,stress responses and cardiovascular diseases[J].ClinSci,2012,122(12):555-73.

[16]Xu Z X,Liang J,Haridas V,et al.A plant triterpenoid,avicin D,induces autophagy by activation of AMP-activated protein kinase[J].CellDeathDiffer,2007,14(11):1948-57.

R59022 promotes ET-1-induced cardiac hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes via regulating autophagy

LIU Yu-mei，YIN Yuan，ZHANG Gui-ping，ZHANG Hai-ning

(DeptofPharmacology，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou511436,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of DGK inhibitor R59022 on ET-1-induced myocardial hypertrophy and autophagy, and explore the possible mechanisms. MethodsMyocardial hypertrophy was induced by ET-1 in cultured rat neonatal cardiomyocytes. Western blot was used to detect the expression of microtubule-associate protein 1 light chain 3(LC3), beclin-1, p62, p-Akt and Akt. mRNA expression of brain natriuretic peptide (BNP) and beta mysion heavy chain (β-MHC) and the cell size of cardiomyocytes were detected by RT-PCR and immunofluorescence, respectively. ResultsTreatment cardiomyocytes with ET-1(10-7mol·L-1) for 24 h induced the myocardial hypertrophy in cultured neonatal rat cardiomyocytes with the activation of autophagy as evidenced by the increased expression of autophagy-related proteins LC3-II/I and beclin-1, as well as the increased p62 degradation. While, myocardial hypertrophy induced by ET-1, including the increased myocardial cell size and the mRNA expression of fetal gene BNP and β-MHC, could be reversed by autophagy inhibitor 3-methyl adenine (3-MA) and chloroquine (CQ),but promoted by autophagy agonist rapamycin (RAPA).Pretreatment cardiomyocytes with R59022, an inhibitor of DGK, enhanced ET-1-induced myocardial hypertrophy by enhancing autophagy in cardiomyocytes.Furthermore,ET-1 treatment inhibited the activation of Akt by the down-regulation of the Akt phosphorylation, and R59022 enhanced the effect of ET-1 on the activation of Akt. ConclusionsEnhanced autophagy contributes to cardiomyocyte hypertrophy. R59022 deteriorate ET-1-induced myocardial hypertrophy by activating autophagy. The possible mechanism may be related to the inhibition of activation of mTOR signaling pathway by inhibiting the activation of Akt.

Key words:endothelin-1; cardiomyocyte; cardiac hypertrophy; autophagy; diacylglycerol kinase; R59022

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0239-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.018

作者簡(jiǎn)介：柳玉梅(1989-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：liuyumei1220@126.com；張海寧(1968-)，女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：zhanghn_gz@126.com

基金項(xiàng)目：廣州市教育局基金資助項(xiàng)目(No 10A179)

收稿日期:2015-11-14,修回日期:2015-12-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.036.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57