內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ-123對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響①

劉俊杰，趙旭，趙雅寧，李建民，徐繼偉

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內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ-123對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響①

劉俊杰1，趙旭2，趙雅寧1，李建民2，徐繼偉1

[摘要]目的探討B(tài)Q-123對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。方法72只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=24)、SAH模型組(SAH組，n=24)和BQ-123組(n=24)。二次注血法建立大鼠SAH模型，假手術(shù)組不注血，BQ-123組于造模前30 min側(cè)腦室注射BQ-123 18 μg。分別于術(shù)后6 h、24 h、72 h、144 h應(yīng)用穿梭箱測(cè)試大鼠遭受電擊時(shí)被動(dòng)回避潛伏期(PAL)、主動(dòng)回避反應(yīng)率(AARR)；HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組化檢測(cè)自噬相關(guān)因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)PAL延長(zhǎng)(P<0.05)，AARR降低(P<0.05)，海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05)，Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增加；與SAH組比較，BQ-123組各時(shí)間點(diǎn)PAL縮短(P<0.05)，AARR升高(P< 0.05)，海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.05)，Beclin-1、LC-3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。結(jié)論BQ-123可促進(jìn)SAH大鼠學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與激活海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]蛛網(wǎng)膜下腔出血；BQ-123；學(xué)習(xí)記憶；自噬；海馬；大鼠

[本文著錄格式]劉俊杰，趙旭，趙雅寧，等.內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ-123對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(2): 141-145.

CITED AS: Liu JJ, Zhao X, Zhao YN, et al. Effects of endothelin a receptor antagonist BQ-123 on learning and memory ability and neurons autophagy in hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 141-145.

作者單位：1.華北理工大學(xué)，河北唐山市063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山市063000。作者簡(jiǎn)介：劉俊杰(1990-)，男，漢族，河北保定市人，碩士研究生，主要研究方向：腦損傷與腦保護(hù)。通訊作者：李建民，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向：腦損傷與腦保護(hù)。E-mail: zyning789@126.com。

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)主要由動(dòng)脈瘤破裂、先天性動(dòng)-靜脈畸形及頭部外傷導(dǎo)致，具有非常高的致殘率和死亡率；存活者常遺留學(xué)習(xí)記憶障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。腦血管痙攣和再破裂出血是被公認(rèn)的SAH后損傷機(jī)制[1-2]。自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究顯示自噬的激活可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少神經(jīng)細(xì)胞的丟失，而腦血管痙攣又是神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響因素之一[3-4]。內(nèi)皮素受體拮抗劑BQ-123具有高特異性親和力，在血漿中與內(nèi)皮素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)皮素A受體，產(chǎn)生拮抗作用，能降低血管痙攣、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性[5-6]。

本研究觀察BQ-123對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠72只，體質(zhì)量350～450 g，10～12周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2009-003。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。

所有大鼠依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、SAH組、SAH結(jié)合應(yīng)用內(nèi)皮素受體拮抗劑組(BQ-123組)，每組各24只。模型完成后，每組任意配伍分為6 h、24 h、72 h、144 h 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2試劑與儀器

多克隆Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗：美國(guó)SANTA CRUZ公司。二抗及其輔助用品：博奧森生物技術(shù)有限公司。ZH-CSC型穿梭箱實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。820-Ⅱ型切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司。TP-1型攤片機(jī)：天津天利機(jī)電公司。大鼠腦立體定向儀：上海奧爾科特生物科技有限公司。Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng)、BHS顯微鏡：日本OLYMPUS。攝影生物光學(xué)顯微鏡：日本NIKON公司。

1.3模型制備

參考馬朝暉文獻(xiàn)[7]所述，采用經(jīng)典的自體血二次枕大池注血法(間隔48 h分別向枕大池注射自體動(dòng)脈血0.3 ml)制備大鼠SAH的模型。造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)行二次枕大池注血時(shí)，可見(jiàn)少量血性腦脊液在穿刺部位滲出，此現(xiàn)象充分說(shuō)明穿刺針位置準(zhǔn)確；②造模完成3 h內(nèi)，大鼠頭部CT可見(jiàn)外側(cè)裂、鞍上池及側(cè)腦橋池CT值較高；③剝離腦部時(shí)肉眼可以見(jiàn)到極其顯眼的血性液體散布在腦底基底池部位。

Sham組向枕大池兩次注入0.3 ml生理鹽水，其余操作均與SAH組一致。BQ-123組在模型制備前30 min予以顱骨鉆孔，側(cè)腦室定位，然后側(cè)腦室注射BQ-123 18 μg，再制備SHA模型。

1.4行為學(xué)檢測(cè)

各組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)分別置入穿梭箱內(nèi)，暗適應(yīng)5 min，隨后給予5 s的鈴聲刺激，再立即予以30 s電刺激；間隔20 s行下一次練習(xí)。試驗(yàn)中大鼠受到鈴聲刺激5 s內(nèi)，能夠迅速逃離危險(xiǎn)區(qū)，則被界定為1次主動(dòng)回避反應(yīng)；大鼠受到鈴聲刺激5 s內(nèi)未逃離危險(xiǎn)區(qū)，繼續(xù)予以1.5 mA交流電刺激30 s，電擊后大鼠若逃向安全位置記為1次被動(dòng)回避反應(yīng)，其余任何反應(yīng)均為陰性結(jié)果。反復(fù)記錄30次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄遭受電擊時(shí)被動(dòng)回避潛伏期(passive avoidance latency, PAL)、主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)等參數(shù)。系統(tǒng)分析主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)占總訓(xùn)練次數(shù)的百分比即為主動(dòng)回避反應(yīng)率(active avoidance reaction rate, AARR)。AARR越高，PAL越短，提示動(dòng)物學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.5 HE染色

各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，4%多聚甲醛灌注，固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規(guī)石蠟包埋，切片(片厚5 μm)HE染色。光學(xué)顯微鏡(400×)下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化。每只大鼠取6張海馬CA1區(qū)切片，Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng)記錄高倍視野下存活與壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算均值。

1.6免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓熱修復(fù)，分別滴加Beclin-1多克隆抗體(濃度1∶200)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(濃度1∶300)，濕盒中4℃過(guò)夜；滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。PBS代替一抗陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下(400×)觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化；每只大鼠每個(gè)因子選3張切片，每張切片在高倍視野鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊視野(400×)，經(jīng)BHS顯微鏡計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法或Scheffe法進(jìn)行組間兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1學(xué)習(xí)記憶能力

與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)PAL延長(zhǎng)(P< 0.05)，AARR降低(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時(shí)間點(diǎn)PAL縮短(P<0.05)，AARR升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1　三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PAL比較(s)

表2　三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)電擊時(shí)AARR比較(%)

2.2 HE染色

Sham組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞間排列規(guī)整，自身結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核飽滿，核仁清晰可見(jiàn)。SAH組可見(jiàn)神經(jīng)元部分胞核邊界不清，核固縮、碎裂，核溶解，其中傷后6 h海馬區(qū)神經(jīng)元損傷最嚴(yán)重；BQ-123組神經(jīng)細(xì)胞水腫明顯減輕，壞死神經(jīng)元減少，細(xì)胞固縮深染現(xiàn)象減輕。見(jiàn)圖1。

與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/高倍視野)

2.3免疫組織化學(xué)染色

與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)的Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增加(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組各時(shí)間點(diǎn)Beclin-1、LC-3-Ⅱ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。見(jiàn)表4、表5、圖2、圖3。

表4　各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)(個(gè)/高倍視野)

表5　各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)LC3-II表達(dá)(個(gè)/高倍視野)

圖1　各組6 h海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化(HE染色，400×)

圖2　各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Beclin-1的表達(dá)(免疫組化染色，400×)

圖3　各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞LC3-II的表達(dá)(免疫組化染色，400×)

3　討論

本研究結(jié)果顯示，SAH所導(dǎo)致的腦損傷明顯影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而應(yīng)用BQ-123后大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有明顯改善。學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)活動(dòng)功能，其產(chǎn)生機(jī)制目前尚無(wú)定論，對(duì)于學(xué)習(xí)記憶能力受損的治療方案也尚不明確。朱杰君等通過(guò)Aβ25-35誘導(dǎo)空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠模型，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ與小鼠學(xué)習(xí)記憶存在一定關(guān)系[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)升高，自噬明顯被激活，而應(yīng)用BQ-123干預(yù)后，自噬水平較SAH組更為提高，而大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能也隨之升高，與其研究結(jié)果一致。

BQ-l23是一類(lèi)高特異性親和力及水溶性的內(nèi)皮素受體拮抗劑，在血漿中與內(nèi)皮素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)皮素受體，BQ-123在降低血管痙攣、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性的過(guò)程中，主要通過(guò)與內(nèi)皮素-1產(chǎn)生拮抗而發(fā)揮作用[3-4]。姜永生等實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦損傷疾病中BQ-123在血漿中與內(nèi)皮素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)皮素受體，緩解血管的收縮，抑制血管的痙攣，改善腦組織灌注壓，使細(xì)胞的缺血缺氧得到相應(yīng)的改善，減少外界環(huán)境對(duì)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬[9]。Ceylan-Isik等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1能夠降低Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，BQ-123的干預(yù)可以提高心肌細(xì)胞自噬激活的程度[10]。蔡紅法等的研究進(jìn)一步論證SAH后腦血管痙攣和自噬存在一定的因果關(guān)系[11]。本研究結(jié)果與此一致。BQ-123拮抗內(nèi)皮素，使得鈣離子釋放減少，保證腦組織的血供[12]。內(nèi)皮素-1通過(guò)與內(nèi)皮素B受體結(jié)合，釋放內(nèi)源性NO，進(jìn)一步緩解血管收縮，舒張血管，緩解腦組織的缺血缺氧。我們推測(cè)，BQ-123可能通過(guò)該機(jī)制提高神經(jīng)細(xì)胞自噬水平進(jìn)而提高學(xué)習(xí)記憶功能。

本研究還通過(guò)病理學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，BQ-123組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量明顯比SAH組多。前期研究已經(jīng)證實(shí)，自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活有保護(hù)作用。因此，本研究認(rèn)為BQ-123干預(yù)后可能通過(guò)緩解腦血管痙攣而提高神經(jīng)細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

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Effects of Endothelin A Receptor Antagonist BQ-123 on Learning and Memory Ability and Neurons Autophagy in Hippocampus in Rats with Subarachnoid Hemorrhage

LIU Jun-jie1, ZHAO Xu2, ZHAO Ya-ning1, LI Jian-min2, XU Ji-wei1
1.North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China; 2.Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Correspondence to LI Jian-min. E-mail: zyning789@126.com

Abstract:Objective To investigate the effect of BQ-123 on the ability of learning and memory and nerve cell autophagy in hippocampus in rats with subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods 72 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, SAH model group (SAH group) and BQ-123 group with 24 rats in each group. SAH model was established by injecting the autologous blood into cisterna magna twice. The sham group was not injected blood. BQ-123 group received intracerebroventricular injection with BQ-123 18 μg 30 minutes before modeling. 6, 24, 72 and 144 hours after modeling, the passive avoidance latency (PAL) and active avoidance reaction rate (AARR) were tested with Shutter Box Test, the nerve cell morphological changes of hippocampus were observed with HE staining, and the expressions of Beclin-1 and LC3-II were detected with immunohistochemical staining. Results Compared with the sham group, the PAL prolonged, the AARR decreased (P<0.05), the nerve cells in the hippocampus reduced (P<0.05), and the expressions of Beclin-1 and LC3-II increased (P<0.05) in SAH group. Compared with SAH group, PAL shortened (P<0.05), AARR increased (P<0.05), the nerve cells in the hippocampus increased (P<0.05), and the expressions of Beclin-1 and LC3-II increased (P<0.05) in BQ-123 group. Conclusion BQ-123 can promote the recovery of learning and memory ability, which may relate to the activation of nerve cell autophagy in the hippocampus.

Key words:subarachnoid hemorrhage; BQ-123; learning and memory; autophagy; hippocampus; rats

(收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-21)

基金項(xiàng)目：河北省重大醫(yī)學(xué)課題(No.ZD2013093)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.004

[中圖分類(lèi)號(hào)]R743.35

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2016)02-0141-05