跑臺訓練對大鼠腦缺血再灌注損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響①

謝宏文，謝旭光

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跑臺訓練對大鼠腦缺血再灌注損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響①

謝宏文1，謝旭光2

[摘要]目的觀察跑臺訓練對大鼠腦缺血再灌注損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達的影響。方法成年雄性Wistar大鼠30只隨機分為假手術組、模型組和跑臺訓練組，每組10只。采用線栓法制備大腦中動脈阻塞2 h再灌注模型。假手術組插線10 mm后即刻退出。跑臺訓練組在造模成功后第3天進行跑臺訓練12 d，在造模后第4、8、15天采用改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)對各組大鼠評分，造模后第15天HE染色觀察腦組織病理學變化，Western blotting檢測BDNF和GFAP表達。結果造模后15 d，與模型組比較，跑臺訓練組mNSS評分明顯降低(F=9.931, P<0.01)，缺血側皮質(zhì)腦組織病理損傷減輕，GFAP(t=6.73)和BDNF(t=3.78)表達明顯升高(P<0.01)。結論跑臺訓練可促進大鼠腦缺血再灌注損傷后GFAP和BDNF的表達，促進神經(jīng)功能的恢復。

[關鍵詞]跑臺訓練；缺血再灌注；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；大鼠

[本文著錄格式]謝宏文，謝旭光.跑臺訓練對大鼠腦缺血再灌注損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2016, 22(2): 132-135.

CITED AS: Xie HW, Xie XG. Effects of treadmill training on expression of glial fibrillary acidic protein and brain-derived neurotrophic factor in rats with cerebral ischemia-reperfusion [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 132-135.

作者單位：1.聊城市人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，山東聊城市252000；2.聊城市疾病預防控制中心檢驗科，山東聊城市252000。作者簡介：謝宏文(1967-)，女，漢族，山東聊城市人，主管技師，主要研究方向：腦血管病康復。E-mail: xhwlfr@163.com。

近年來，缺血性腦血管病的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為人類致死和致殘的主要疾病之一[1]。如何最大程度減輕腦缺血再灌注帶來的損傷，保護受損的神經(jīng)細胞，一直是研究的熱點。研究表明，早期合理運動訓練能促進缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復，提高患者的生存質(zhì)量[2-4]。但有關運動訓練對腦缺血再灌注損傷的作用機制目前有待進一步闡明。

本實驗通過建立大鼠局灶性腦缺血模型，觀察跑臺訓練對膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

清潔級雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量230～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。隨機分為假手術組、模型組和跑臺訓練組，每組10只。

1.2主要試劑和設備

BDNF一抗、GFAP一抗：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。內(nèi)參β-actin：SANTA CRUZ公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：江蘇碧云天生物公司。電動跑臺：北京碩林苑科技有限公司。

1.3模型制備

實驗前將動物置于實驗室適應環(huán)境1周，自由進食、飲水，室溫(23±2)℃，術前禁食12 h。參考Longa方法[5]，應用線栓法經(jīng)左側頸外-頸內(nèi)動脈插線建立缺血2 h再灌注24 h模型。術中和術后用恒溫電熱毯保持動物肛溫36～37℃。假手術組插線10 mm后即刻退出。大鼠清醒后采用Longa法[5]對大鼠神經(jīng)行為學評分，將得分為2～3分的大鼠納入實驗。

1.4跑臺運動訓練

跑臺訓練組于術后第3天進行跑臺訓練，每天30 min，共12 d。平板斜度0°；訓練第1、2天履帶傳輸速度10 m/min，訓練第3天及以后20 m/min。假手術組和模型組同樣抓取，但不進行跑臺訓練。

1.5神經(jīng)功能評分

術后4 d、8 d、15 d采用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score, mNSS)[6]評估各組大鼠神經(jīng)功能變化?？偡?8分，分數(shù)越高，神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴重。

1.6 HE染色

術后15 d，10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后打開腹腔，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定。腦組織常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，自視交叉后連續(xù)冠狀位切片，片厚5 μm。切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水沖洗后，行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織病理變化。1.7 Western blotting

術后15 d，取-80℃保存的缺血側皮層100 mg，加入預冷細胞裂解液400 μl，充分研磨，4℃12000 r/ min離心20 min，取上清液，采用BCA法進行蛋白定量，并將蛋白樣品標準化。取30 μg蛋白樣品，用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用10%脫脂牛奶封閉1 h后分別加入GFAP一抗(1∶1000)、BNDF一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次15 min。在膜上加入生物素標記二抗后室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次后用ECL化學發(fā)光法顯色，曝光后保存圖片，以β-actin為內(nèi)參，應用Quantity One分析軟件對蛋白條帶進行灰度掃描。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結果

將模型制備失敗的3只大鼠及死亡的2只大鼠均予以剔除并補充，最終各組納入分析的仍為10只大鼠。

2.1 mNSS評分

術后4 d、8 d，跑臺訓練組mNSS評分較模型組低，但無顯著性差異(P>0.05)。術后15 d，跑臺訓練組mNSS評分明顯低于模型組(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠mNSS評分比較

2.2 HE染色

假手術組大鼠皮層組織結構完整，胞漿、胞核結構清晰，神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞和毛細血管形態(tài)分布正常。模型組皮層神經(jīng)細胞數(shù)量減少，胞漿、胞核界限不清，核固縮和核溶解，細胞明顯腫脹壞死。與模型組相比，跑臺訓練組神經(jīng)細胞數(shù)量增多，細胞形態(tài)相對規(guī)則，核固縮和核溶解減輕，水腫減輕。見圖1。

2.3 Western blotting

與假手術組相比，模型組缺血側皮層組織中GFAP、BDNF蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，跑臺訓練組大鼠缺血側皮層組織中GFAP、BDNF蛋白明顯升高(P<0.01)。見圖2、表2。

圖1　各組大鼠缺血側皮層組織病理學改變(HE染色，200×)

圖2　各組大鼠Western blotting檢測結果

表2　各組大鼠GFAP與BNDF蛋白表達比較

3　討論

近年來，隨著社會的進步和醫(yī)療水平的提高，腦卒中的死亡率有明顯下降趨勢，但致殘率仍居高不下，其中缺血性腦卒中占大多數(shù)，如何降低其致殘率是一大難題。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練的早期介入，可明顯提高腦卒中患者的功能恢復率，其神經(jīng)康復機制可能與激活內(nèi)源性保護機制、促進生長因子的分泌、抑制谷氨酸釋放、炎癥因子改變、減少凋亡等機制相關[7-9]。跑臺訓練作為一種經(jīng)典的運動訓練方式，能夠很好地模擬人類肢體運動訓練，與游泳、運動轉(zhuǎn)鼓、跳臺等運動方式相比，跑臺訓練可以更加精確地調(diào)控大鼠的運動負荷等。

本實驗采用mNSS評分來反映各組大鼠神經(jīng)行為方面的改變。結果顯示，假手術組大鼠神經(jīng)評分為0分，說明假手術組大鼠沒有神經(jīng)功能損傷；模型組及跑臺訓練組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，說明模型組及訓練組大鼠均有一定程度的皮質(zhì)缺血，造模較理想；跑臺訓練組經(jīng)過12 d的訓練后，mNSS評分明顯優(yōu)于模型組，且病理組織學顯示神經(jīng)細胞結構好轉(zhuǎn)，證實跑臺訓練能夠很好地促進腦缺血后受損神經(jīng)功能的恢復，這與之前的研究結果基本一致[10-12]。

神經(jīng)功能的恢復必然有其相應形態(tài)變化作為基礎，神經(jīng)干細胞再生是腦缺血損傷后神經(jīng)功能障礙恢復的基礎之一，這些增殖的神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)移到腦組織的缺血區(qū)周圍分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞[13]。星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多、分布最廣，除了營養(yǎng)、支持作用外，星形膠質(zhì)細胞還可以促進神經(jīng)修復和組織再生[14]。GFAP主要存在于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，被認為是星形膠質(zhì)細胞成熟的標志，是星形膠質(zhì)細胞特有的細胞骨架蛋白，對于維持星形膠質(zhì)細胞形態(tài)結構的穩(wěn)定起著重要作用，并決定著星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)損傷反應的程度[15-16]。GFAP在生理情況下少有表達，腦缺血時星形膠質(zhì)細胞激活，大量GFAP表達增高，對腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及神經(jīng)元存活和可塑性修復起著重要作用[17]。Lee等對腦缺血大鼠進行不同強度的運動訓練，輕中度的運動訓練能夠很好地減少腦梗死面積，增加缺血區(qū)星形膠質(zhì)細胞的表達[18]。有研究用GFAP缺失的小鼠制作腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)其對腦缺血損傷有更高的敏感性[19-20]。

本實驗通過檢測缺血皮層區(qū)GFAP表達變化，反映跑臺訓練對腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細胞的變化，實驗結果表明，腦缺血后模型組和跑臺訓練組GFAP表達明顯增多，以跑臺訓練組尤其顯著，表明經(jīng)過跑臺訓練可通過促進腦缺血組織周圍GFAP表達為受損的神經(jīng)元提供保護作用。

星形膠質(zhì)細胞對于神經(jīng)元的營養(yǎng)、修復等多種功能是通過分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子及細胞因子實現(xiàn)的，如血管內(nèi)皮生長因子、BDNF、神經(jīng)生長因子、堿性成纖維細胞生長等[21]，其中BDNF不僅在胚胎神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育和存活過程中發(fā)揮著重要作用，而且對發(fā)育成熟的神經(jīng)元功能的產(chǎn)生及維持起著重要作用[22]。在腦缺血損傷后BDNF可通過穩(wěn)定鈣離子濃度、減少自由基損傷、抑制凋亡、促進神經(jīng)元再生等方面促進損傷神經(jīng)功能的恢復[23-25]。

本實驗觀察到，經(jīng)過跑臺訓練后大鼠腦缺血皮層組織中BDNF蛋白表達較模型組升高，表明跑臺訓練可促進缺血腦組織周圍星形膠質(zhì)細胞增殖活化，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子參與神經(jīng)修復，從而起到神經(jīng)保護作用。

本研究結果表明，跑臺訓練可以促進腦缺血后GFAP和BDNF的表達，從而促進腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復。不同強度、不同頻率、不同時間的跑臺訓練作用效果如何尚需要進一步研究。

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Effects of Treadmill Training on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Brain-derived Neurotrophic Factor in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

XIE Hong-wen1, XIE Xu-guang2
1. Department of Rehabilitation Medicine, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng, Shandong 252000, China; 2. Department of Laboratory, Liaocheng Center for Disease Control and Prevention, Liaocheng, Shandong 252000, China

Correspondence to XIE Hong-wen. E-mail: xhwlfr@163.com

Abstract:Objective To explore the effect of treadmill training on expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods 30 male Wistar rats were randomly divided into sham group, model group and treadmill training group, with 10 rats in each group. The latter 2 groups were modeled with middle cerebral artery occlusion for 2 hours and reperfusion. The treadmill training group underwent treadmill exercise on the 3rd day after modeling for 12 days. Neurological function was evaluated with modified Neurological Severity Scores (mNSS). The neuronal pathological change in ischemic cortex was observed with HE staining. The expressions of GFAP and BDNF in cortex were determined by Western blotting. Results Compared with the model group, the mNSS scores decreased in the treadmill training group (F=9.931, P<0.01), the pathological damage in the ischemia cortex significantly lessened, and the expressions of GFAP (t=6.73) and BDNF (t=3.78) increased (P<0.05). Conclusion Treadmill training may increase the expression of GFAP and BDNF after cerebral ischemia-reperfusion in rats, and promote the recovery of neurological function.

Key words:treadmill training; ischemia-reperfusion; glial fibrillary acidic protein; brain-derived neurotrophic factor; rats

(收稿日期：2015-11-06修回日期：2016-01-12)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.002

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)02-0132-04