中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品的DNA條形碼鑒定＊

宮 璐，黃志海，張 靖，白俊其，蘇 賀，張曉檸，徐 文＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2.國家人類基因組北方研究中心/北京諾賽基因組研究中心有限公司/基因組學(xué)研究北京市重點實驗室 北京 100176）

中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品的DNA條形碼鑒定＊

宮 璐1，黃志海1，張 靖1，白俊其1，蘇 賀1，張曉檸2＊＊，徐 文1＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2.國家人類基因組北方研究中心/北京諾賽基因組研究中心有限公司/基因組學(xué)研究北京市重點實驗室 北京 100176）

目的：本研究應(yīng)用ITS2序列鑒定區(qū)分絡(luò)石藤及其習(xí)用品廣東絡(luò)石藤、地瓜藤、薜荔藤和扶芳藤。方法：提取以上5種中藥基原植物基因組DNA，擴增不同樣品的ITS2序列。采用隱馬爾科夫模型HMMer進行序列注釋，ClustalW法進行序列比對，K2P模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離分析，鄰接法和最大似然法構(gòu)建進化樹。結(jié)果：5個物種的ITS2序列長度各不相同，在220-243 bp之間。遺傳距離分析顯示，5個物種的最大種內(nèi)遺傳距離為0.038，最小種間遺傳距離為0.113，最大種內(nèi)遺傳距離大于最小種間遺傳距離。同時5個物種可以在進化樹上區(qū)分開來。結(jié)論：ITS2序列可以用于中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品的分子鑒定，為準確區(qū)分該類藥材提供新的技術(shù)手段。

絡(luò)石藤 鑒定 ITS2 條形碼

絡(luò)石藤是一種常見中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。2015年版《中國藥典》中收載的絡(luò)石藤為夾竹桃科植物絡(luò)石Trachelospermum jasminoides（Lindl.） Lem. 的干燥帶葉藤莖。絡(luò)石藤是一味重要的抗風(fēng)濕清熱藥，具有祛風(fēng)通絡(luò)、涼血消腫的功效，主治風(fēng)濕熱痹、筋脈拘攣、腰膝酸痛、喉痹、癰腫、跌打損傷等癥，現(xiàn)代臨床亦廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎等疾病見有風(fēng)濕熱證的治療[1]。因地方用藥習(xí)慣不同，廣東絡(luò)石藤（亦稱穿根藤，Psychotria serpens）、地瓜藤Ficus tikoua、薜荔藤F. pumila、扶芳藤Euonymus fortunei都在不同地區(qū)用作絡(luò)石藤[2，3]。這幾種中藥材在性狀上很相似，一般較難鑒別。

不同于傳統(tǒng)利用表型或化學(xué)成分對中藥的鑒定，新興的DNA條形碼技術(shù)分析物種的DNA序列信息，基于同一基因組片段序列進行不同物種的鑒定[4]。該技術(shù)已在多種動植物、微生物的鑒定中取得成功[4-6]。本研究采取DNA條形碼技術(shù)，通過序列擴增、測定得到絡(luò)石藤及其習(xí)用品廣東絡(luò)石藤、地瓜藤、薜荔藤和扶芳藤的基因組第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）序列，以其作為DNA條形碼對上述易混藥材進行區(qū)分，旨在為中藥的質(zhì)量控制及臨床安全用藥提供有效的分子鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 植物藥材

絡(luò)石、蔓九節(jié)和地果3種植物樣本采自廣東省樂昌市和廣州市，從GenBank數(shù)據(jù)庫＊＊＊下載地果、薜荔、扶芳藤3種植物的ITS2序列，共得到ITS2序列絡(luò)石14條、蔓九節(jié)18條、地果7條、薜荔7條、扶芳藤3條。詳細樣品信息見表1。

1.2 試劑和儀器

DP305植物組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：P4104）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號：20151209）；2×Taq PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號：262451AX）；β-巰基乙醇（美國sigma公司，批號：M6250）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號：T818979）； DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批號：P4219）；瓊脂（美國sigma公司，批號：V900500）；Tris（美國sigma公司，批號：V900483）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，其余試劑均為分析純。

小型離心機（德國eppendorf公司，型號：5418）； PCR擴增儀ProFlex PCR system（美國Life Technologies公司，型號：ProFlex）；多功能垂直旋轉(zhuǎn)混合器（英國Grant公司，型號：PTR-30/PTR-60）；水平電泳槽（美國Bio-Rad公司，型號：Mini-Sub Cell GT）；GelDoc凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號：GelDoc XR+）；多功能樣品均質(zhì)器（法國Bertin Technologies公司，型號：Precellys 24）；NanoDrop 2000c微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司，型號：NanoDrop 2000c）。

1.3 ITS2序列分析

1.3.1 模板DNA的制備

稱取干燥植物30 mg于滅菌的2 mL離心管中，加入直徑6 mm的小鋼珠一個，使用樣品均質(zhì)器Precellys 24將植物材料研碎成粉末。采用植物基因組DNA提取試劑盒進行植物DNA的提取，提取步驟按說明書所示。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性，Nanodrop 2000c檢測DNA的濃度和純度。

1.3.2 PCR擴增及測序

以提取的植物基因組DNA為模板，采用通用引物ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，ITS3R：GACGCTTCTCCAGACTACAA，進行ITS2序列擴增。PCR擴增體系為：2×Taq PCR Mix 12.50 μL，正向引物（2.5 μM）1.00 μL，反向引物（2.5 μM）1.00 μL，ddH2O 8.5 μL，模板（基因組DNA＜0.1 g）2.00 μL；PCR擴增條件為：94℃變性5 min；94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃、10 min。擴增產(chǎn)物大小約500 bp，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測為明亮、單一條帶后于上海美吉生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.3.3 序列分析

運用CodonCode Aligner軟件（美國Codon公司）對測得序列進行質(zhì)量檢測和拼接。拼接后序列基于隱馬爾科夫模型HMMer進行ITS2序列注釋，注釋過程在ITS2網(wǎng)站完成＊＊ http∶//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/[7]。采用ClustalW法進行序列比對，序列特征分析使用BioEdit軟件完成。MEGA6軟件進行遺傳距離分析和進化樹構(gòu)建。基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離。采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum-Likelihood, ML）構(gòu)建進化樹，自展法（Bootstrap）檢驗重復(fù)1 000次[8,9]。

表1 待分析樣品信息

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列特征

同一物種的多條序列經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)：①絡(luò)石ITS2序列長度為222 bp，未見有變異位點，A、T、C、G 4種堿基的含量分別為19.37%、19.37%、31.98%、29.28%；②蔓九節(jié)ITS2序列長度為235-236 bp，有變異位點8個，分別為21、73、80、220位點的T/C突變，51、210位點的A/G突變，125位點的A/T突變、223T，序列的GC含量為58.72%-60.17%；③地果ITS2序列長度為240-243 bp，有變異位點7個，分別為34位點的A/C突變、35A/T突變，67、164位點G堿基的插入/缺失，73、169位點的A/G突變，232位點的T堿基插入/缺失，序列的GC含量為67.08%-67.36%；④薜荔ITS2序列長度為238-239 bp，有變異位點6個，70、124位點的A/G突變、199位點的C/T突變、220位點的C/G突變、233位點的A/T突變、239位點G堿基的插入/缺失，序列的GC含量為70.13%-70.71%；⑤扶芳藤ITS2序列長度為220-221 bp，有變異位點6個，99位點的C/T突變，125位點的T/G突變，160、188位點的C/G突變，185位點G堿基的缺失，189位點的A/G突變，序列的GC含量為73.64%-75.11%。詳見表2。

2.2 遺傳距離分析

K2P模型對ITS2序列的分析顯示，5種植物的種內(nèi)遺傳距離為0.000-0.038，平均種內(nèi)遺傳距離為0.012，其中薜荔的最大種內(nèi)遺傳距離最大，為0.038，扶芳藤的平均種內(nèi)遺傳距離最大，為0.027（表3）；5種植物的種間遺傳距離為0.113-0.648，同科同屬植物薜荔和地果的最小種間遺傳距離最小，薜荔和蔓九節(jié)的最大種間遺傳距離最大（表3）。經(jīng)統(tǒng)計，5種植物的平均種間遺傳距離為0.429。絡(luò)石、蔓九節(jié)、地果、薜荔、扶芳藤5種植物的種內(nèi)遺傳距離遠遠小于兩兩物種間的種間遺傳距離（表4）。

2.3 進化樹的構(gòu)建

由絡(luò)石、蔓九節(jié)、地果、薜荔、扶芳藤5種植物共49條序列構(gòu)建的NJ和ML進化樹顯示，兩種方法的建樹結(jié)果相一致：全部序列明顯分為4大支（支持度98%-100%），薜荔和地果為一支，絡(luò)石、蔓九節(jié)、扶芳藤各聚為一支。雖然同屬?？崎艑俚霓道蠛偷毓H緣關(guān)系最近，同在一大支，盡管如此，二者的不同樣品仍各聚在一起，表現(xiàn)出單系性。因此對于這5個物種，ITS2可以很好的將其區(qū)分開。詳見圖1、圖2。

3 討論

薜荔藤作為絡(luò)石藤有很長的藥用歷史，早在唐代《新修本草》與明代《本草綱目》中就有記載，現(xiàn)在中國南方大部分省區(qū)仍習(xí)慣將薜荔藤作為藥用絡(luò)石藤[2]。地瓜藤曾在貴州部分地區(qū)用作絡(luò)石藤，扶芳藤在長江以北的河南、山東、陜西等地作為絡(luò)石藤入藥[3]。廣東地區(qū)則一直以廣東絡(luò)石藤代替絡(luò)石藤使用[10]。為了明確區(qū)分不同的入藥藥材，鄭善榮[2]對絡(luò)石藤及其易混品其進行了鑒別和性狀描述，張電光等[11]測定了紫外吸收光譜，謝潔行等[3]應(yīng)用絡(luò)石藤含牛蒡甙在紫外照射下顯綠色熒光的特性對其進行鑒定。

表2 中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品的ITS2序列特征

表3 基于ITS2序列變異的絡(luò)石藤及其易混品的種內(nèi)遺傳距離

表4 基于ITS2序列變異的絡(luò)石藤及其易混品的種間遺傳距離

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的中藥絡(luò)石藤及其易混品的NJ進化樹

ITS2序列是中藥鑒定領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且被證實是在多種中藥材鑒定中通用性、有效性較高的DNA序列片段[5,12]。本文首次應(yīng)用ITS2條形碼技術(shù)對中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品進行鑒定，結(jié)果顯示，絡(luò)石、蔓九節(jié)、地果、薜荔、扶芳藤5種中藥基原植物的ITS2序列長度不同，遺傳距離分析結(jié)果表明，種間遺傳距離遠大于種內(nèi)遺傳距離，NJ和ML進化樹圖也可將5個物種區(qū)分開。因此，ITS2序列可以對中藥絡(luò)石藤及其習(xí)用品廣東絡(luò)石藤、地瓜藤、薜荔和扶芳藤進行有效鑒定，為該類藥材的區(qū)分鑒定提供了新的技術(shù)手段。本文薜荔和地果顯示出較近的親緣關(guān)系，可以嘗試使用psbA-trnH等其他條形碼[13]，對二者進行進一步的區(qū)分。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的中藥絡(luò)石藤及其易混品的ML進化樹

相較于傳統(tǒng)的表型鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)不依賴肉眼觀察，更為客觀和準確，尤其對于加工處理后的中藥材，可以高效地完成其鑒定。與光譜等鑒定方法相比，DNA條形碼檢測的是DNA序列，不受植物在不同環(huán)境下表型變異的影響，其穩(wěn)定性遠高于化學(xué)成分的檢測，使得鑒定結(jié)果更為穩(wěn)定，通用性更高。為解決中藥歷史遺留的“同名異物、同物異名”問題，應(yīng)在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代DNA條形碼技術(shù)對中藥進行鑒定。為每一種中藥材貼上自身獨特的“DNA條形碼”標簽使得中藥的選用將更為精準與便捷，從而提高臨床療效，造?；颊?。

參考文獻

1 李金生,張茜,張濤,等.中藥絡(luò)石藤的研究進展.河北中醫(yī)藥學(xué)報, 2016, 31(2): 55-58.

2 鄭善榮.絡(luò)石藤及其混淆品種的鑒別.蛇志, 2007, 19(2): 166-167.

3 謝潔行,王子薇,劉艷驕.絡(luò)石藤常見混淆品紫外熒光的鑒別方法.吉林中醫(yī)藥, 1997, 23(5): 38.

4 Hebert P D N, Ratnasingham S, Waard J R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc London Ser B, 2003, 270: S96-S99.

5 Chen S, Yao H, Han J, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. Plos One, 2010, 5(1): e8613-e8613.

6 Summerbell R C, Lé vesque C A, Seifert K A, et al. Microcoding: The second step in DNA barcoding. Philos Trans R Soc B Biol Sci, 2005, 360(1462): 1897-1903.

7 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430 (1-2): 50-57.

8 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very larger phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl AcadSci USA, 2004, 101 (30): 11030-11035.

9 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihyood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

10 伍月紅,劉柏英.廣東習(xí)用中藥材品種鑒定和質(zhì)量分析.時珍國醫(yī)國藥, 2005, 16(9): 941-942.

11 張電光,羅集鵬.中藥絡(luò)石藤的紫外光譜法鑒別.中藥材, 2000, 32(2): 78-79.

12 陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2011, 13(5): 747-754.

13 韓建萍,宋經(jīng)元,姚輝,等.中藥材DNA條形碼鑒定的基因序列比較.中國中藥雜志, 2012, 37(8): 1056-1061.

Identification of Traditional Chinese Medicine Trachelospermum Jasminoides and Its Customary Supplies Using DNA Barcoding

Gong Lu1, Huang Zhihai1, Zhang Jing1, Bai Junqi1, Su He1, Zhang Xiaoning2, Xu Wen1
(1. The 2ndClinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Chinese National Human Genome Center / SinoGenoMax Co., Ltd. / Beijing Key Laboratory of Genomics, Beijing 100176, China)

This study aimed to distinguish T. jasminoides from Psychotria serpens, Ficus tikoua, Ficus pumila and Euonymus fortune. In the study, DNAs from the original plants were extracted, and sequences of internal transcribed spacer 2 (ITS2) were amplified. Hidden Markov model (HMMer) was adopted to annotate the sequences which were aligned with ClustalW method. Interspecific and intraspecific genetic distances were calculated based on K2P model. Finally, Neighbor-joining (NJ) and Maximumlikelihood (ML) phylogenetic trees were built. As a result, it was found that the sequence length of ITS2 varied from 220 bp to 243 bp. The longest interspecific genetic distance was 0.038, while the shortest intraspecific genetic distance 0.113. The five species were distinguishable in the evolutionary tree. In conclusion, ITS2 barcoding, a new technique for the identification of the five Chinese materia medica was provided, promoting its application in the field of Chinese traditional medicine with strategic significance.

Trachelospermum jasminoides, identification, internal transcribed spacer 2, DNA barcoding

10.11842/wst.2016.08.028

R282

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-07-29

修回日期：2016-08-10

＊ 國家自然基金委青年科學(xué)基金項目（81402887）基于組合質(zhì)譜技術(shù)與代謝組學(xué)方法的中藥何首烏體內(nèi)物質(zhì)作用組群與肝毒性研究，負責人：徐文；廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計劃（2013B021800236）基于代謝組學(xué)的附子毒性研究，負責人：徐文；廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA 條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負責人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：張曉檸，助理研究員，研究方向：分子生物學(xué)；徐文，副研究員，主要研究方向：中草藥質(zhì)量控制。

＊＊＊ http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/