耳草屬嶺南藥材DNA分子鑒定研究＊

黃 娟，李西文，徐 文，丘小惠，徐 江＊＊，黃志海＊＊

（1. 廣東省中醫(yī)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

耳草屬嶺南藥材DNA分子鑒定研究＊

黃 娟1，李西文2，徐 文1，丘小惠1，徐 江2＊＊，黃志海1＊＊

（1. 廣東省中醫(yī)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：本研究應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對9種廣東耳草屬藥材進(jìn)行鑒定研究。方法：收集廣東耳草屬藥材樣本，通過植物基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增以及產(chǎn)物的雙向測序獲得ITS2序列，所得序列采用CodonCode Aligner進(jìn)行拼接。用MEGA 6.06進(jìn)行比對，分析種內(nèi)和種間遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果：9種耳草屬植物65條序列長度范圍為208-224 bp，共有92個堿基變異位點，種內(nèi)遺傳距離（0.002）明顯小于種間遺傳距離（0.202）。NJ和ML聚類樹結(jié)果基本一致，除耳草與金毛耳草關(guān)系較近難以區(qū)分外，其余7個物種種內(nèi)樣本分別聚在一支，表現(xiàn)出單系性。結(jié)論：ITS2序列基本能夠準(zhǔn)確的鑒定廣東耳草屬藥材，可作為耳草屬藥材基原植物鑒定的候選條形碼序列。

耳草屬 ITS2序列 分子鑒定 DNA條形碼

耳草屬Hedyotis隸屬于茜草科Rubioideae，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，少數(shù)分布至溫帶?！吨袊参镏尽酚涊d耳草屬植物主要分布于長江以南各省區(qū)，其中以廣東省居多[1]。耳草屬植物在嶺南民間多作為中草藥來防病治病。據(jù)統(tǒng)計，在廣東地區(qū)藥用耳草屬植物約有20種[2]，其中白花蛇舌草、傘房花耳草、金草、牛白藤、雙花耳草、長節(jié)耳草、金毛耳草等分布較廣，使用較多[2-4]。近年來，已有多種耳草屬藥材開發(fā)成制劑，其中，白花蛇舌草注射液已推廣到國內(nèi)多個廠家生產(chǎn)[5]，金毛耳草是腸炎寧制劑的主藥[1]。

由于中藥材市場的混亂以及民間使用習(xí)慣、一藥多名、異藥同名等原因，造成中藥材品種混亂。同時因藥材形態(tài)特征有限，尤其是同屬藥材，難以從外觀上準(zhǔn)確快速鑒定，造成嚴(yán)重的混偽品誤用現(xiàn)象。如：市售白花蛇舌草偽品主要來源于傘房花耳草及纖花耳草，個別地區(qū)甚至把傘房花耳草直接作為白花蛇舌草來使用[4，5]。因此正確鑒定同屬植物有利于確保臨床用藥的安全有效。

DNA條形碼技術(shù)是近年來生物分類及鑒定的研究熱點[6]。2010年，Chen等[7]發(fā)現(xiàn)ITS2序列在物種水平的鑒定效率高達(dá)92.7%，適用于中藥材等存在DNA降解的材料，并提出把ITS2作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列，現(xiàn)該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。該序列在種屬水平的變異度較大，適用于物種分類與系統(tǒng)的進(jìn)化、藥材真?zhèn)舞b別、藥材基原探索等研究[8-10]。因此，本文將選用9種耳草屬常用藥材，采用ITS2序列作為DNA條形碼對其進(jìn)行鑒定，為耳草屬藥材的物種準(zhǔn)確及快速鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗采集白花蛇舌草、牛白藤、耳草、鼎湖耳草及傘房花耳草等5個物種共51份樣本（圖1），材料經(jīng)廣東省中醫(yī)院黃志海主任藥師鑒定，憑證標(biāo)本保存于廣東省中醫(yī)院。此外，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得同屬物種序列14條用于物種鑒定分析。樣本具體信息見表1。

1.2 試劑和儀器

DDP305植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：P4104）；D 2000 DNA Marker（日本TaKaRa 公司，批號：P4219）；Glodview核酸染料（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號：20151209）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，批號：T818979）；Tris（美國sigma公司，批號：V900483）；β-巰基乙醇（美國sigma公司，批號：M6250）；瓊脂（美國sigma公司，批號：V900500）；引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成，2×Tap PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司，批號：262451AX）；其余試劑均為分析純。

Thermal Cycler PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號：2720）；電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY-8C）；凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，型號：JY04S-3C）；小型離心機(jī)（德國Sigma公司，型號：1-14）；混合儀（北京市大龍興創(chuàng)儀器有限公司，型號：MX-RL-E）。

1.3 方法

選取干燥的植物根莖40 mg或葉片30 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：2×Taq PCR Mix酶 12.5 μL，正向、反向引物各1 μL（2.5 μmol·L-1），模板DNA 2.0 μL（約30-100 ng），加ddH2O補足至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（40個循環(huán)）；72℃、10 min[10]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將清晰、明亮、單一電泳條帶所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列采用CodonCode Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列[12]。利用軟件MEGA 6.06分析比對，同時基于K2P模型進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹（Neighbor-Joining，NJ）及ML樹（Maximum Likehihood，ML）[13,14]。同時，利用相似性搜索法BLAST對序列鑒定能力進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS2序列變異分析

圖1 樣本基原植物圖

應(yīng)用MEGA 6.06分析耳草屬9個物種的65條ITS2序列特征（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)耳草屬物種種內(nèi)變異位點較少。牛白藤序列長度均為217 bp，有1個變異位點，為195位點A/C突變；耳草序列長度均為217 bp，種內(nèi)存在4個變異位點，分別為156位點C/ T突變、187位點C/G突變、196位點A/G突變、210位點A/C突變；鼎湖耳草長度為207-208 bp，比對后為208 bp，有2個變異位點，分別為14位點堿基C的插入/缺失、166位點A/C突變；傘房花耳草序列長度均為213 bp，有1個變異位點，為121位C/T突變；白花蛇舌草序列長度均為214 bp，有1個變異位點，為173位G/T突變；金毛耳草序列長度均為215 bp，有2個變異位點，為24和80位點C/T突變；金草長度均為207 bp，有2個變異位點，分別為31位點C/T突變、92位點A/T突變；雙花耳草對比后序列長度為221 bp，種內(nèi)無變異位點；纖花耳草對比后序列長度為224 bp，有3個變異位點，分別為25位點A/C突變、78位點G/T突變、187位點C/T突變。所有序列比對后長度233 bp，GC含量為61.03%-68.66%，共有92個堿基變異位點。結(jié)果表明，耳草屬物種ITS2序列種間變異位點較多，易于區(qū)分各基原物種。詳見表2。

表1 耳草屬嶺南藥材的樣本信息

表2 耳草屬嶺南藥材的ITS2序列信息

藥材白花蛇舌草，發(fā)現(xiàn)偽品主要是傘房花耳草及其他不同屬物種，且正品與偽品間容易區(qū)分。本文利用MEGA 6.06軟件分析該藥材同屬混偽品植物傘房花耳草及纖花耳草，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草與傘房花耳草種內(nèi)均只有一個變異位點，而兩種藥材間變異位點有40個；纖花耳草種內(nèi)變異位點有3個，與白花蛇舌草比對后有25個變異位點。該結(jié)果進(jìn)一步說明ITS2序列能夠?qū)Π谆ㄉ呱嗖菟幉幕靷纹愤M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

綜上，本文選用ITS2序列作為DNA條形碼鑒別耳草屬藥材，突破了依靠經(jīng)驗及受植物形態(tài)、生長年限和藥用部位等影響的傳統(tǒng)鑒定方法，具有準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性高、操作簡便的優(yōu)勢，基本適用于耳草屬藥材的鑒別。鑒于個別物種間差異較小，可選取其他DNA條形碼序列，如psbA-trnH、rbcl、matk等基因序列進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，為臨床用藥提供準(zhǔn)確可靠的鑒定依據(jù)及手段。

圖2 基于ITS2序列的9種耳草屬藥材的NJ樹

圖3 基于ITS2序列的9種耳草屬藥材ML樹

1 常穎.廣東耳草屬分類學(xué)研究.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2012: 3-4.

2 王發(fā)國,葉華谷.廣東省耳草屬藥用植物資源.中藥材, 2003, 26(8): 547-548.

3 張秋燕,張福平.粵東地區(qū)茜草科藥用植物資源研究.中醫(yī)藥臨床雜志, 2015, 27(6): 857-861.

4 袁青梅,張發(fā)廣,王興,等.我國耳草屬植物的種類與分布.云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2004, 26(S1): 166-170.

5 閆嵩,任偉超,鄭希龍,等.市售白花蛇舌草藥材的DNA條形碼鑒定研究.中國現(xiàn)代中藥, 2015, 17(10): 1014-1019.

6 Hebert P D, Ratnasingham S, deWaard J R, et al. Barcoding animal life: Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely relatedspecies. Proc Biol Sci, 2003(270): 96-99.

7 Chen S, Yao H, Han J, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One, 2010, 5(1): e8613.

8 Yao H, Song J, Liu C, et al. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals. PLoS One, 2010, 5(10): e13102.

9 陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列.北京:科學(xué)出版社, 2015: 6-14.

10 Gao T, Yao H, Song J, et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2. J Ethnopharmacol, 2010, 130(1): 116-121.

11 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則.中國中藥雜志, 2013, 38(2): 141-147.

12 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430 (1-2): 50-57.

13 Tamura K, Nei M, Kumar S. Prospects for inferring very larger phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(30): 11030-11035.

14 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihyood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

Molecular Identification ofHedyotisMedicinal Plants in Guangdong Province Using DNA Barcode

Huang Juan1, Li Xiwen1, Xu Wen1, Qiu Xiaohui1, Xu Jiang2, Huang Zhihai1
(1. Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Institute of Chinese Material Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

ITS2 sequence was taken as a DNA barcode to identify Hedyotis medicinal plants in Guangdong Province. Samples from Hedyotis were collected and the ITS2 regions were amplified and sequenced. The sequences were assembled by CodonCode Aligner and analyzed by MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were computed, while the phylogenetic tree was built using the neighbor-joining (NJ) and test maximum likelihood (ML) models. It was found that the length of ITS2 region varied from 208-224 bp with 92 variable sites. The intraspecific distance (0.002) was much shorter than the interspecific distance (0.202). The outputs of NJ tree chimed with that of ML tree. Apart from the indistinguishability between Hedyotis and H. chrysotricha in the NJ and ML trees, the other samples of the seven species were clustered to one branch respectively, featuring monophyly. In conclusion, the ITS2 sequence provided the molecular evidence behind the identification of the nine species of Hedyotis medicinal plants in Guangdong Province and could be treated as an ideal DNA barcode for identifying species of Hedyotis medicinal materials.

Hedyotis, ITS2, molecular identification, DNA barcode

10.11842/wst.2016.08.026

R282

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-07-28

修回日期：2016-08-10

＊ 廣東省中醫(yī)院院內(nèi)專項（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：徐江，助理研究員，主要研究方向：中藥分子生物學(xué)研究；黃志海，主任藥師，主要研究方向：中藥資源與中藥鑒定研究。