柴胡醇提物抗肝纖維化藥效及伴隨毒副作用研究＊

孫曉倩，黃娜娜，竇立雯，李曉宇，孫 蓉＊＊

（1. 山東省中醫(yī)藥研究院 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355）

柴胡醇提物抗肝纖維化藥效及伴隨毒副作用研究＊

孫曉倩1，2，黃娜娜2，竇立雯2，李曉宇1，孫 蓉1＊＊

（1. 山東省中醫(yī)藥研究院 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355）

目的：研究柴胡醇提物對肝纖維化大鼠模型的保護(hù)作用及伴隨毒副作用，為柴胡“功效—毒性”相關(guān)性研究提供實驗數(shù)據(jù)。方法：通過給予高脂、酒精刺激和豬血清等造成大鼠肝纖維化模型，同時給予不同劑量的柴胡醇提物和陽性藥，觀察其在發(fā)揮藥效作用時的伴隨毒副作用，同時觀察大鼠一般情況、體質(zhì)量、日攝食量、日飲水量、證候積分，檢測大鼠血中ALT、AST、HA、LN、IV-C、PCIII、TGF-β1、BUN、Cr指標(biāo)的含量，計算主要臟器系數(shù)并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：連續(xù)給予0.90-3.60 g·kg-1的柴胡醇提物可改善大鼠飲食、飲水和活動情況，明顯降低肝纖維化大鼠血中HA、LN、IV-C、PCIII等指標(biāo)含量和肝臟系數(shù)，病理組織學(xué)改變減輕。但血ALT、AST水平出現(xiàn)柴胡高劑量反跳升高、血BUN、Cr水平增高。結(jié)論：柴胡醇提物可以明顯改善大鼠肝纖維化程度，且量效關(guān)系良好，同時3.60 g·kg-1的柴胡醇提物會產(chǎn)生一定的肝臟、腎臟的伴隨毒副作用，尤其肝臟為重。

柴胡 醇提物 肝纖維化 大鼠 毒副作用

柴胡為傘形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，具有解表退熱、疏肝解郁、升舉清氣的功效，臨床常用于治療寒熱往來、感冒發(fā)熱、肝郁氣滯、月經(jīng)不調(diào)、胸脅疼、氣虛下陷、久瀉脫肛等癥[1]。柴胡化學(xué)成分種類復(fù)雜，主要包括皂苷類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類等[2]，各類成分均具有廣泛的藥理作用?，F(xiàn)代研究表明，柴胡及其有效成分柴胡皂苷有解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗脂肪肝、抗肝損傷、利膽、降轉(zhuǎn)氨酶、興奮腸平滑肌、抑制胃酸分泌、抗?jié)儭⒁种埔鹊鞍酌傅茸饔肹3,4]。臨床上常使用含柴胡的湯劑如小柴胡湯、柴胡疏肝散等[5,6]治療肝纖維化，效果顯著。柴胡雖被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，但在歷年使用過程中亦出現(xiàn)一定的毒副作用，葉天士提出“柴胡劫肝陰”，引起學(xué)者重視。近年來，臨床上出現(xiàn)使用柴胡導(dǎo)致患者出現(xiàn)血膽紅素、氨基轉(zhuǎn)移酶異常、頭暈?zāi)垦５炔涣挤磻?yīng)的報道。

本實驗室前期研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，北柴胡醇提組分小鼠急性毒性MTD為75.2 g·kg-1，長期、大量給予柴胡醇水提物可導(dǎo)致大鼠肝毒性損傷，主要表現(xiàn)為血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）增高，血中和肝組織內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量增加，同時超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽（L-Glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-Px）活性下降；血中總巰基（-SH）含量下降。柴胡中皂苷d成分具有較好的抗肝纖維化的藥效[9]。但是，在長期用藥中亦出現(xiàn)肝毒性損傷，其損傷途徑可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[8]，目前尚未有柴胡關(guān)于發(fā)揮藥效與毒性的劑量范圍研究與報道。故本研究采用實驗室前期建立的高脂、酒精、豬血清等復(fù)合因素建立適合中藥藥效評價的肝纖維化動物模型[10]，進(jìn)行柴胡醇提取物抗肝纖維化藥效及伴隨毒副作用研究，進(jìn)一步闡明柴胡醇提物的抗纖維化藥效伴隨毒副作用的發(fā)生劑量、作用機(jī)制，明確其伴隨毒副作用與抗肝纖維化藥效的關(guān)系，以期為柴胡的臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試劑

PL303精密電子天平（梅特勒·托利多有限公司），YP20001電子天平（上海上天精密儀器有限公司），UV2600 紫外分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司），Multiskan Go-1510全波長酶標(biāo)儀（中國賽默飛世爾科技有限公司），PL303電子天平（瑞士梅特勒托利多有限公司），HH-S 恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），TDZ5- WS 臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。ALT、AST、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，Cr）（南京建成生物科技有限公司，批號：20150103、20150103、20150215、20150321），透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA）、層粘連蛋白（Laminin，LN）、III型前膠原（Precollagen，PCIII）、IV型膠原（IV-C）、轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Growth Factor，TGF-β1）ELISE試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號：201412、201412、201412、201412、201412）。標(biāo)準(zhǔn)豬血清（上海億欣生物科技有限公司，批號：20121214），食用酒精為市售紅星二鍋頭（52°），臨用時用蒸餾水稀釋成所需濃度，膽固醇（上海源聚生物科技有限公司）。

1.2 試藥與藥材

陽性對照藥物秋水仙堿片（云南植物藥業(yè)有限公司，批號：20130901）在用前配制成0.018 g·L-1水溶液。陽性中藥對照復(fù)方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司，批號：20131209）在用前配制成0.108 g·L-1水溶液。

柴胡藥材購自河北省安國藥材批發(fā)市場，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員進(jìn)行品種鑒定為傘形科植物北柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，批號：20140923，已根據(jù)2010版《中國藥典》柴胡項下要求進(jìn)行檢查，符合各項規(guī)定。

柴胡醇提物的制備：精確稱取900 g柴胡，加入10倍量60%乙醇提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，回收乙醇至無乙醇味，濃縮至200 mL，即得。含生藥量4.5 g·mL-1，臨用時用蒸餾水稀釋成所需濃度的混懸液。其中柴胡皂苷a在生藥量中的含量為0.087%，柴胡皂苷d在生藥量中的含量為0.046%，含量測定方法[11]參照2010版《中國藥典》。

1.3 實驗動物

SPF級Wistar大鼠70只，雄性，體質(zhì)量（260-320 g），適齡、健康，共70只。購于山東大學(xué)實驗動物中心。動物合格證編號：SCXK（魯）20130001。實驗動物配合飼料（鼠），生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20130014。

2 方法

2.1 分組與給藥

根據(jù)大鼠體質(zhì)量，將70只實驗動物隨機(jī)分為7組，每組10只，即正常對照組、模型對照組、柴胡醇提物高、中、低劑量組和陽性藥（秋水仙堿片組、復(fù)方鱉甲軟肝片）組。6組造模組實驗動物在造模第一天開始分組給藥，正常對照組灌胃蒸餾水，各組均按10 mL·kg-1給藥，連續(xù)給藥21天。

2.2 模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)研究[12]，對肝纖維化造模方法進(jìn)行適當(dāng)改善，對6組造模組實驗動物采用復(fù)合因素造成大鼠肝纖維化模型，連續(xù)造模3周。造模方法如下：①大鼠腹腔注射經(jīng)過濾、滅菌處理的新鮮豬血清0.5 mL，每周2次。②以89.5%單純玉米粉加10%豬油、0.5%膽固醇制成高脂低蛋白飼料飼養(yǎng)。③第1周每天10%乙醇灌胃，第2-3周以5%乙醇灌胃。

2.3 樣本采集與檢測

實驗期間，分別于藥后第0、1、6、11、16、21天觀察大鼠一般情況，并進(jìn)行體質(zhì)量、日食量、日水量的測定。第21天藥后2 h，對各組大鼠眼眶取血，3 500 rpm離心10 min，離心溫度為25℃，取上清，檢測血清中ALT、AST、BUN、Cr、LN、HA、PCIII、IV-C、TGF-β1等指標(biāo)的水平。處死大鼠，取肝、脾、胸腺，稱重，計算臟器系數(shù)，公式如下。

取大鼠相同部位肝組織固定于10%中性福爾馬林液內(nèi)，做肝組織馬松染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。對肝組織形態(tài)進(jìn)行病理分級、積分：肝組織正常，無膠原纖維增生（I），0分；膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍輕度向外延伸（II），1分；膠原纖維延伸明顯（III），2分；膠原纖維包繞/分割肝小葉以至正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞（IV），3分；肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，肝內(nèi)布滿小圓形假小葉，假小葉內(nèi)有粗大增生的膠原纖維（V），4分。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為數(shù)據(jù)統(tǒng)計有顯著性差異，P＜0.001為數(shù)據(jù)統(tǒng)計有非常顯著性差異，P＜0.05為數(shù)據(jù)統(tǒng)計有極顯著性差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 柴胡醇提物對大鼠一般情況的影響

實驗過程中，正常對照組大鼠的精神狀態(tài)良好，活動迅速，眼睛有神，飲食糞便正常，皮毛光澤、柔順，體質(zhì)量逐漸增加，無異常狀態(tài)出現(xiàn)。模型對照組大鼠精神狀態(tài)不佳，精神倦怠，自發(fā)活動減少，身體軟弱無力，眼睛無光彩，被毛蓬亂發(fā)黃，腹部膨脹，糞便稀溏，部分不成形，飲食飲水減少，體質(zhì)量增長緩慢。柴胡醇提高、中、低劑量組能明顯改善大鼠癥狀，且具有一定的劑量依賴關(guān)系，但是在連續(xù)給予柴胡醇提高劑量組16天后，大鼠會出現(xiàn)怠動，體質(zhì)量增長緩慢、飲食飲水降低等癥狀。

3.2 柴胡醇提物對大鼠體質(zhì)量的影響

如表1所示，與正常對照組比較，給藥11天后，模型對照組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），給藥16天后，模型對照組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提中、低劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），給藥21天后，模型對照組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.001），柴胡醇提高、中劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），柴胡醇提低劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，給藥16天后，柴胡醇提高、中劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），給藥21天后，柴胡醇提高、中劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05）。說明采用復(fù)合因素造模方法會使大鼠的體質(zhì)量增長緩慢，灌胃給予不同劑量的柴胡醇提物可以改善大鼠體質(zhì)量增長情況，并呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。

3.3 柴胡醇提物對大鼠日食量、日水量的影響

如表2所示，與正常對照組比較，給藥11天、16天后，模型對照組大鼠的日食量顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠的日食量顯著降低（P＜0.05），給藥21天后，模型對照組大鼠的日食量顯著降低（P＜0.001），柴胡醇提高、中劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠的日食量顯著降低（P＜0.05），柴胡醇提低劑量組大鼠的日食量顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，給藥16天后，柴胡醇提高劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠的日食量增加（P＜0.05），給藥21天后，柴胡醇提高、中劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠的日食量增加（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠的日食量增加（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，柴胡醇提物能顯著提高模型大鼠的日食量，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。

如表3所示，與正常對照組比較，給藥16天后，模型對照組大鼠的日水量顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提高、中、低劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠的日水量顯著降低（P＜0.05），給藥21天后，模型對照組大鼠的日水量顯著降低（P＜0.001），柴胡醇提中低劑量組大鼠的日水量顯著降低（P＜0.05），柴胡醇提低劑量組大鼠的日水量顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，給藥16天后，柴胡醇提高劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠的日水量增加（P＜0.05），給藥21天后，柴胡醇提高劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠的日水量增加（P＜0.01），柴胡醇提中、低劑量組大鼠的日水量增加（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，柴胡醇提物能顯著提高模型大鼠的日水量，并呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。

表1 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

表1 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常對照組—294.2±16.7 298.7±18.0 318.3±16.2 347.2±17.3 374.7±15.3 405.1±16.1模型對照組—295.4±16.1 299.3±16.2 304.0±17.8 323.5±17.5*349.1±15.7**366.2±19.6***柴胡醇提高劑量組3.60 291.3±11.7 294.9±11.4 308.5±13.2 335.1±10.5 360.4±8.2#382.3±12.6*##柴胡醇提中劑量組1.80 288.5±17.8 292.2±18.2 305.9±11.4 331.3±12.8 357.5±14.8*#376.6±16.6*##柴胡醇提低劑量組0.90 291.1±14.2 295.3±14.3 304.7±17.6 326.4±16.6 353.7±18.0*370.0±16.2**#復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 290.6±20.7 293.4±19.6 309.8±23.8 330.1±19.6 358.8±19.7#381.3±15.4*##秋水仙堿組0.18 294.4±215.0 300.1±14.0 312.5±18.8 335.3±19.8 360.1±16.7#384.7±14.4*##

表2 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠日食量的影響（s，n=10）

表2 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠日食量的影響（s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常對照組—24.4±0.5 26.1±0.8 28.2±1.2 29.3±0.8 33.1±0.5 34.6±1.6模型對照組—24.1±0.2 24.3±0.8 25.1±0.2 26.5±1.0*29.1±0.4**30.0±1.5***柴胡醇提高劑量組3.60 24.0±0.1 23.2±1.5 26.9±0.7 28.4±0.2 31.2±0.5#32.4±1.8*##柴胡醇提中劑量組1.80 24.0±1.0 24.1±1.3 25.9±0.8 27.5±0.5 30.6±0.8 33.1±2.1*##柴胡醇提低劑量組0.90 23.9±1.1 23.3±1.1 25.4±1.3 27.2±1.3*29.6±1.9*32.1±2.8**#復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 23.9±0.7 22.4±0.6* 24.6±0.2 28.0±0.8 30.8±0.4#32.6±1.0*##秋水仙堿組0.18 24.0±1.2 24.2±0.7 25.4±1.8 28.8±0.3 31.1±0.2#33.5±0.4*##

表3 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠日水量的影響（±s，n=10）

表3 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠日水量的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常對照組—29.7±1.1 29.6±1.2 32.7±1.0 33.6±1.1 38.4±2.0 44.3±7.3模型對照組—30.1±1.2 30.2±1.0 31.0±0.8 31.8±0.9 32.8±0.8**36.0±6.6***柴胡醇提高劑量組3.60 28.7±1.6 29.3±1.4 30.3±1.2 32.4±0.1 35.0±0.2*#42.2±2.0##柴胡醇提中劑量組1.80 29.6±1.3 29.9±0.2 31.1±1.1 32.3±0.6 34.2±1.3*39.7±1.3*#柴胡醇提低劑量組0.90 29.6±1.4 29.9±0.9 30.4±0.5 31.8±0.7 33.0±0.7*37.6±4.2**#復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 30.8±1.1 31.4±0.3 31.4±0.1 32.2±0.2 35.1±0.9*#42.2±1.7##秋水仙堿組0.18 29.8±1.2 30.7±2.1 31.5±2.0 31.8±1.6 35.9±1.3*#43.1±2.3##

3.4 柴胡醇提物對大鼠中醫(yī)證候積分的影響

如表4所示，根據(jù)肝郁證大鼠證候積分表[10]，對各組大鼠的癥狀進(jìn)行觀察、積分。正常組大鼠活動正常，飲食飲水正常，未見明顯異常行為，造模組大鼠出現(xiàn)倦怠、眼睛無神、呼吸急促、腹部腫脹，耳朵、尾部有瘀斑等，與正常對照組比較，給藥1天后，模型對照組和柴胡醇提低劑量組大鼠的證候積分升高（P＜0.05），給藥6天、11天、16天、21天后，各組大鼠的證候積分升高（P＜0.001）；與模型對照組比較，給藥6天后，柴胡醇提高、中劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠的證候積分降低（P＜0.05），秋水仙堿組大鼠的證候積分降低（P＜0.01），給藥11天后，柴胡醇提高、中劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠的證候積分降低（P＜0.01），給藥16天后，柴胡醇提高、中劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠的證候積分降低（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠的證候積分降低（P＜0.05），給藥21天后，柴胡醇提高劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠的證候積分降低（P＜0.001），柴胡醇提中劑量組大鼠的證候積分降低（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠的證候積分降低（P＜0.05）。詳見表5。

3.5 柴胡醇提物對肝纖維化大鼠血中生化指標(biāo)的影響

如表6所示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血中HA、LN、PCIII、IV-C含量均顯著升高（P＜0.001），TGF-β1含量顯著升高（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠血中HA、LN、PCIII、IV-C、TGF-β1含量均顯著性增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，柴胡醇提高、中劑量組和復(fù)方鱉甲軟肝片組、秋水仙堿組大鼠血中HA、LN水平顯著降低（P＜0.001），柴胡醇提低劑量組大鼠血中HA水平顯著降低（P＜0.05），柴胡醇提低劑量組大鼠血中LN水平顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提高、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠血中PCIII、IV-C水平顯著降低（P＜0.001），柴胡醇提中劑量組大鼠血中PCIII、IV-C水平顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠血中PCIII、IV-C水平顯著降低（P＜0.05），柴胡醇提高、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠血中TGF-β1含量顯著降低（P＜0.01），柴胡醇提中劑量組大鼠血中PCIII、IV-C水平顯著降低（P＜0.05）。說明柴胡醇提物能顯著降低肝纖維化大鼠血中指標(biāo)含量，改善大鼠的肝纖維化程度，其藥效作用強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。

3.6 柴胡醇提物對肝纖維化大鼠伴隨毒副作用血清指標(biāo)的影響

如表7所示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血中ALT、AST含量顯著升高（P＜0.001），柴胡醇提高劑量組大鼠血中ALT、AST含量顯著升高（P＜0.01），柴胡醇提低劑量組大鼠血中ALT、AST含量顯著升高（P＜0.05），模型對照組大鼠血中BUN、Cr含量顯著升高（P＜0.05），其余組大鼠血中BUN、Cr含量升高，無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組比較，柴胡醇提高劑量組大鼠血中ALT、AST含量顯著降低（P＜0.05），柴胡醇提中、低劑量組大鼠血中ALT、AST含量顯著降低（P＜0.01），復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠血中ALT、AST含量均顯著降低（P＜0.001）。說明柴胡醇提物在發(fā)揮抗肝纖維化藥效的同時伴隨一定的肝、腎毒副作用，以肝臟為主。

表4 適用于肝郁證特點(diǎn)的模型大鼠證候積分評價量表

表5 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠證候積分的影響（±s，n=10）

表5 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠證候積分的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1d0/g d1/g d6/g d11/g d16/g d21/g正常對照組—0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.20±0.10 0.00±0.00 0.20±0.15模型對照組—0.00±0.00 0.40±0.52*3.90±0.99***5.20±1.03***5.90±1.14***6.50±0.85***柴胡醇提高劑量組3.60 0.00±0.00 0.30±0.52 2.70±0.64***#3.60±0.57***##4.35±0.67***##4.50±0.48***###柴胡醇提中劑量組1.80 0.00±0.00 0.30±0.48 2.90±0.78***#3.81±0.51***##4.40±0.71***##4.90±0.67***##柴胡醇提低劑量組0.90 0.00±0.00 0.40±0.52*3.10±0.89***4.30±0.83***4.90±0.57***#5.10±0.57***#復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 0.00±0.00 0.30±0.52 2.70±0.68***#3.50±0.67***##4.42±0.84***##4.60±0.52***###秋水仙堿組0.18 0.00±0.00 0.30±0.48 2.60±0.57***##3.40±0.63***##4.20±0.72***##4.30±0.54***###

表6 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠血中生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

表6 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠血中生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1HA/ng·L-1LN/μg·L-1PCIII/μg·L-1IV-C/μg·L-1TGF-β1/ ng·L-1正常對照組—28.41±0.55 44.79±1.75 2.24±0.27 5.31±0.35 52.7±5.34模型對照組—41.47±2.11***54.32±2.41***3.50±0.51***7.77±0.73***64.4±8.73**柴胡醇提高劑量組3.60 30.16±1.37###45.34±1.17###2.29±0.17###5.67±0.41###53.8±7.51##柴胡醇提中劑量組1.80 33.69±1.26###46.50±2.13###2.40±0.22##5.93±0.31##55.9±8.53#柴胡醇提低劑量組0.90 35.43±1.74*#47.74±1.95*##2.66±0.26*#6.05±0.53*#60.7±7.97*復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 31.55±1.46###46.26±2.74###2.28±0.26###5.78±0.50###53.4±4.41##秋水仙堿組0.18 30.05±0.86###45.09±2.74###2.25±0.16###5.59±0.44###54.6±7.87##

表7 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠血中肝腎功能指標(biāo)的影響（±s，n=10）

表7 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠血中肝腎功能指標(biāo)的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1ALT/IU·L-1AST/IU·L-1BUN/mmol·L-1Cr/μmol·L-1正常對照組—42.97±5.10 101.2±16.6 9.07±0.62 53.36±2.68模型對照組—86.92±9.84***186.1±12.0***10.16±1.46*57.47±3.82*柴胡醇提高劑量組3.60 72.26±6.56**#145.8±16.7**#9.75±0.54 56.49±3.37柴胡醇提中劑量組1.80 53.88±9.25##123.1±15.2##9.34±0.33 55.05±2.91柴胡醇提低劑量組0.90 66.29±7.51*##137.6±13.6*##9.47±1.08 55.50±2.74復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 51.66±5.10###123.6±14.2###32.55±1.46 54.62±1.46秋水仙堿組0.18 46.29±4.60###120.0±12.7###9.38±0.65 53.96±1.46

3.7 柴胡醇提物對大鼠臟器系數(shù)的影響

如表8所以，與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝臟系數(shù)顯著增大（P＜0.01），脾系數(shù)增大（P＜0.05），胸腺系數(shù)無顯著性變化；與模型對照組比較，柴胡醇提高劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠肝臟系數(shù)顯著增大（P＜0.01），柴胡醇提中劑量組大鼠肝臟系數(shù)顯著增大（P＜0.05），柴胡醇提高劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠脾系數(shù)顯著增大（P＜0.05），其余組無統(tǒng)計學(xué)意義。說明柴胡醇提物可抑制大鼠肝臟系數(shù)的增大，并呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。

3.8 柴胡醇提物對大鼠肝臟病理組織學(xué)檢查的影響

柴胡醇提物對肝纖維化大鼠的肝臟組織Riddit分析病理分級結(jié)果如表9所示，正常對照組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型對照組大鼠肝組織損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)膠原纖維延伸、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞等病理現(xiàn)象，與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝組織損傷嚴(yán)重（P＜0.001）；與模型對照組比較，柴胡醇提高劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組和秋水仙堿組大鼠肝損傷程度減輕（P＜0.01），柴胡醇提中、低劑量組大鼠肝損傷程度減輕（P＜0.05）。說明柴胡醇提物可改善大鼠肝組織損傷程度，且量效關(guān)系良好（病理圖見圖1）。

4 討論

表8 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

表8 柴胡醇提物對改良法肝纖維化大鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

組別劑量/g·kg-1肝/%脾/%胸腺/%正常對照組—3.14±0.32 0.27±0.05 0.17±0.06模型對照組—4.27±0.94**0.34±0.09*0.15±0.03柴胡醇提高劑量組3.60 3.50±0.34##0.28±0.06#0.16±0.03柴胡醇提中劑量組1.80 3.79±0.69#0.30±0.10 0.16±0.06柴胡醇提低劑量組0.90 4.01±0.90 0.29±0.07 0.15±0.04復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 3.55±0.39##0.29±0.03#0.17±0.04秋水仙堿組0.18 3.50±0.30##0.29±0.05#0.17±0.06

表9 柴胡醇提物對大鼠肝臟的病理影響（±s，n=10）

表9 柴胡醇提物對大鼠肝臟的病理影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

組別劑量/g·kg-1病理分級病理積分I II III IV V正常對照組—10 0 0 0 0 0.0±0.0模型對照組—4 2 2 1 1 1.3±1.4***柴胡醇提高劑量組3.60 7 1 2 0 0 0.5±0.8##柴胡醇提中劑量組1.80 6 2 2 0 0 0.6±0.8#柴胡醇提低劑量組0.90 6 2 1 1 0 0.7±1.1#復(fù)方鱉甲軟肝片組1.08 7 2 1 0 0 0.4±0.7##秋水仙堿組0.18 7 3 0 0 0 0.3±0.5##

圖1 大鼠肝組織Masson染色（200×）

目前，在抗肝纖維化藥物研究過程中建立了多種肝纖維化動物模型，但各有利弊，其中，免疫性大鼠肝纖維化模型病理機(jī)制比較接近人類肝的纖維化[13]。本文采用動物血清作為抗原反復(fù)注射，在此基礎(chǔ)上以高脂高熱量飼料誘導(dǎo)，結(jié)合酒精刺激，綜合上述多種因素，加速肝纖維化的形成。這種肝纖維化模型動物同時具備疾病與證候雙重特征，既復(fù)制出了符合中醫(yī)證的基本特點(diǎn)，又與西醫(yī)肝纖維化病理特征相一致。能夠更準(zhǔn)確地模擬臨床疾病與證候形成的病理機(jī)制及病變過程。通過給予柴胡有效組分，既證明了該動物肝纖維化模型的可靠性，又證實了藥物對該病的安全性和可靠性。

肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積是肝纖維化形成的主要病理特征，血清肝纖維化指標(biāo)主要有細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）及其裂解物、ECM代謝相關(guān)的酶等[14]，他們對肝纖維化的合成、降解起著關(guān)鍵性作用。ECM主要成分包括HA、LN、IV-C、PCIII，作為肝纖四項，其主要用來檢查診斷慢性肝病患者病情發(fā)展?fàn)顩r和治療效果，衡量炎癥活動度、纖維化程度的重要依據(jù)[15,16]。HA是基質(zhì)成分之一，由間質(zhì)細(xì)胞合成，可以準(zhǔn)確、靈敏地反映肝內(nèi)已產(chǎn)生的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況，是肝纖維化和肝硬變的敏感指標(biāo)。LN與肝纖維化活動程度及門靜脈壓力呈正相關(guān)，可反映肝纖維化的進(jìn)展與嚴(yán)重程度。IV-C反映基底膜膠原更新率，含量增高不僅可以靈敏反映出肝纖過程，還與肝纖維化肝內(nèi)炎性反應(yīng)及壞死程度有關(guān)[17]，是肝纖的早期標(biāo)志之一。血清PCIII水平與肝纖維化病變程度呈密切相關(guān)，反映肝纖維合成狀況和炎癥活動性。彭岳等[18]通過檢測血中HA、LN、IV-C、P3NP等指標(biāo)的含量，證實肝纖維化模型的建立，因此，本研究采用檢測血清中HA、LN、PCIII、IV-C等指標(biāo)，證實了大鼠肝纖維化的形成。AST和ALT可以反映肝臟細(xì)胞受損及慢性炎性反應(yīng)[19]，BUN、Cr可以反映腎細(xì)胞受損情況，通過檢測ALT、AST、BUN、Cr含量變化，證實柴胡的毒副作用。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，造模結(jié)束后證候積分表顯示：模型組大鼠出現(xiàn)精神倦怠，眼睛暗紅，尾部瘀斑，糞便稀溏等現(xiàn)象，說明大鼠肝纖維化造模成功，血清指標(biāo)ALT、AST水平升高，說明大鼠肝臟出現(xiàn)明顯損傷，肝纖四項HA、LN、PCIII、IV-C水平升高，進(jìn)一步證明大鼠肝纖維化模型形成。大鼠Masson染色圖顯示，大鼠肝臟出現(xiàn)膠原纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞等病理現(xiàn)象。綜上所述，說明大鼠肝纖維化模型造模成功。連續(xù)給予0.90-3.60 g·kg-1的柴胡醇提物可改善大鼠生長狀況，顯著降低血中ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C等肝功能指標(biāo)水平，能夠明顯改善復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化程度，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。柴胡抗肝纖維化作用可能與其能減輕和修復(fù)肝細(xì)胞損傷、抑制肝細(xì)胞纖維化的形成與發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[20]，柴胡能抑制肝星狀細(xì)胞膠原蛋白的分泌，進(jìn)而抑制肝纖維化程度。其中柴胡皂苷是柴胡發(fā)揮疏肝解郁的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[21]，柴胡皂苷d通過下調(diào)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)揮抗肝纖維化的藥效[22]。柴胡在發(fā)揮抗肝纖維化藥效的同時會產(chǎn)生一定的毒副作用，主要以肝臟為主，主要表現(xiàn)為柴胡醇提高劑量組血ALT、AST水平升高，高于柴胡中、低劑量組，說明柴胡在發(fā)揮保肝作用的基礎(chǔ)上，同時對肝臟具有一定的毒副作用。血BUN、Cr水平升高，提示柴胡對腎臟有一定的毒副作用，且柴胡醇提組分發(fā)揮抗纖維化藥效伴隨毒副作用的劑量為3.60 g·kg-1，為柴胡的研究提供數(shù)據(jù)支撐，柴胡抗肝纖維化作用機(jī)制和毒性作用機(jī)制有待于后續(xù)深入研究。

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A Study on Liver Fibrosis Efficacy Accompanied by Side Effects of Alcohol Extracts from Bupleurum Chinense

Sun Xiaoqian1,2, Huang Nana2, Dou Liwen2, Li Xiaoyu1, Sun Rong1
(1. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China;
2. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

In this study, the model of rats’ liver fibrosis was established to examine the protective effect of alcohol extracts of B. chinense, which aimed to provide experimental evidence behind the relationship of its“toxicity-effect”. The model of rats’ liver fibrosis was established through high-fat diet complicated with the administration of alcohol and porcine serum. Meanwhile, rats were respectively given several doses of alcohol extracts of B. chinense and positive medicine for observing their efficacy and assident toxicity. At the same time, general situation was observed, and body weight, daily appetite and water quantity, syndrome integral were measured. The contents of ALT, AST, HA, LN, IV-C, PCIII, TGF-β1, BUN and Cr in serum were tested while the organ indexes were measured and the major organs were scheduled for consideration by the pathology. As a result, giving alcohol extracts of B. chinense ranged from 0.90 g·kg-1to 3.60 g·kg-1for 21 consecutive days obviously improved the diet, drinking and physical activities of rats. The contents of ALT, AST, HA, LN, IV-C and PCIII and liver coefficient declined significantly, and liver fibrosis was also improved. However, the activities of ALT and AST in the high dose of B. chinense were higher than those of other dose groups, and the contents of BUN and Cr in serum increased. In conclusion, alcohol extracts of B. chinense presented an obviously effectiveness on liver fibrosis in rats and a good dose-effect relationship. At the same time, 3.60 g·kg-1of B. chinense extracts had side effects and liver, kidney toxicity, especially in the liver.

Bupleurum chinense, alcohol extracts, liver fibrosis, rat, assident toxicity

10.11842/wst.2016.08.019

R285

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-07-29

修回日期：2016-08-20

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項目（81374059）：柴胡肝毒性與功效、證候關(guān)系的基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：孫蓉；山東省科技廳自主創(chuàng)新和成果轉(zhuǎn)化項目（2014ZZCX02104）：藥物安全性評價和適宜于抗腫瘤及缺血性腦血管疾病多靶點(diǎn)和復(fù)方新藥成藥性評價關(guān)鍵技術(shù)，負(fù)責(zé)人：孫蓉；山東省自然基金委重點(diǎn)項目（2011ZRB14333）：SSa和SSd生物轉(zhuǎn)化及基于功效的藥理活性和肝毒性研究，負(fù)責(zé)人：孫蓉；山東省泰山學(xué)者工程專項經(jīng)費(fèi)資助，特聘專家（ts201511107）：孫蓉。

＊＊ 通訊作者：孫 蓉，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥理與毒理。