電針對APP/PS1小鼠行為學(xué)及大腦皮層Klotho基因表達(dá)的影響＊

李昱頡，李志剛，王 鑫，曹 瑾，呂 威，宋良玉，景泉?jiǎng)P，高譽(yù)姍，張淑靜，程 凱＊＊，許安萍＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2.北京市東城區(qū)朝陽門社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

電針對APP/PS1小鼠行為學(xué)及大腦皮層Klotho基因表達(dá)的影響＊

李昱頡1，李志剛1，王 鑫1，曹 瑾1，呂 威1，宋良玉2，景泉?jiǎng)P1，高譽(yù)姍3，張淑靜3，程 凱1＊＊，許安萍1＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2.北京市東城區(qū)朝陽門社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

本研究通過觀察APP/PS1小鼠大腦皮層Klotho基因的表達(dá)及其空間學(xué)習(xí)記憶能力，探討電針治療阿爾茲海默?。ˋD）的機(jī)理。方法：APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機(jī)分為模型組、電針組（百會穴、印堂穴、人中穴），以C57BL/6野生型小鼠作為對照組；采用Morris水迷宮進(jìn)行空間記憶行為學(xué)測試，以免疫組化法觀察皮層Klotho蛋白表達(dá)趨勢，real-timePCR技術(shù)檢測大腦皮層Klotho mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，模型組逃避潛伏時(shí)間增加、平臺穿越次數(shù)、平臺象限游泳路程減少；與模型組相比，電針組逃避潛伏時(shí)間明顯減少。與正常組相比，模型組大腦皮層Klotho mRNA表達(dá)減少；與模型組相比，電針組Klotho mRNA表達(dá)增加。Real time PCR結(jié)果與免疫組化所示表達(dá)趨勢一致。結(jié)論：電針可提高APP/PS1小鼠的空間記憶能力，其機(jī)制可能與上調(diào)Klotho mRNA表達(dá)有關(guān)。

阿爾茨海默病 大腦皮層 衰老 電針 Klotho

老年性癡呆又稱為阿爾茨海默癥（Alzheimer’s Disease，AD）是老年期最常見的神經(jīng)退行性疾病。AD的病理學(xué)改變主要為β淀粉樣蛋白和沉積后形成的老年斑（Senile Plaque，SP）和Tau蛋白磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[1]。Aβ清除障礙所形成的老年斑堆積是AD發(fā)病的主要假說。大量研究表明，Aβ不僅是AD的典型病理產(chǎn)物，也是腦老化的生物學(xué)標(biāo)志物，在正常腦老化過程及很多輕度認(rèn)知功能損傷的人群中同樣存在Aβ，并隨著老化逐漸在腦中有沉積加重的趨勢[2]，提示腦老化與AD之間存在著很大的相關(guān)性[3]。大腦老化作為常態(tài)腦老化與AD有共同的病理基礎(chǔ)[4]：腦宏觀和微觀的改變，形態(tài)和功能變化、基因突變、相關(guān)蛋白變化，導(dǎo)致神經(jīng)、認(rèn)知系統(tǒng)功能受損。臨床上AD患者的空間記憶能力減退最明顯[5]，執(zhí)行功能、決斷力等也相繼減退[6]。在老化的進(jìn)程中，Aβ沉積與海馬體積萎縮程度明顯相關(guān)，主要影響情景記憶[7]；這都提示腦老化是AD神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變的最初階段，從緩延腦老化進(jìn)程的角度，研究機(jī)體在老化過程中的自我補(bǔ)償機(jī)制，將有利于進(jìn)一步探討AD。

“抗衰老基因”Klotho是預(yù)防AD的潛在靶點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，Klotho基因表達(dá)異常與衰老相關(guān)[8]，當(dāng)Klotho基因缺陷可出現(xiàn)一系列與人類衰老相似的多種表現(xiàn)，而通過轉(zhuǎn)基因使Klotho過度表達(dá)會減輕衰老癥狀，延長壽命，提示Klotho基因與衰老相關(guān)性疾病有密切聯(lián)系[9,10]。

Dubal D B等[11]研究表明，對小鼠進(jìn)行遺傳操控使其過度生成Klotho蛋白，小鼠壽命更長，且在血液和海馬區(qū)域具有更高水平的Klotho[11]。與人體研究相似[12]，Klotho表達(dá)增強(qiáng)的小鼠在各種學(xué)習(xí)和記憶測試中表現(xiàn)更好，與對照組相比，能以更快的速度尋找到迷宮中隱藏目標(biāo)的位置[13]，認(rèn)為Klotho過表達(dá)有助于提高認(rèn)知能力。而電針能改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，延緩腦衰老和降低Aβ的水平，是否參與了Klotho機(jī)制的調(diào)控？

根據(jù)以上基礎(chǔ)，本文以6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD模型，采用電針刺激百會穴、印堂穴、人中穴，觀察AD模型小鼠認(rèn)知功能變化，觀察電針對大腦皮層Klotho基因表達(dá)的影響，以探求電針治療AD的機(jī)理。

1 材料

1.1 模型與分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

將6月齡雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型組，同月齡C57BL/6野生型小鼠作為對照組。實(shí)驗(yàn)動物購自南京大學(xué)模式動物研究所，批號：SCXK（寧）2010-000。

1.1.2 分組與電針治療

將20只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組（Model，M）和電針組（Electro-Acupuncture，EA），每組10只。以C57BL/6野生型小鼠為對照組（Control，C）。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)，給予足量常規(guī)飲食。

電針組：選取百會和印堂，百會穴針尖向后頭部、印堂穴針尖向鼻尖方向，進(jìn)針2-3 mm。采用疏密波，頻率1/50 Hz，強(qiáng)度0.3 mA，持續(xù)20 min；以針柄震顫，動物不掙扎、不嘶叫為度。電針結(jié)束后，電針組小鼠點(diǎn)刺水溝穴，正常組、模型組以相同方法用鼠袋束縛15 min，隔日1次，持續(xù)4周。

1.2 主要試劑和儀器

本實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：兔多克隆Klotho抗體（英國abcam公司，貨號：ab154163，批號：1120），抗兔免疫組化試劑盒（浙江邁新科技股份有限公司，貨號：KIT-5004，批號：1511109706），Trizol（美國invitrogen公司，貨號：15596026，批號：74121）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Scientific Fermentas公司，貨號：K1622，批號：00348560）；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（toyobo-東洋紡上海生物科技有限公司，貨號：QPS-201，批號：412200）。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，型號：LH202H）；一次性使用無菌針灸針（北京中研太和醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）；紫外分光光度計(jì)（英國LNICAM公司，型號：HeλIOSα）、PCR儀（德國Eppendorf公司，型號：Mastercycler Personal）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：CFX96）。

2 方法

2.1 Morris水迷宮檢測空間學(xué)習(xí)記憶

本文采用Morris水迷宮檢測各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮按邊緣、方向等距離將水池依次分為4個(gè)象限。第三象限為目標(biāo)象限。電針干預(yù)4周后的第2-6天進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，于測試前1天將各組小鼠置于站臺上適應(yīng)環(huán)境，以第四象限為入水點(diǎn)讓各組每只小鼠在迷宮內(nèi)自由游泳1 min。實(shí)驗(yàn)第1-4天，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，先將小鼠置于站臺上適應(yīng)10 s，隨后依次從4個(gè)象限將小鼠面壁放入水中，小鼠登上平臺5 s后終止記錄時(shí)間，最長記錄時(shí)間為60 s。第5天行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，直接將小鼠按象限依次放入。以定位航行實(shí)驗(yàn)第四象限為入水點(diǎn)的逃避潛伏時(shí)、穿越平臺次數(shù)和第三象限游泳路程為評判小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

2.2 樣品制備與指標(biāo)檢測

2.2.1 樣品制備

水迷宮測試后，每組取4只小鼠，予0.3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）麻醉，心臟灌注，取全腦用多聚甲醛固定24 h。將多聚甲醛固定的每組4只動物全腦，于乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做冠狀面切片。

水迷宮測試后，另取每組6只小鼠，予0.3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）麻醉，開顱取皮層，然后置于-80℃冰箱保存。

2.2.2 免疫組化步驟

Klotho免疫組化ABC法：切片脫蠟水化；0.01mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原10 min；3%甲醇雙氧水室溫10 min；5%正常羊血清封閉37℃，30 min；一抗（以1∶50稀釋）孵育過夜；PBS洗滌。將腦組織置于二抗稀釋液中孵育，孵育結(jié)束后用PBS漂洗。再用AB復(fù)合物于37℃孵育90 min，之后用PBS漂洗。最后用DAB法顯色10 min，蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。

2.2.3 Real-time PCR步驟

腦組織樣本稱重，以20倍體積（μg·μL-1）的Trizol勻漿，采取Trizol提取法提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。按20 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按Real-time PCR體系，加入逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、DEPC H2O 8 μL、PCR master mix 10 μL、正反鏈引物各1 μL，進(jìn)行PCR實(shí)時(shí)熒光定量。Klotho擴(kuò)增引物序列為：5'-ATTGCAGGGTGAATGGTATCT-3'，5'-GCACTG TTATCCCTACCGTATT-3'，內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增引物序列為：5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，5'-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3'。引物由北京鼎國公司合成。采用量2－ΔΔCT法分析mRNA的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，Morris水迷宮逃避潛伏期檢測數(shù)據(jù)采用多組重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料方差分析；PCR檢測用One-Way ANOVA進(jìn)行分析，多組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01表示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組小鼠逃避潛伏時(shí)間比較/s（±s，n=10）

表1 各組小鼠逃避潛伏時(shí)間比較/s（±s，n=10）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05；與相同組別第一天比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別第一天第二天第三天第四天對照組49.96±16.14 30.7±16.35△△30.30±19.70△△32.45±17.11△△模型組56.5±11.06 59.70±0.94**52.74±15.53**48.70±18.37**電針組54.88±16.44 48.70±18.35#48.01±17.27 46.50±19.44△

圖1 各組小鼠逃避潛伏時(shí)間比較

4 結(jié)果

4.1 電針對APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與基線值相比，隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，各組小鼠逃避潛伏時(shí)間均縮短（P＜0.05）；與對照組相比，模型組逃避潛伏時(shí)間延長；與模型組相比，電針組逃避潛伏時(shí)間縮短（見表1、 圖1）。

各組空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳距離均用ANOVA分析。與對照組相比，模型組穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳路程明顯減少。與模型組相比，電針組穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05），詳見表2。

4.2 電針對APP/PS1小鼠Klotho表達(dá)的影響

4.2.1 電針對APP/PS1小鼠Klotho蛋白表達(dá)的影響

各組免疫組化圖像（圖2）可見大腦皮層Klotho表達(dá)情況，正常組Klotho細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均有棕色陽性表達(dá)，模型組Klotho表達(dá)陽性，但比正常組有明顯的減少，僅在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。相對于模型組，電針組的Klotho表達(dá)明顯增強(qiáng)。

4.2.2 電針對APP/PS1小鼠Klotho mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組Klotho mRNA相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，電針組Klotho mRNA相對表達(dá)量增加（P＜0.01）。電針促進(jìn)了大腦皮層Klotho mRNA表達(dá)。詳見表3。

5 討論

有研究顯示NMDA受體能與神經(jīng)元協(xié)助形成進(jìn)一步的加強(qiáng)或弱的連接。NMDA受體能提高大腦細(xì)胞的活性和相互交流，對于信息傳遞具有重要意義，但也是AD等神經(jīng)退行性病變損傷的靶向位點(diǎn)。Klotho通過調(diào)節(jié)GluN2B，促進(jìn)NMDA受體長期開啟，接收信息，進(jìn)而保持細(xì)胞間信息交流，從而促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶[14]。Klotho誘導(dǎo)的胰島素抵抗通過減少葡萄糖向脂肪轉(zhuǎn)化，防止細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)超負(fù)荷，從而減少細(xì)胞凋亡[15]，研究還發(fā)現(xiàn)Klotho表達(dá)下降可導(dǎo)致Wnt通路進(jìn)一步激活，導(dǎo)致干細(xì)胞老化，進(jìn)一步限制組織再生并導(dǎo)致衰老，因此，Klotho參與抑制Wnt通路來抑制衰老[16]。另有學(xué)者認(rèn)為PI3K/Akt信號通路[17]和NF-κB信號通路[18]也參與了Klotho的抗衰老作用。因此推測Klotho在哺乳動物體內(nèi)是一種抗衰老的激素，其作用涉及多個(gè)器官、系統(tǒng)、組織，進(jìn)一步通過影響多個(gè)途徑、多種機(jī)制發(fā)揮其作用。

圖2 各組小鼠大腦皮層Klotho的蛋白表達(dá)（×400，1∶100）

APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因模型，轉(zhuǎn)入人突變的淀粉樣前體蛋白及PS1基因，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ的水平增高，形成AD一系列病理，主要是以Aβ增多形成老年斑而作為主要病理的一種AD模型[19]。國外研究顯示，3月該模型即出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的減退[20]，而本課題組前期研究結(jié)果顯示5月齡雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)檢測差異不明顯；而Li X[21]等Morris實(shí)驗(yàn)提示該模型的空間記憶障礙于7-8月齡開始出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中治療后證明7月齡各組之間行為學(xué)有差異，提示7月齡雙轉(zhuǎn)基因小鼠已出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力的減退。

空間學(xué)習(xí)記憶能力的減退是AD的主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)認(rèn)為癡呆病位在腦，有“病變在腦，首取督脈”之說。督脈主一身之陽，是足三陽經(jīng)與肝經(jīng)的交會穴。具有醒腦開竅、益氣調(diào)神的功效，是治療腦病的要穴；印堂穴位于兩眉之間，具有寧心安神、鎮(zhèn)驚的作用；水溝穴為手足陽明經(jīng)與督脈的交會穴，亦可醒神開竅。此三穴配合能起到益智醒腦，發(fā)揮治療癡呆的作用。

表2 各組小鼠穿越平臺位置次數(shù)、平臺象限游泳路程的比較（±s，n=10）

表2 各組小鼠穿越平臺位置次數(shù)、平臺象限游泳路程的比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01，與模型組相比，#P＜0.05。

組別穿越平臺位置次數(shù)/次平臺象限游泳路程/cm對照組2.00±0.66 349.70±115.43模型組0.73±0.46**192.52±93.82**電針組1.08±0.75#222.20±91.40

表3 電針對APP/PS1鼠Klotho mRNA表達(dá)的影響（±s，n=6）

表3 電針對APP/PS1鼠Klotho mRNA表達(dá)的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別Klotho mRNA相對表達(dá)量對照組5.30±1.90模型組1.30±0.31**電針組2.35±0.52##

本研究的側(cè)重點(diǎn)在于電針對該模型腦內(nèi)抗衰老基因Klotho的影響。本實(shí)驗(yàn)顯示電針組的空間學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，而電針組Klotho表達(dá)增加，因此，電針治療可能通過上調(diào)Klotho延緩腦內(nèi)的衰老，改善學(xué)習(xí)記憶能力。這可能是電針治療癡呆的作用途徑之一。但電針是否干預(yù)了PI3K/AKt通路或NMDA受體等靶點(diǎn)對下游Klotho基因進(jìn)行調(diào)控，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

1 Sanchez-Varo R, Trujillo-Estrada L, Sanchez-Mejias E, et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer’s mice hippocampus. Acta Neuropathologica, 2012, 123(1): 53-70.

2 Rodrigue K M, Kennedy K M, Park D C, et al. Beta-amyloid deposition andthe aging brain. Neuropsychol Rev, 2009, 19(4): 436-450.

3 delaTorre J C. Critically attained threshold of cerebral hypoper-fusion: TheCATCHhypothesis of Alzheimer’s pathogenesis. Neurobiol Aging,2000, 21: 331-342.

4 Herrup K. Reimagining Alzheimer’s disease—An age-based hypothesis. J Neurosci, 2010, 30(50): 16755-16762.

5 Vazquez-Marrufo M, Luisa Benitez M, Rodriguez-Gomez G, et al. Attentionalneural networks impairment in healthy aging. Rev Neurol, 2011, 52(1): 20-26.

6 Silver H, Goodman C, Gur R C, et al. Executive functions and normalaging: Selective impairment in conditional exclusion compared toabstraction and inhibition. Dement Geriatr Cogn Disord, 2011, 31(1): 52-62.

7 Mormino E C, Kluth J T, Madison C M, et al. Episodic memory loss isrelated to hippocampal mediated beta amyloid deposition in elderly subjects. Brain, 2009, 132(5): 1310-1323.

8 Dubal D B, Yokoyama J S, Zhu L, et al. Life extension factor Klotho enhances cognition. Cell Rep, 2014, 7(4): 1065-1076.

9 Chen T H, Kuro O M, Chen C H, et al. The secreted Klotho protein restores phosphate retention and suppresses accelerated aging in Klotho mutant mice. Eur J Pharmacol, 2013, 698(1/2/3): 67-73.

10 Hu M C, Shiizaki K, Kuro-o M, et al. Fibroblast growth factor 23 andKlotho: Physiology and pathophysiology of an endocrine network of mineral metabolism. Annu Rev Physiol, 2013, 75: 503-533.

11 Dubal D B, Zhu L, Sanchez P E, et al. Life extension factor Klotho prevents mortality and enhances cognition in hAPP transgenic mice. J Neurosci, 2015, 35 (6): 2358-2371.

12 Semba R D, Moghekar A R, Hu J, et al. Klotho in thecerebrospinal fluid of adults with and without Alzheimer's disease. Neurosci Lett, 2014, 558: 37-40.

13 Kuang X, Chen Y S, Wang L F, et al. Klothoupregulationcontributesto the neuroprotection of ligustilide in an Alzheimer's disease mouse model. Neurobiol Aging, 2014, 35(1): 169-178.

14 Zeldich E, Chen C D, Colvin T A, et al. The neuroprotective effect of Klotho is mediated via regulation of members of the redox system. J Biol Chem, 2014, 289(35): 24700-24715.

15 Unger R H. Klotho induced insulin resistance: Ablessing in disguise. Nat Med, 2006, 12(1): 56-57.

16 Liu H, Fergusson M M, Castilho R M, et al. AugmentedWnt signaling in amammalian model of accelerated aging. Science, 2007, 317(5839):803-806.

17 Ragnauth C D, Warren D T, Liu Y, et al. Prelamin A acts to acceleratesmooth muscle cell senescence and is a novel biomarker of human vascularaging. Circulation, 2010, 121(20): 2200-2210.

18 Teocchi M A, Ferreira A, da Luz de Olive Ira E P, et al. Hippocampal expression dysregulation of Klotho nuclear factor kappa B and tumornecrosis factor in temporal lobe epilepsy patients. J Neuroinflamma, 2013, 10: 53.

19 崔艷秋,鄭焱,王曉民. APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因鼠表型綜述.生理科學(xué)進(jìn)展, 2012, 43(3): 211-215.

20 Liu Y, Gao L, Lin N H, et al. Effect of the pathology senile plaques in cerebral cortex on the learning and memory abilities of the APP/ PS1 double transgenic mice. Chin J Neuroanatomy, 2007, 23(3): 225-231.

21 Li X, Guo F, Zhang Q, et al. Electroacupuncture decreases cognitive impairment and promotes neurogenesis in the APP/PS1 transgenic mice. BMC Complement Altern Med, 2014,14: 37.

Effects of Electro-Acupuncture on Behavioral Changes, Klotho Level in the Cerebral Cortex in APP/PS1 Transgenic Mice

Li Yujie1, Li Zhigang1, Wang Xin1, Cao Jin1, Lyu Wei1, Song Liangyu2, Jing Quankai1, Gao Yushan3, Zhang Shujing3, Cheng Kai1, Xu Anping1
(1. School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
2. ChaoyangmenCommunity Health Service Administration Center of DongchengDistrict, Beijing 100010, ChinaChina;
3. School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This aimed to elucidate the mechanism behind the electro-acupuncture (EA)in treating Alzheimer's disease (AD) by observing Klotho mRNA expression in the cerebral cortex and spacial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice. APP/PS1 mice were randomly divided into the model group and the EA group, while C57BL/6wild type mice was taken as the control group. Spacial learning and memory was observed by Morris water maze test. Klotho protein expression in the cerebral cortex was detectedy by immunohistochemistry,while its mRNA levels were quantified by real-time PCR. As a result, the escape latency in the model group increased,the number of crossing and the swimming distance in the model group reduced compared with the control group. The escape latency inthe EA group was shorter than that in the model group. Klotho mRNA expression in thecerebral cortex in the model group were lower than that in the control group, while that in theEA group increased. The outcomes of real-time PCR chimed with those of immunohistochemistry. In conclusion,it was demonstrated that EA treatmentprobably improved the spacial learning and momery of the APP/PS1 transgenic mice by upregulatingKlotho expression in the cerebral cortex.

Alzheimer's disease, cerebral cortex, aging, electro-acupuncture, Klotho

10.11842/wst.2016.08.014

R2-031

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-08-01

修回日期：2016-08-20

＊ 國家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目（81503654）：逆針灸對老年性癡呆小鼠“抗衰老基因”Klotho的調(diào)控，負(fù)責(zé)人：許安萍；北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師科研類面上項(xiàng)目（2015-JYB-JSMS028）：基于Klotho探討逆針灸對老年性癡呆小鼠認(rèn)知能力的保護(hù)作用，負(fù)責(zé)人：許安萍。

＊＊ 通訊作者：程凱，教授，主要研究方向：腧穴特異性研究；許安萍，講師，主要研究方向：針灸干預(yù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用機(jī)制研究。