大理野生蕨菜總黃酮的提取及抗氧化活性研究

儲(chǔ)維維，張燁，段曉梅，蔣春艷，章虎（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

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大理野生蕨菜總黃酮的提取及抗氧化活性研究

儲(chǔ)維維，張燁*，段曉梅，蔣春艷，章虎
（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

摘要：以大理野生蕨菜為試材，采用乙醇回流法提取蕨菜中的總黃酮，以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用體外抗氧化測試法對(duì)總黃酮進(jìn)行了總抗氧化能力和還原力研究。結(jié)果表明最佳提取條件為，50 %的乙醇溶液，1∶50（g/mL）的料液比，80℃回流提取1 h，蕨菜總黃酮提取率可達(dá)10.33 %。蕨菜中總黃酮的還原力、對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率均和濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.12 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率分別達(dá)到64.72%、57.53%。

關(guān)鍵詞：野生蕨菜；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)；抗氧化性

蕨菜（Pteridium aquilinum var. latiusculum）屬鳳尾蕨科，又叫拳頭菜、拳菜、貓爪、龍頭菜、鹿蕨菜、蕨兒菜、貓爪子、蕨苔、鍋蓮，蕨菜在我國分布較廣，種類很多，不同的地區(qū)品種各有特色，喜生于淺山區(qū)向陽地塊，多分布于稀疏針闊混交林，在云南分布廣泛，其食用部分是未展開的幼嫩葉芽以及上半段較嫩的莖干[1]。蕨菜，營養(yǎng)豐富，含有多種維生素、氨基酸、以及人體所需的多種微量元素，是理想的健康食品和有待開發(fā)利用的天然食品資源[2-3]。蕨菜還含有許多藥用成分蕨菜能入藥，有解毒、清熱、潤腸、降氣等功效，可用于治療高血壓、糖尿病、濕熱黃疸、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥狀，具有很好的藥用價(jià)值[4-6]。蕨菜中含有豐富的的黃酮類物質(zhì)[7-9]，黃酮類化合物具有改善血液循環(huán)、降血脂、降血糖、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、治療心腦血管疾病等保健功能，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[10-12]。已被聯(lián)合國教科文組織列為“世界地質(zhì)公園”的大理蒼山位于低緯度高海拔的滇西北高原，動(dòng)植物資源豐富。得天獨(dú)厚的自然條件和氣候條件很適宜蕨類植物生長，野生蕨菜分布廣闊，但目前開發(fā)利用較少，蕨類植物中黃酮類化合物方面的研究已有報(bào)道[2，13-16]，但有關(guān)大理蒼山野生蕨菜中黃酮類化合物的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用采用正交試驗(yàn)法從大理蒼山野生蕨菜中提取總黃酮，以確定出最佳提取條件，為進(jìn)一步的開發(fā)利用其提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

蕨菜：2014年5月22日采自云南省大理蒼山云弄峰花甸壩，野外采集后室內(nèi)風(fēng)干，粉碎備用。

蘆?。撼啥悸继厣锟萍加邢薰?；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、苯酚、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、30 %過氧化氫、硫酸亞鐵、鹽酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸（VC）：均為國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)室自制為去離子水和蒸餾水。

1.2儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海-恒科技有限公司；AL204-IC型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1黃酮含量測定

1.3.1.1供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取已粉粹的蕨菜樣品1.00 g，按試驗(yàn)條件料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行提取，趁熱抽濾、濃縮，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用70 %的乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

1.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[17-18]

精確稱取蘆丁對(duì)照品0.008 0 g，70 %乙醇微熱溶解，用70 %乙醇定容至50 mL，配制成0.160 0 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。分別吸取該對(duì)照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL于25 mL容量瓶中，用70 %乙醇添至10 mL，加入5 %亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，靜置6 min，10 %硝酸鋁溶液1.00 mL搖勻，靜置6 min，再加入4 %氫氧化鈉溶液10 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，靜置15 min；空白對(duì)照直接加70 %乙醇10 mL，其余所加試劑同上，加蒸餾水至刻度。用紫外分光光度計(jì)在400 nm~600 nm處做掃描出最大吸收波長為505 nm。在最大吸收波長下，分別測定以上系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=8.138 0x-0.004 2（R2=0.999 6），見圖1。

1.3.1.3總黃酮的含量測定

精密吸取蕨菜的供試品溶液1 mL各2份分別于50 mL，用70 %乙醇添至10 mL，加入5 %亞硝酸鈉溶液2.0 mL，搖勻、放置6 min、再加入10 %硝酸鋁溶液2.0mL，搖勻，放置6min，再加入4%NaOH溶液20 mL，混勻，再用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min。在505 nm處測得吸光度，代入回歸方程根據(jù)提取總體積和稀釋倍數(shù)按下式計(jì)算總黃酮提取率。

式中：x為樣品中總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）；m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測液中總黃酮的量，mg；V1為測定樣品提取液體積，mL；V2為樣品提取液總體積，mL；m2為蕨菜樣品質(zhì)量，g。

圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

1.3.2單因素試驗(yàn)

對(duì)提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素研究，分別考察這4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.3.3正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)各因素的提取溫度（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、提取時(shí)間（D）四因素對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，并以總黃酮含量作為提取工藝的判斷指標(biāo)。選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonaI test

1.3.4抗氧化性試驗(yàn)

1.3.4.1蕨菜總黃酮的還原力測定[19-20]

如果物質(zhì)是電子給予體，它可將Fe3+還原成Fe2+，能與Fe3+形成普魯士藍(lán)，其在700 nm處有最大吸收峰。吸光度越大，抗氧化能力越強(qiáng)。分別吸取不同濃度的樣品液2.5 mL于三角燒瓶中（每個(gè)濃度取3份平行），加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL、1 %K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，添水至10 mL，混合均勻，混合液于50℃保溫20 min，再加入2.5 mL10 %的三氯乙酸溶液，混合后3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水，加入0.5 mL 0.1 %的FeCl3溶液，室溫放置10 min，測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度，吸光度越大則說明其還原能力越強(qiáng)，抗氧化性也越強(qiáng)。

1.3.4.2對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定[21-22]

采用鄰苯三酚自氧化法。向三角燒瓶中依次加入0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液5 mL、加入2 mL蒸餾水，置25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別精確吸取不同濃度樣品液2 mL（每個(gè)濃度取3份平行），立即加入在25℃水浴中預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚1 mL，立即混勻，在25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min后，加入10 mol/L 的HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，（以0.01 mol/L HCl為參比，不加樣品液為空白，空白中樣品液以2 mL蒸餾水代替），并于320 nm處測定吸光度。按照同樣方法以同濃度VC做陽性對(duì)照。按下式計(jì)算O2-·清除率%：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；An為加入黃酮溶液后的吸光度。

1.3.4.3對(duì)羥自由基（·OH）清除率的測定[23-25]

采用水楊酸法，利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生具有高反應(yīng)活性的·OH。如果在體系中含有清除·OH能力的物質(zhì)，能與水楊酸競爭·OH，使水楊酸捕捉羥·OH后產(chǎn)生的有色物質(zhì)生成量減少，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。向每個(gè)三角燒瓶中依次加入2 mL濃度9 mmol/L水楊酸-乙醇，2 mL濃度9 mmol/L的FeSO4溶液混勻，加入不同濃度樣品液2 mL（每個(gè)濃度各3瓶）（0號(hào)做空白對(duì)照，加入2 mL去離子水），再加入2 mL濃度8.8 mmol/L的H2O2（考慮到待測溶液自身的吸光度，每個(gè)濃度下有一瓶不加H2O2，以2 mL去離子水代替，作為本底吸收An0），于37℃反應(yīng)30 min，以去離子水為參比，然后在510 nm波長下分別測定吸光度An，按照同樣方法以同濃度VC做陽性對(duì)照。按下式計(jì)算·OH清除率%：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光值；An為加入待測溶液后的吸光值；An0為不加H2O2時(shí)待測溶液的吸光值。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品，1∶30（g/mL）的料液比，用70%的乙醇溶液分別以水浴溫度20、40、60、80、90℃下回流提取2 h，按1.3.1.3項(xiàng)下方法顯色，用蒸餾水定容，測定吸光度，計(jì)算蕨菜中總黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖2提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on total flavonoids yield

隨著溫度的增加，總黃酮提取率增加，在80℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度到90℃后降低。綜合各方面因素，正交試驗(yàn)溫度3個(gè)水平設(shè)置為75、80、85℃。

2.1.2料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品，用70 %的乙醇水溶液，分別以1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）的料液比，70℃下回流提取2 h，按1.3.1.3項(xiàng)下方法顯色，用蒸餾水定容，測定吸光度，計(jì)算蕨菜中總黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on total flavonoids yield

總黃酮提取率隨著料液比增加而增加，超過1∶50后，提取率隨料液比的增大而減小，因此回流提取料液比因素的水平設(shè)置為1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）。

2.1.3乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品，1∶30（g/mL）的料液比，70℃的水浴，分別以20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇溶液回流提取2 h，按1.3.1.3項(xiàng)下方法顯色，用蒸餾水定容，測定吸光度，計(jì)算蕨菜中總黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

乙醇濃度在40 %~50 %之間，總黃酮提取率有最大值，因此，正交試驗(yàn)中乙醇濃度水平設(shè)置為30 %、40 %、50 %。

圖4乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

2.1.4提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品，1∶30（g/mL）的料液比，70 %乙醇水溶液，分別回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，按1.3.1.3項(xiàng)下方法顯色，用蒸餾水定容，測定吸光度，計(jì)算蕨菜中總黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

圖5提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of the extraction time on total flavonoids yield

1.5 h提取率最高，因此回流提取時(shí)間因素設(shè)置為1、1.5、2 h。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)各因素的提取溫度（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、提取時(shí)間（D）四因素對(duì)總黃酮提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

續(xù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal test

由表2可得出，各因素對(duì)蕨菜中總黃酮的提取率影響主次順序呢依次為：提取溫度（A）>乙醇濃度（C）>料液比（B）>提取時(shí)間（D）；以極差最小的D因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析見表3。

表3方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

結(jié)果表明A因素的影響最顯著，其他因素均無顯著影響。A2，A3對(duì)提取效果的影響差異較小，但降低溫度有利于節(jié)能。提取時(shí)間（D）的影響最小，而縮短提取時(shí)間也有利于提高工作效率和降低能耗，D1和D2的效果更接近，故綜合能耗因素考慮，確定優(yōu)化提取條件為A2B2C3D1。即1∶50（g/mL）的料液比，50 %的乙醇溶液為提取液，80℃下回流提取1 h。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

精確稱取1.00 g蕨菜粉，按照優(yōu)化提取工藝條件A2B2C3D1下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，按1.3.1.3項(xiàng)下方法顯色，用蒸餾水定容，測定吸光度A，計(jì)算蕨菜中總黃酮平均提取率10.33 %，RSD值為0.59 %。

2.4抗氧化性

2.4.1蕨菜總黃酮的還原力測定

采用普魯士藍(lán)法測定測定總抗氧化性，通過溶液的吸光度的變化來評(píng)價(jià)還原力的大小。以不同濃度的VC為陽性對(duì)照，測定了蕨菜總黃酮還原能力，見圖6。

由圖6可見，蕨菜總黃酮還原能力弱于VC。但其還原力隨黃酮類化合物溶液濃度的升高而加強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)線性回歸得相關(guān)系數(shù)R2=0.997 5。

圖6蕨菜總黃酮的還原力Fig.6 The reducing power of total flavonoids

2.4.2對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

以不同濃度的VC為陽性對(duì)照，研究了蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，見圖7。

圖7蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of flavonoids on superoxide anion free radical

由圖7可見，其清除效果隨黃酮類化合物溶液濃度的升高而加強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)線性回歸得相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8。當(dāng)濃度均為0.12 mg/mL時(shí)，VC和蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為77.64 %、64.72 %。表明蕨菜總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）有較好的清除作用。

2.4.3對(duì)羥自由基（·OH）清除率的測定

以不同濃度的VC為陽性對(duì)照，研究了蕨菜總黃酮對(duì)對(duì)羥自由基的清除率，見圖8。

圖8蕨菜總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of flavonoids on hydroxyl radical

由圖8可知，蕨菜總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力較強(qiáng)。當(dāng)濃度均為0.12 mg/mL時(shí)，VC和蕨菜總黃酮對(duì)羥自由基的清除率分別為70.87 %、57.53 %。其清除率隨黃酮濃度增大而增加，但清除作用沒有VC強(qiáng)。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了野生蕨菜中總黃酮提取工藝條件。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，影響野生蕨菜總黃酮提取率的因素依次為提取溫度（A）>乙醇濃度（C）>料液比（B）>提取時(shí)間（D）；優(yōu)化的提取工藝采用1∶50（g/mL）的料液比，50 %的乙醇溶液為提取液，80℃下回流提取1 h。提取率可達(dá)10.33 %，RSD值為0.59 %。

抗氧化性結(jié)果表明，蕨菜黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用，且其清除效果隨著蕨菜黃酮濃度的增加而加強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.12 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率分別為64.72 %和57.53 %。說明蕨菜黃酮類化合物具有良好的抗氧化性，對(duì)生物機(jī)體具有保健功效。

從試驗(yàn)結(jié)果看大理蒼山野生蕨菜中總黃酮含量較高，但植物中總黃酮含量受氣候、產(chǎn)地的影響較大，因此對(duì)不同產(chǎn)地野生蕨菜應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。野生蕨菜分布廣闊，資源蘊(yùn)藏量大，乙醇回流法在工業(yè)生產(chǎn)中是較成熟的提取方法，該試驗(yàn)結(jié)果可為大理蒼山野生蕨菜資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

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Extraction Technology and Antioxidation of Total Flavonoids from Wild P.aquilinum in Dali

CHU Wei-wei，ZHANG Ye*，DUAN Xiao-mei，JIANG Chun-yan，ZHANG Hu
（Pharmacy and Chemistry College，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Total flavonoids was extracted by ethanol reflux method using wild P.aquilinum in Dali as the raw material. Total flavonoids yield was used as the index，the extraction process was optimized by the orthogonal designing，and the antioxidant activities and reducing power of the total flavonoids were evaluated by thebook=53,ebook=60antioxidant test in vitro. The results showed that the optimal conditions were：50 % ethanol solvent，1∶50（g/mL）as the ratio of solid-liquids，extraction temperature 80℃，and about 1h extraction time. With the optimal conditions，the total flavonoids yield was 10.33 %，the reducing power and the scavenging effects of flavonoids on superoxide anion free radical and hydroxyl radical were positively correlated with the concentration of the flavonoid extraction. As the concentration was 0.12 mg/mL，the scavenging effects of the total flavonoids on the superoxide anion free radical and hydroxyl radical were 64.72 % and 57.53 %，respectively.

Key words：wild Pteridium aquilinum；total flavonoids；extraction process；orthogonal test；antioxidative activity

收稿日期：2014-12-25

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.013

*通信作者：張燁（1970—），男（漢），副教授，碩士，從事醫(yī)用化學(xué)研究工作。

作者簡介：儲(chǔ)維維（1993—），女（漢），本科，研究方向：藥物制劑工程。

基金項(xiàng)目：大理學(xué)院大學(xué)生科研基金項(xiàng)目（KYSX2014053）