細(xì)胞穿膜肽作為載體的研究進(jìn)展

閆可心，閆宗斌，韓金成，張雪梅，薛書江，許應(yīng)天

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

細(xì)胞膜主要是由磷脂構(gòu)成的半透性膜，具有選擇透過(guò)性，分子質(zhì)量不超過(guò)600 Da的物質(zhì)才能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中，蛋白質(zhì)、多肽和核酸等大分子物質(zhì)不易進(jìn)入細(xì)胞中且難以達(dá)到足夠的濃度，故而為了實(shí)現(xiàn)跨膜的目的，需要運(yùn)輸載體的輔助。雖然顯微注射、電穿孔及重組質(zhì)粒等穿膜技術(shù)早已被普遍應(yīng)用，但仍存在許多不足，比如轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高、細(xì)胞毒性大[1]。近30年來(lái)，細(xì)胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPPs）的發(fā)現(xiàn)為該領(lǐng)域提供了優(yōu)良的輸送載體，細(xì)胞穿膜肽也稱為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（membrane transduction peptides,MTPs）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transductions,PTDs）等[1]，是一類富含堿性氨基酸，通常帶有正電荷，pH近似中性，為包含5～30個(gè)氨基酸的小分子多肽。實(shí)驗(yàn)表明它能將多種物質(zhì)如親水性蛋白質(zhì)、多肽、基因片段（RNA、DNA和反義寡聚核苷酸）和小分子藥物等通過(guò)體內(nèi)及體外的方式，在保證活性分子依然發(fā)揮作用的情況下導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，而且不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，某些CPPs甚至能夠攜帶分子穿過(guò)血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障等重要的屏障系統(tǒng)發(fā)揮作用[2]。本文就其分類、在各領(lǐng)域中國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 CPPs的分類

CPPs的種類繁多，根據(jù)序列、功能、入胞機(jī)制和來(lái)源等特點(diǎn)，可以對(duì)其進(jìn)行不同分類，依據(jù)CPPs的來(lái)源和理化性質(zhì)進(jìn)行分類比較普遍。

1.1 根據(jù)CPPs的來(lái)源

1.1.1 蛋白衍生物源自天然蛋白質(zhì)多肽區(qū)域的蛋白衍生物，主要是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)[3]，沒(méi)有細(xì)胞特異性，在不同溫度（4～37℃）條件下有同樣的運(yùn)輸效率。早在1988年，Green和Frankel已證實(shí)人免疫缺損病毒（HIV-1）的轉(zhuǎn)錄活化因子（TAT）能夠穿膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)[4]，HIV TAT蛋白具有細(xì)胞穿透功能的發(fā)現(xiàn)開啟了細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的新紀(jì)元，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于克服細(xì)胞輸送肽和蛋白質(zhì)的挑戰(zhàn)尤其重要[5]。TAT肽是TAT蛋白的短陽(yáng)離子片段，迅速成為一種流行的研究工具，用于增強(qiáng)生物分子向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。蛋白衍生物含有大量的精氨酸和賴氨酸殘基，且都帶正電荷。

1.1.2 人工合成CPPs利用大部分CPPs帶正電荷及賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸殘基含量豐富的特點(diǎn)[6]，人工合成的多聚賴氨酸和多聚精氨酸同樣具有穿膜入胞的能力[7]。目前許多具有穿透細(xì)胞能力的不同特性的人工新型CPPs在不斷被開發(fā)。

1.1.3 嵌合肽嵌合肽由CPPs與藥物通過(guò)共價(jià)連接的方式形成，為增強(qiáng)其靶向性，將CPPs和癌細(xì)胞核定位信號(hào)及細(xì)胞表層的多肽配體相結(jié)合，形成的嵌合肽可有較多功能。目前，應(yīng)用頻繁的多肽配體主要有RGD、YIGSR及NGR，由于其與癌細(xì)胞通過(guò)非特異性的方式識(shí)別而被廣泛應(yīng)用[8]。

1.2 根據(jù)CPPs的理化性質(zhì)

1.2.1 陽(yáng)離子型一般帶有正電荷，含有堿性氨基酸，且其三維結(jié)構(gòu)不呈現(xiàn)兩親性螺旋排布的CPPs歸類為陽(yáng)離子型CPPs。最具代表性的是TAT。在2000年，Mitchell研究了精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和組氨酸這幾種堿性氨基酸的低聚物的穿膜能力，總結(jié)出精氨酸的低聚物較其他同鏈長(zhǎng)的堿性氨基酸的低聚物有更高的穿膜效率[9]。有一些被稱為核定位序列的陽(yáng)離子型CPPs甚至更為特殊，它們可以通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，但穿膜能力較弱[10]，將其與一段疏水的多肽共價(jià)連接，則可以獲得穿膜效率較高的兩親性CPPs。

1.2.2 兩親性型兩親性型的CPPs一般具有極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)，因此共同具備親水性和疏水性。大多數(shù)的兩親性型CPPs含有偏多的正電荷，而其與陽(yáng)離子型CPPs的主要不同在于入胞機(jī)制是由于兩親性而非正電基團(tuán)[11]。

1.2.3 疏水型疏水型CPPs一般只含有非極性基團(tuán)，具有較低的凈電荷數(shù)。相比于前面提到的兩種類型的CPPs，疏水型CPPs的報(bào)道相對(duì)較少，且其入胞機(jī)制尚不明確。

2 CPPs在各領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，CPPs的研究和應(yīng)用是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)研究方向，尤其是CPPs在腫瘤治療、新藥開發(fā)、基因治療和動(dòng)物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用較廣泛。

2.1 腫瘤治療領(lǐng)域

腫瘤特異性CPPs可以運(yùn)載治療藥物靶向入胞，提高藥物的滲透性，遞送藥物的過(guò)程可以得到有效地改善，且對(duì)正常組織無(wú)損傷[6]。兩親性型的p28是天青蛋白的28個(gè)氨基酸片段，作為晚期實(shí)體瘤患者p53（腫瘤抑制蛋白）泛素化的非HDM2介導(dǎo)的肽抑制劑，被用于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療有抗性的p53陽(yáng)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者，對(duì)難治性腫瘤有效，且患者耐受性良好[12]。多數(shù)的臨床研究表明，CPPs與藥物偶聯(lián)后，具備了在腫瘤、神經(jīng)性疾病等疾病治療中的作用，TAT連接的p53蛋白以及R11連接的p53蛋白和血球凝集素HA-2，在小鼠模型經(jīng)過(guò)腹腔注射淋巴瘤后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡且能延長(zhǎng)小鼠的壽命[13]。作為一種腫瘤抑制機(jī)制，支架附著因子A（SAFA）衍生肽在調(diào)節(jié)多種SAFA分子功能、腫瘤細(xì)胞治療等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[14]。此外，B-mR9對(duì)腫瘤具有特異性靶向作用，其EPR效應(yīng)可持續(xù)48 h，B-mR9/siVEGF對(duì)NCI-H460的BALB/c鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為56.5%，治療效果優(yōu)于PEI25k和R9載體[15]。李莉等[16]合成新型穿膜肽類似物[Cys-CPT2，9]penetratin，并證明[Cys-CPT2，9]penetratin是一個(gè)新的高膜轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的CPPs，且對(duì)HeLa細(xì)胞具有抗腫瘤活性。但是，當(dāng)CPPs作用于體內(nèi)時(shí)，仍存在血漿半衰期短、生物利用度低等問(wèn)題，且其內(nèi)化機(jī)制還不清楚，安全性也不能保證[17,18]。

2.2 藥物遞送領(lǐng)域

30年來(lái)，將藥物活性分子運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)而對(duì)細(xì)胞正常生理功能不產(chǎn)生影響是一直以來(lái)人們的愿望，因此開始大量關(guān)注CPPs。CPPs在某些方向和領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)得到高度的肯定，研究成果也在逐步向臨床應(yīng)用方面轉(zhuǎn)變[2]。自TAT被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，CPPs作為載體運(yùn)輸生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的能力在體外實(shí)驗(yàn)中一直在被研發(fā)，TAT連接的-半乳糖苷酶能夠向小鼠所有組織完成遞送[19]。CPPs作為藥物遞送載體使藥物進(jìn)入細(xì)胞，甚至能穿透上皮細(xì)胞和血腦屏障，這一點(diǎn)已經(jīng)被應(yīng)用在許多疾病的治療和新藥的開發(fā)中。研究表明，將抗瘧氨基喹啉與CPPs偶聯(lián)可提供溶血偶聯(lián)物，作為不同類型的小藥物到生物大分子的載體具有較多優(yōu)勢(shì)，但由于溶血問(wèn)題，CPPs似乎不適合抗瘧藥氨基喹啉的安全細(xì)胞內(nèi)遞送[20]。章衛(wèi)華等[21]通過(guò)定量細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)考察肺癌A549細(xì)胞對(duì)RGDD/TAT-LP的攝取效率，最后整合素受體RGD與TAT共修飾載紫杉醇（PTX）脂質(zhì)體可以認(rèn)定高表達(dá)整合素受體的腫瘤細(xì)胞，穿透腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。然而，CPPs對(duì)細(xì)胞的選擇性不強(qiáng)，只借助其本身不能使藥物形成定向蓄積，作用在靶細(xì)胞或者靶組織的藥物濃度也達(dá)不到預(yù)期的效果，關(guān)于靶向載藥CPPs的研究目前主要集中在腫瘤方面，其中基本的研究思路是利用不同“刺激-響應(yīng)”策略來(lái)控制載藥CPPs進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[22]。

2.3 基因治療領(lǐng)域

在基因治療時(shí)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞中是必不可少的過(guò)程[23]。目前，基因治療臨床受限于安全高效的基因載體，載體一般有病毒載體和非病毒載體兩類，相比與病毒載體，非病毒載體更有優(yōu)勢(shì)[24]。聚精氨酸通常用于功能化納米載體以進(jìn)行基因治療和藥物遞送，目的是增強(qiáng)治療性物質(zhì)的細(xì)胞滲透性。這些活性的相對(duì)權(quán)重由構(gòu)建體的靜電荷和納米級(jí)材料的低聚狀態(tài)決定，兩者均可通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)工程方法調(diào)節(jié)純化[25]。Sina Alizadeh等[26]采用HR9、Cady-2與CPPs復(fù)合形成穩(wěn)定的納米顆粒，并以非共價(jià)方式增強(qiáng)它們向HEK-293T細(xì)胞的遞送，實(shí)驗(yàn)證明天然佐劑（Hsp27）和CPPs（HR9和Cady-2）的組合可以顯著刺激有效的免疫反應(yīng)，這對(duì)開發(fā)細(xì)胞的丙型肝炎病毒（HCV）治療疫苗是比較有前途的方法。CD2v蛋白是非洲豬瘟病毒（ASFV）EP402R基因編碼的跨膜蛋白，該蛋白含有重復(fù)的氨基酸序列（RAAS），研究表明帶有RAAS截短的CD2v蛋白可以進(jìn)入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，還可以攜帶大分子蛋白EGFP通過(guò)依賴于時(shí)間、濃度和位置的多個(gè)內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)入不同的細(xì)胞，RAAS為ASFV的研究提供了一個(gè)新的視角[27]。人工合成的新型穿膜肽也逐漸嶄露頭角，Simeon等[28]驗(yàn)證了一種基于HCV基因抑制元件篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的新型CPPs—B1，它不僅有效地介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)大分子的攝取，還能將“貨物”運(yùn)送到與生物相關(guān)的細(xì)胞環(huán)境。馬意龍[29]設(shè)計(jì)并合成了一系列基于氨氧賴氨酸的新型CPPs，研究了它的生物學(xué)性質(zhì)，其結(jié)果說(shuō)明一種基于氨氧賴氨酸的混合型CPPs，具有生物穩(wěn)定性高和細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，并且可以在細(xì)胞漿中均勻分布。

2.4 動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

將外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)有多種方法，包括原核顯微注射、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒陽(yáng)離子分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等，但這些技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率較低。近年來(lái)，由于CPPs毒性低，且它能夠相對(duì)有效地將外源DNA運(yùn)送到多種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，使得CPPs已成為一種有用的基因轉(zhuǎn)染工具[30]。此外，CPPs也被用于將“貨物”運(yùn)送到微生物細(xì)胞，如多種念珠菌、真菌病原體等[31]。許多CPPs已經(jīng)成功地將肽、寡核苷酸、蛋白質(zhì)和載藥納米顆粒等分子運(yùn)送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體[32]。HIV-1 Nef和Hsp20-Nef蛋白是在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的，Rostami Bahareh等[33]使用新型CPPs-M918以非共價(jià)方式遞送到HEK-293T哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合M918的蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)染比僅用Nef或Hsp20-Nef蛋白的效率高，M918可以增加Nef和Hsp20-Nef蛋白對(duì)細(xì)胞的滲透。紅色熒光蛋白與dsRED-9K融合在一起作為CPPs，提高了蛋白的傳遞，純化的dsRED-9K能夠有效穿透源自小鼠胚胎干細(xì)胞的所有細(xì)胞譜系[34]。通過(guò)共聚焦成像、流式細(xì)胞術(shù)和MTT法檢測(cè)雞貧血病毒（CAV）VP1蛋白（CVP1）的有效細(xì)胞穿透活性，研究發(fā)現(xiàn)CVP1肽可以有效地將蛋白質(zhì)和核酸輸送到細(xì)胞內(nèi)[35]。CPPs與蛋白的聯(lián)合作用提高了蛋白的跨膜效率。徐詠婷等[36]比較了兩種常用穿膜肽TAT和R9的體外穿膜效率、對(duì)細(xì)胞影響以及小鼠活體內(nèi)不同器官的穿膜效率，結(jié)果表明制備的兩種融合蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP均能實(shí)現(xiàn)有效穿膜，兩種CPPs對(duì)細(xì)胞影響較小，且活體實(shí)驗(yàn)證明兩種CPPs都能透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦部。伏彭輝等[4]成功表達(dá)了融合蛋白EGFP（47.3 ku）和NLSEGFP-TAT（50.1 ku），純化蛋白與水牛成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)5～8 h后，EGFP蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而NLSEGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的幫助下能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但未能顯著定位到細(xì)胞核內(nèi)。王立珍[37]報(bào)道TAT-Nb6融合蛋白被成功表達(dá)，該融合蛋白能夠進(jìn)入豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染的細(xì)胞內(nèi)，從而在細(xì)胞中起到抗病毒的作用，為抗PRRSV新型藥物的研發(fā)開辟了新途徑。

3 展望

總之，近年來(lái)大多數(shù)的CPPs被用于腫瘤治療及藥物遞送，CPPs作為運(yùn)輸載體具有重要的意義。雖然關(guān)于CPPs的內(nèi)化能力存在一些限制和不足，但它在許多疾病應(yīng)用領(lǐng)域的價(jià)值已經(jīng)得到關(guān)注和發(fā)掘，在臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)展現(xiàn)了良好的潛質(zhì)，尤其在穿透血腦屏障以及上皮組織的轉(zhuǎn)運(yùn)治療當(dāng)中取得了巨大進(jìn)展。可見(jiàn)CPPs在腫瘤治療、醫(yī)藥學(xué)及基因治療等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。