二氫麥角胺改善阿爾茨海默病狀態(tài)下的突觸萎縮及其對(duì)認(rèn)知功能的影響

陳佩佩，魏 杰，柳曉泉，劉昊晨

（中國(guó)藥科大學(xué)代謝動(dòng)力學(xué)研究中心，南京 211198）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為患者的認(rèn)知功能受損，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚［1-2］。目前已批準(zhǔn)的AD 治療藥物對(duì)認(rèn)知功能的改善作用非常有限。因此，學(xué)者一直在努力尋找干預(yù)AD 的新策略。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，突觸功能損傷或突觸缺失與AD 患者認(rèn)知受損顯著相關(guān)［3］，這提示通過(guò)改善突觸萎縮治療AD 認(rèn)知障礙可能是一種潛在的新策略。有研究表明狐猴酪氨酸激酶1（lemur tail kinase1，LMTK1）是影響突觸生長(zhǎng)的關(guān)鍵性激酶，周期依賴(lài)性蛋白激酶5（CDK5）在Ser-34 處磷酸化LMTK1，磷酸化的LMTK1 調(diào)控其下游蛋白TBC1D9B，進(jìn)而負(fù)向調(diào)控GTP 酶Rab11A 介導(dǎo)的突觸生長(zhǎng)，CDK5-LMTK1-TBC1D9B-Rab11A 級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一種調(diào)節(jié)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸形成的新的信號(hào)通路［4］。抑制LMTK1 可以明顯改善突觸萎縮，但尚未研究LMTK1 改善突觸萎縮對(duì)認(rèn)知功能的影響［5］。本研究采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法發(fā)現(xiàn)二氫麥角胺（dihydroergotamine， DHE）可以抑制LMTK1 的活性并可通過(guò)血腦屏障［6］，故選擇DHE來(lái)探究其對(duì)突觸萎縮的改善作用及其對(duì)認(rèn)知功能的影響。早在20 世紀(jì)70 年代就有臨床研究報(bào)告了麥角生物堿制劑安得靜（hydergine）治療老年性腦萎縮的臨床病例，隨后hydergine 被廣泛應(yīng)用于老年人認(rèn)知、情感障礙［7］。Kemali 等［8］發(fā)現(xiàn)麥角酸二乙胺可以提高突觸密度并改善突觸形態(tài)。DHE是一種生物活性較高的麥角生物堿衍生物，它對(duì)認(rèn)知、記憶處理和運(yùn)動(dòng)控制可能具有調(diào)節(jié)作用［9-10］。本研究采用快速老化的AD 模型小鼠SAMP8，探究DHE 對(duì)AD 模型小鼠突觸形態(tài)、突觸可塑性及認(rèn)知功能的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

CCK8 試劑（上海翌圣生物科技有限公司）；Western blot 及免疫染色相關(guān)試劑、嘌呤霉素（江蘇碧云天生物科技有限公司）；多克隆抗體PSD95、高爾基染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Alexa Fluor?488 山羊抗兔IgG（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；GAPDH 抗體、β Ⅲ-Tubulin 抗體（中國(guó)Proteintech公司）；P-TBC1D9B抗體、P-LMTK1抗體（南京金斯瑞公司）；DHE 標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)MCE 公司）；人淀粉樣蛋白1-42（吉化生物公司）；PCR 相關(guān)試劑（南京諾維贊生物科技有限公司）；其余試劑 均為市售分析純。

1.2 儀 器

倒置熒光顯微鏡 （日本Olympus 公司）；水迷宮裝置（北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司）；ANY-maze 動(dòng)物行為學(xué)采集分析軟件（英國(guó)Global Biotech 公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器公司）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；PANNORAMIC 259 全景切片掃描儀（匈牙利3dhistech 公司）；SynergyTMH1 全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰有限公司）；冰凍切片機(jī)，QuantStudio3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Themo公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（中國(guó)Tanon公司）。

1.3 細(xì)胞與動(dòng)物

鼠源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞C17.2細(xì)胞，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；SPF級(jí)雄性衰老加速小鼠耐藥1（senescence-accelerated mouse resistant 1，SAMR1）和衰老加速易感小鼠品系8（senescenceaccelerated prone mouse strain 8，SAMP8），3 月齡，購(gòu)于武漢有度生物公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2021-0025。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

AD 模型小鼠SAMP8 和對(duì)照小鼠SAMR1，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 個(gè)月，4 月齡時(shí)，將SAMP8 小鼠隨機(jī)分為3 組（每組12 只），包括疾病組（SAMP8）、SAMP8+1 mg/kg DHE 組，以及SAMP8+2 mg/kg DHE 組。相同月齡的SAMR1 小鼠（n =12）作為正?？瞻讓?duì)照組（blank-SAMR1）。小鼠腹腔注射給藥，每天1 次，連續(xù)給藥8 周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DHE的給藥劑量和周期參照文獻(xiàn)［11］。

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)

給藥完成后，每組隨機(jī)挑選3 只，處死，取海馬，進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)（抗P-LMTK1，1∶2 500，抗P-TBC1D9B，1∶800），用凝膠圖像系統(tǒng)記錄結(jié)果。通過(guò)Image J軟件分析結(jié)果。

2.3 Morris water maze水迷宮實(shí)驗(yàn)

每組剩余9 只小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程參照文獻(xiàn)［12］，主要包含：可視化平臺(tái)實(shí)驗(yàn)（visible platform trail，D1）、獲得性訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)（acquisition training trail，D2-6）、探索性實(shí)驗(yàn)（probe trail，D7）、反向?qū)嶒?yàn)（reversal trail，D8-D10）。對(duì)記錄的指標(biāo)進(jìn)行分析，包括逃生潛伏期、平均速度、穿越次數(shù)以及在目標(biāo)象限度過(guò)的時(shí)間等。

2.4 電生理實(shí)驗(yàn)

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的小鼠，每組隨機(jī)挑選3只麻醉取腦，于ACSF 中利用振動(dòng)切片機(jī)切片放入28 ℃ ACSF 中進(jìn)行孵育。轉(zhuǎn)移至記錄槽內(nèi)，2 mL/min進(jìn)行灌流。刺激腦片海馬Schaffer側(cè)枝，在CA1輻射層樹(shù)突記錄得到興奮性突觸后電位（EPSP）。雙鎢絲電極刺激脈沖（0.1 ms）每隔15 秒進(jìn)行1 次，強(qiáng)度為0.5 mA。使用Axoclamp 2B amplifier在20 kHz采樣，10 kHz過(guò)濾后輸出。使用Digitdata 1200 進(jìn)行數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換?；€(xiàn)條件：每分鐘4 次，波寬0.1 ms，持續(xù)記錄10 min。使用一個(gè)高頻刺激（high frequency stimulation，HFS，100 Hz）產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP），并在HFS后持續(xù)記錄40 min。采用pCLAMP 10.0分別測(cè)量EPSP起點(diǎn)和終點(diǎn)與負(fù)峰得差值，計(jì)算其平均值。LTP誘導(dǎo)成功標(biāo)志是HFS 后EPSP 的均值不小于基線(xiàn)的120%。

2.5 小鼠腦組織的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

“2.4”項(xiàng)中剩余的6只小鼠處死后，取半腦，固定、包埋、切片、脫蠟至水及抗原修復(fù)后。進(jìn)行封閉、一抗孵育（抗PSD95，1∶200）、二抗孵育（Alexa Fluor?488 山羊抗兔IgG，1∶500）、DAPI 染核及封片。使用Pannoramic 掃描儀掃描成像，用Caseviewer 2.4 軟件打開(kāi)進(jìn)行觀察。隨后，使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分別測(cè)量每張圖片中海馬區(qū)域陽(yáng)性的累積光密度（integrated optical density，IOD）（右1）以及對(duì)應(yīng)的組織像素面積（area），并計(jì)算出面密度（areal density，IOD/area）。

2.6 高爾基染色

將“2.5”項(xiàng)下剩余的半腦組織塊經(jīng)固定、切塊、染色后，于80%的冰醋酸中過(guò)夜浸沒(méi)，組織變軟后置于30%蔗糖溶液中切片，晾干后進(jìn)行顯影定影。用Image-Pro Plus 6.0 分別測(cè)量每張400 倍圖片中心完整神經(jīng)元上的第2 或3 樹(shù)突分支30 ～90 μm 長(zhǎng)度范圍內(nèi)樹(shù)突棘的個(gè)數(shù)，測(cè)量長(zhǎng)度及計(jì)數(shù)該長(zhǎng)度內(nèi)樹(shù)突棘數(shù)量，以每10 微米樹(shù)突棘個(gè)數(shù)作為其密度 = 樹(shù)突棘數(shù)量/樹(shù)突長(zhǎng)度 × 10。使用Image J 1.51K 分析軟件中Neuron J 插件繪制每張400倍圖片中心神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)圖，使用Shollanaly插件，以胞體為中心做間距為10 μm 的10 個(gè)同心圓，計(jì)數(shù)樹(shù)突與同心圓的交點(diǎn)數(shù)，并計(jì)算出10個(gè)交點(diǎn)數(shù)之和。

2.7 細(xì)胞毒性CCK8實(shí)驗(yàn)

在96 孔板中以每孔2 × 103接種C17.2 細(xì)胞，孵育24 h，向其中加入0，4，40，400，2 000，4 000 nmol/L的DHE稀釋液，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。孵育24， 48， 72 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，用VersaMax 酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸收度。

2.8 LMTK1 基因過(guò)表達(dá)和沉默C17.2 細(xì)胞株的構(gòu)建及效率驗(yàn)證

dcas9-SAM 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)過(guò)表達(dá)LMTK1 由吉滿(mǎn)生物科技設(shè)計(jì)合成。C17.2 細(xì)胞以每毫升1.5 ×105個(gè)密度接種于6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合30% ～40% 時(shí)依次感染dcas9-VP64 慢病毒、MS2-P65-HSF1_Hygro 慢病毒、gRNA-SAM 慢病毒（MOI =30），并在感染后依次使用殺稻瘟菌素（7.5 μg/mL）、潮霉素B（100 μg/mL）、嘌呤霉素（8 μg/mL）進(jìn)行篩選。進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證沉默的效率。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2（-ΔΔ）Ct法計(jì)算LMTK1 的相對(duì)表達(dá)量。

siRNA 靶向LMTK1 的重組慢病毒（LMTK1-siRNA：5′-GCUCAGUGCAGCUCCUCAA-dTdT-3′）和對(duì)照慢病毒（Ctrl-siRNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTd-3′）合成于上海漢恒生物科技有限公司。沉默細(xì)胞株的構(gòu)建步驟參考上述過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建。感染后用8 μg/mL 嘌呤霉素篩選48 h。進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，兔源LMTK1、兔源β-tubulin 抗體及兔源二抗稀釋比分別為1∶1 000、1∶4 000、1∶4 000。

2.9 C17.2細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C17.2 細(xì)胞，以每孔40 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，加入分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每48 小時(shí)更換新的分化培養(yǎng)基。第5 天，加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。固定、通透、封閉后，每孔加入兔源beta-Ⅲ Tubulin 抗體（1∶50）約50 μL， 4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 洗滌后，加入Alexa Fluor?488 抗兔熒光二抗（1∶500）約100 μL，避光孵育1 h。DAPI 避光染色5 min，PBST 避光洗滌。觀察并拍照。

2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 8.0，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，P的多重檢驗(yàn)采用Bonferroni 方法，結(jié)果以±s表示，P< 0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 DHE對(duì)AD小鼠海馬區(qū)域突觸密度的影響

突觸后密度蛋白95（postsynaptic density 95，PSD95）是突觸后密度區(qū)樹(shù)突棘的主要支架蛋白，可反映突觸的密度和數(shù)量，被認(rèn)為是突觸后可塑性的生物標(biāo)志物［13-14］。為探究DHE 對(duì)AD 模型小鼠海馬體內(nèi)突觸密度及可塑性的影響，從各組動(dòng)物中隨機(jī)選取6 只進(jìn)行海馬體切片及PSD95 熒光染色，由于其中一張切片海馬區(qū)域缺失，所以樣本量為5。PSD95的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖1所示：SAMP8小鼠海馬中PSD95陽(yáng)性細(xì)胞平均面密度較SAMR1 組顯著降低（P< 0.05），SAMP8+2 mg/kg DHE 組PSD95 平均面密度明顯升高（P< 0.05vsSAMP8），說(shuō)明DHE 能夠顯著增加AD 模型小鼠海馬內(nèi)的突觸密度并改善突觸可塑性。

3.2 DHE對(duì)AD模型動(dòng)物突觸萎縮的影響

樹(shù)突棘是興奮性突觸的主要突觸后元素，是記憶和認(rèn)知的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。高爾基染色結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組（SAMR1）相比，AD 模型組小鼠海馬體內(nèi)樹(shù)突棘密度顯著降低（P< 0.05）和分支數(shù)量顯著下降（P< 0.01），而DHE 給藥后，樹(shù)突棘密度和分支數(shù)量得到提高，其中DHE 高劑量組（2 mg/kg DHE）樹(shù)突棘密度顯著增加（P< 0.001vsAD 組）以及分支數(shù)量顯著提高（P< 0.05vsAD組）。DHE可以顯著改善AD小鼠的突觸萎縮。

3.3 DHE對(duì)AD小鼠海馬體突觸可塑性的影響

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）是突觸可塑性的特定表現(xiàn)形式［15］，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)量海馬CA1 區(qū)LTP 反映海馬區(qū)突觸可塑性的變化，每組3 只小鼠，每只測(cè)定2 次，其中一次LTP 誘導(dǎo)失敗，所以樣本量為5。結(jié)果表明（圖3），與正常SAMR1 小鼠相比，AD 小鼠（SAMP8）fEPSP 斜率顯著降低（P< 0.000 1），DHE 給藥2 mg/kg 組fEPSP斜率顯著升高，LTP 得到改善，DHE 能改善AD 小鼠海馬的突觸可塑性。

3.4 DHE 對(duì)AD 小鼠的認(rèn)知功能和行為評(píng)價(jià)的影響

為了探究DHE 對(duì)AD 模型小鼠認(rèn)知功能的改善作用，進(jìn)行了Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。第1天的可視化平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，觀察到各組小鼠的逃生潛伏期和游泳速度沒(méi)有顯著性差異（P> 0.05），表明各組小鼠的視力和運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有差別（圖4-A）。獲得性訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，AD 組（SAMP8）和SAMP8+1 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期未顯示出規(guī)律性變化，對(duì)照組（SAMR1）、SAMP8+2 mg/kg DHE 組小鼠的逃生潛伏期逐漸縮短，并且，在訓(xùn)練的最后一天，SAMP8+2 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期顯著低于AD 組（圖4-B）。探索性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-C所示，撤去平臺(tái)后，對(duì)照組和DHE 高劑量給藥組的小鼠在原平臺(tái)所在區(qū)域穿越的次數(shù)以及所在象限中停留的時(shí)間均顯著高于AD 對(duì)照小鼠。第10 天的反向?qū)嶒?yàn)（圖4-D）表明，與AD 組相比，對(duì)照組以及SAMP8+2 mg/kg DHE 組的逃生潛伏期顯著降低（P< 0.05）。綜上所述，DHE 改善SAMP8 小鼠的認(rèn)知功能。

Figure 1 Effect of dihydroergotamine (DHE) on the expression of postsynaptic dense 95 in hippocampus of Alzheimer’s disease (AD) mouse (± s, n = 5)

Figure 2 Effect of DHE on the density of dendritic spines and number of branches in hippocampus of AD mouse (± s, n = 6)

Figure 3 DHE improved impaired hippocampal long-term potentiation (LTP) in AD mice (± s, n = 5)

3.5 DHE 對(duì)AD 模型小鼠海馬體內(nèi)LTMK1 下游蛋白的影響

利用Western blot 實(shí)驗(yàn)探究SAMR1 和SAMP8小鼠海馬體中LMTK1 磷酸化水平的變化以及DHE 對(duì)其下游TBC1D9B 磷酸化蛋白（P-TBC）表達(dá)的影響。結(jié)果如圖5 所示，SAMP8 小鼠海馬組織LMTK1 的磷酸化程度顯著高于SAMR1 小鼠（P<0.01），并且相較SAMR1 小鼠，SAMP8 小鼠海馬體內(nèi)P-TBC 表達(dá)量顯著增加（P< 0.05）。SAMP8 小鼠連續(xù)長(zhǎng)期給予DHE 后，海馬內(nèi)P-TBC 表達(dá)顯著下降，2 mg/kg DHE 組較1 mg/kg組P-TBC下調(diào)更加顯著，DHE 對(duì)P-TBC 蛋白的下調(diào)作用具有一定的劑量依賴(lài)性。

3.6 DHE 對(duì)LMTK1 過(guò)表達(dá)C17.2 細(xì)胞突觸萎縮的影響

為研究DHE對(duì)C17.2細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)行了CCK8 實(shí)驗(yàn)。2 μmol/L 的DHE 給藥達(dá)到72 h 時(shí)，對(duì)C17.2細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用，細(xì)胞存活率為92%。

利用基因轉(zhuǎn)錄激活技術(shù)CRISPR-SAM 系統(tǒng)構(gòu)建LMTK1 過(guò)表達(dá)的C17.2 細(xì)胞株，研究DHE 對(duì)LMTK1 過(guò)表達(dá)的神經(jīng)祖細(xì)胞突觸長(zhǎng)度的影響。利用RT-qPCR測(cè)定3種穩(wěn)轉(zhuǎn)株的基因過(guò)表達(dá)效率，如圖6 轉(zhuǎn)錄激活LMTK1 表達(dá)的效率為對(duì)照組的200% ～ 350%，選擇轉(zhuǎn)染效率最高的sgRNA3 進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，探究DHE 對(duì)已分化細(xì)胞突觸長(zhǎng)度的影響。結(jié)果顯示（圖6-B），當(dāng)LMTK1 過(guò)表達(dá)，神經(jīng)祖細(xì)胞C17.2 分化的突觸長(zhǎng)度相較于野生型細(xì)胞明顯降低（P< 0.05）。與過(guò)表達(dá)細(xì)胞單獨(dú)給予Aβ1-42相比，過(guò)表達(dá)細(xì)胞DHE 給藥后突觸長(zhǎng)度顯著增加（圖6-C，P< 0.05）。表明DHE 對(duì)LMTK1過(guò)表達(dá)的C17.2細(xì)胞突觸萎縮具有改善作用。

3.7 LMTK1 沉默后DHE 對(duì)C17.2 細(xì)胞突觸萎縮的改善作用

為了驗(yàn)證DHE 是否通過(guò)抑制LMTK1 的活性發(fā)揮神經(jīng)突觸的改善作用。本研究通過(guò)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞C17.2 進(jìn)行si-LMTK1 干擾，建立LMTK1 基因沉默的細(xì)胞株。圖7 為Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C17.2細(xì)胞內(nèi)LMTK1 蛋白的沉默效率，其沉默效率為對(duì)照組的50%。沉默細(xì)胞系構(gòu)建完成后，給予DHE，進(jìn)行體外細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，研究LMTK1沉默情況下DHE 對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的突觸萎縮的影響。沉默LMTK1 后，Aβ1-42和DHE 同時(shí)給藥后，突觸長(zhǎng)度沒(méi)有顯著性改變。以上結(jié)果表明，當(dāng)LMTK1沉默后，DHE 對(duì)抗Aβ1-42誘導(dǎo)的突觸萎縮作用消失。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHE 對(duì)LMTK1具有靶向作用。

Figure 4 Effect of DHE on learning and spatial memory performance of AD mice in the morris water maze task (± s, n = 9)

Figure 5 Effect of DHE on expression of P-LMTK1 and P-TBC in hippocampus (± s, n = 3)

Figure 6 Effects of DHE on synaptic length after LMTK1 over-expression (± s)

Figure 7 Relative expression of LMTK1 in control, negative control and S-LMTK1 groups (± s, n = 3)

Figure 8 Effects of DHE on synaptic length after LMTK1 silencing (± s, n = 10)

4 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明AD 早期階段就會(huì)發(fā)生突觸結(jié)構(gòu)和功能損傷［16］，但認(rèn)知功能并未出現(xiàn)明顯的下降，此階段是AD藥物干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)［17-18］。在AD 早期增加突觸密度以及改善突觸可塑性有助于緩解AD 狀態(tài)下的認(rèn)知功能減退［19］。例如，代謝性谷氨酸受體5（mGluR5）沉默變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（SAM）被證明可以恢復(fù)海馬突觸密度，并改善AD狀態(tài)下認(rèn)知功能障礙［20］。Grimmig 等［20］通過(guò)給予老年小鼠蝦青素飲食增加了海馬體CA1-CA3 突觸的突觸可塑性，提高了記憶認(rèn)知功能，本研究也發(fā)現(xiàn)改善AD 模型小鼠的突觸損傷可以緩解認(rèn)知功能障礙。

突觸的形態(tài)和功能與認(rèn)知功能密切相關(guān)，胞內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的關(guān)鍵過(guò)程。胞內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑主要包含3個(gè)步驟：首先將形成突觸所需的物質(zhì)“打包”成早期核內(nèi)體，然后早期核內(nèi)體將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸并將其“打包”成循環(huán)核內(nèi)體；最后循環(huán)核內(nèi)體將蛋白插入到細(xì)胞膜中形成突觸，早期核內(nèi)體將需要降解的蛋白“打包”成晚期核內(nèi)體［21］。其中Rab11A 是循環(huán)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白。TBC1D9B 可以使Rab11A失活，抑制循環(huán)核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)［22］。LMTK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，以Cdk5 依賴(lài)性方式使TBC1D9B 的磷酸化水平升高，磷酸化的TBC1D9B會(huì)導(dǎo)致Rab11A 失活，進(jìn)而抑制循環(huán)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)及突觸的生長(zhǎng)［5，23］，但目前尚無(wú)LMTK1 的特異性抑制劑，本研究借助于計(jì)算機(jī)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)DHE 可以抑制LMTK1 并且可以通過(guò)血腦屏障［6］，但由于DHE 的選擇性和活性不高，只有高劑量的DHE 顯著改善了AD 模型小鼠的突觸密度、突觸可塑性以及認(rèn)知功能。并證明在AD 小鼠海馬組織內(nèi)LMTK1 的磷酸化水平升高，DHE 可以顯著降低LMTK1 下游蛋白TBC1D9B 的磷酸化水平，伴隨著突觸萎縮的改善、突觸密度的增加及認(rèn)知功能改善，上述結(jié)果提示，LMTK1 與認(rèn)知功能密切相關(guān)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHE 能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)LMTK1 導(dǎo)致的突觸萎縮，沉默LMTK1 后，DHE 對(duì)突觸損傷的改善作用消失。已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道突觸損傷與認(rèn)知功能下降密切相關(guān)［16］，上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示DHE 可能通過(guò)靶向LMTK1，調(diào)控突觸的生長(zhǎng)，發(fā)揮認(rèn)知功能的改善作用。由于DHE具有廣泛的中樞活性，其對(duì)于認(rèn)知功能的改善作用是否還涉及到其他的機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)DHE 可以顯著增加AD 模型小鼠海馬區(qū)突觸密度并改善突觸萎縮和認(rèn)知功能，其改善作用可能是通過(guò)靶向突觸生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控激酶LMTK1。這提示增加突觸密度是未來(lái)改善AD患者認(rèn)知功能的一種新策略。