PARP-1/PI3K雙靶點(diǎn)抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與生物活性

黃至誠(chéng)，葉 柳，杜 宇，古宏峰，高凡云，朱啟華，徐云根

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)系，南京 210009）

聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（poly ADPribose polymerase-1，PARP-1）抑制劑通過(guò)其特殊的合成致死機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[1]，但在臨床上主要用于治療乳腺癌易感基因1/2（breast cancer susceptibility gene 1/2，BRCA1/2）突變或缺失的腫瘤，適應(yīng)證有限；此外，臨床研究證明，由于BRCA1/2 的二次突變導(dǎo)致同源重組修復(fù)途徑恢復(fù)[2-4]，從而對(duì)PARP-1 抑制劑產(chǎn)生耐藥性，這進(jìn)一步限制了PARP-1 抑制劑的臨床應(yīng)用。因此，拓展PARP-1抑制劑的適應(yīng)證以及克服耐藥性問(wèn)題迫在眉睫[5]。PI3K 信號(hào)通路在多種腫瘤細(xì)胞中均被激活，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、遷移等生命周期活動(dòng)[6-8]。研究表明，抑制PI3K 信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單鏈損傷增加，同時(shí)還會(huì)下調(diào)BRCA1/2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制同源重組修復(fù)途徑，使腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP-1 抑制劑的敏感性增加[9-10]。目前已經(jīng)展開(kāi)了數(shù)項(xiàng)PARP-1 抑制劑和PI3K 抑制劑聯(lián)合用于治療腫瘤的試驗(yàn)且已經(jīng)取得較好的進(jìn)展[11-12]。

雖然藥物聯(lián)用可以達(dá)到協(xié)同增效的目的，但藥物聯(lián)用存在自身的局限性，比如更加復(fù)雜的藥物代謝特性、更強(qiáng)的不良反應(yīng)等[13-14]。與之相比，雙靶點(diǎn)抑制劑不但可以作用于多個(gè)病理環(huán)節(jié)而發(fā)揮協(xié)同作用，還可以避免藥物與藥物之間相互作用引發(fā)的安全性問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)PARP-1/PI3K雙靶點(diǎn)抑制劑對(duì)于克服PARP-1 抑制劑的耐藥性、擴(kuò)展PARP-1 抑制劑的適應(yīng)證以及降低由于藥物聯(lián)用產(chǎn)生的不確定性具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。課題組前期得到了多個(gè)對(duì)PARP-1/PI3K 抑制活性?xún)?yōu)異的化合物[15-17]，但存在水溶性較差的問(wèn)題。本研究在課題組已有的研究基礎(chǔ)上，以成藥性為導(dǎo)向，以化合物XW-1 和WZ-1 為先導(dǎo)化合物，通過(guò)引入脲基團(tuán)，構(gòu)造成鹽位點(diǎn)以提高化合物的水溶性，設(shè)計(jì)并合成了11 個(gè)目標(biāo)化合物，并對(duì)其進(jìn)行PAPR-1 和PI3K 酶抑制活性和多種腫瘤細(xì)胞抗增殖活性測(cè)試，具體的設(shè)計(jì)策略見(jiàn)圖1。

Figure 1 Design strategy of target compounds

1 合成路線

以化合物1[15]和2[15]為原料，通過(guò)縮合反應(yīng)得到中間體3，再分別與4-氨基苯硼酸頻哪醇酯（4a）、2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯（4b）或2-氨基-4-三氟甲基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯（4c）發(fā)生Suzuki反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體5a ～ 5c。再與氯甲酸苯酯反應(yīng)生成中間體6a ～ 6c，最后與不同的胺（7a ～ 7d）反應(yīng)生成目標(biāo)化合物8a ～ 8f。合成路線見(jiàn)圖2。

Figure 2 Synthetic routes of compounds 8a-8f

以化合物2 和9 為原料，通過(guò)縮合反應(yīng)得到中間體10，再分別與4-氨基苯硼酸頻哪醇酯（4a）、2-氨基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯（4b）或2-氨基-4-三氟甲基吡啶-5-硼酸頻哪醇酯（4c）發(fā)生Suzuki 反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體11a ～ 11c。再與氯甲酸苯酯反應(yīng)生成中間體12a ～ 12c，最后與不同的胺（7a、7b 和7d）反應(yīng)生成目標(biāo)化合物13a ～ 13e。合成路線見(jiàn)圖3。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Micros Q-TOF 型高分辨分析儀器（美國(guó)Waters公司）；Avance NEO 400 MHz 核磁共振儀（美國(guó)Bruker 公司）；RY-1 型熔點(diǎn)儀（天津市分析儀器廠）；200 ～ 300 目硅膠（山西諾泰生物科技有限公司）；HSG F254 型號(hào)TLC 硅膠板（山東青島海洋化工有限公司）；常用試劑均為市售分析純?cè)噭?。PARP-1蛋白和TMB顯色液（義翹神州公司）；pADPr抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；抗鼠IgG-HRP（美國(guó)CST 公司）；HCT116、HCC1937、MDA-MB-231 和MDA-MB-468（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；HCT116R（中國(guó)藥科大學(xué)郝海平課題組，中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（美國(guó)Sciencell 公司）；McCOY’s 5A 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基和L-15 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；MTT 試劑（美國(guó)My Bio-Science 公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Thermo 公司）；其他的測(cè)定緩沖溶液為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部配制。

Figure 3 Synthetic routes of compounds 13a-13e

2.2 化學(xué)合成

2.2.1 中間體3 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入化合物1（0.20 g，0.89 mmol）、化合物2（0.29 g，0.89 mmol）、PyBOP（0.56 g，1.07 mmol）、DIEA（0.44 mL，2.69 mmol）和DMF（5 mL），加畢，25 ℃攪拌反應(yīng)2 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加水（40 mL）和乙酸乙酯（30 mL），分取有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯（25 mL×2）萃取，合并有機(jī)層，依次用水和飽和氯化鈉溶液各洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，200∶1 ～ 20∶1），得白色固體（0.35 g，79.0%）。mp：144 ～ 146 ℃；1H NMR （400MHz，DMSO-d6）δ∶7.97（s，1H，12-NH2），7.89（s，1H，12-NH2），7.78（dd，J= 8.4，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.63（dd，J= 9.9，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.55（s，1H，Ar-H），4.00 ～ 3.60 （m，16H，17、18、20、21、30、31、33、34-CH2）；MS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd.：490.1，F(xiàn)ound：490.3。

2.2.2 中間體5a ～ 5c 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入中間體3（0.20 g，0.41 mmol）、原料4a ～ 4c（0.45 mmol）、碳酸鉀（0.16 g，1.14 mmol）的水溶液（1.5 mL），四三苯基膦鈀（0.05 g，0.04 mmol）和1,4-二氧六環(huán)（15 mL），加畢，氮?dú)獗Ｗo(hù)，轉(zhuǎn)移至100 ℃反應(yīng)8 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。冷卻至室溫，硅藻土抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，200∶1 ～ 10∶1），得白色固體。

2.2.3 中間體6a ～ 6c 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入原料5a ～ 5c（0.31 mmol）、氯甲酸苯酯（1.53 mmol）、DIEA（2.48 mmol）和DCM（20 mL），加畢，25 ℃攪拌反應(yīng)4 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，10∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全；反應(yīng)液依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水、飽和氯化鈉溶液洗1次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得透明油狀物，不經(jīng)純化直接投下一步。

2.2.4 中間體10 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入化合物9（0.50 g，1.68 mmol）、化合物2（0.54 g，1.68 mmol）、PyBOP（1.06 g，2.02 mmol）、DIEA（1.11 mL，6.71 mmol）和DMF（20 mL），加畢，25 ℃攪拌反應(yīng)2 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。加水（80 mL）和加乙酸乙酯（50 mL），分取有機(jī)層，水層再用乙酸乙酯（40 mL×2）萃取，合并有機(jī)層，依次用水和飽和氯化鈉溶液各洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，200∶1 ～ 20∶1），得黃色固體（0.83 g，87.0%）。mp：148 ～ 150 ℃；1H NMR （400MHz，DMSO-d6）δ∶12.57（s，1H，9-NH），8.27 （d，J= 7.8 Hz，1H，Ar-H），7.99 ～ 7.81（m，3H，Ar-H），7.48 ～ 7.43（m，1H，Ar-H），7.38（d，J= 6.5 Hz，1H，Ar-H），7.25（t，J= 9.0 Hz，1H，Ar-H），4.35（s，2H，12-CH2），3.80 ～ 3.63（m，14H，23、24、26、27、36、37、39-CH2），3.27 ～ 3.20（m，2H，40-CH2）；MS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd.：565.1，F(xiàn)ound：565.3。

2.2.5 中間體11a ～ 11c 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入中間體10（0.20 g，0.29 mmol）、原料4a ～4c（0.32 mmol）、碳酸鉀（0.11 g，0.81 mmol）的水溶液（1.5 mL），四三苯基膦鈀（0.04 g，0.03 mmol）和1,4-二氧六環(huán)（15 mL），加畢，氮?dú)獗Ｗo(hù)，轉(zhuǎn)移至100 ℃反應(yīng)8 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。冷卻至室溫，硅藻土抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，200∶1 ～ 10∶1），得白色固體。

2.2.6 中間體12a ～ 12c 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入原料11a ～ 11c（0.24 mmol）、氯甲酸苯酯（1.20 mmol）、DIEA（1.93 mmol）和DCM（20 mL），加畢，25 ℃攪拌反應(yīng)4 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，10∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全；反應(yīng)液依次用飽和碳酸氫鈉溶液、水、飽和氯化鈉溶液洗一次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得透明油狀物，不經(jīng)純化直接投下一步。

2.2.7 目標(biāo)化合物8a ～ 8f 的合成 向100 mL 三頸瓶中加入中間體6a ～ 6c（0.31 mmol）、原料7a ～7d（0.62 mmol）、DIEA（0.93 mmol）和四氫呋喃（25 mL），加畢轉(zhuǎn)移至70 ℃反應(yīng)4 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，100∶1 ～ 10∶1），得白色固體。

2.2.8 目標(biāo)化合物13a ～ 13e 的合成 向100 mL三頸瓶中加入中間體12a ～ 12c（0.24 mmol）、原料7a、7b 或7d（0.48 mmol）、DIEA（0.72 mmol）和四氫呋喃（25 mL），加畢轉(zhuǎn)移至70 ℃反應(yīng)4 h，TLC（二氯甲烷-甲醇，6∶1）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。濾液減壓濃縮，硅膠柱色譜純化（二氯甲烷-甲醇，100∶1 ～ 10∶1），得白色固體。

2.3 酶抑制活性測(cè)試

以?shī)W拉帕尼為陽(yáng)性對(duì)照。96 孔板每孔加入組蛋白的PBS 溶液[20 μg(0.14 μmol)/mL] 100 μL，冰箱4 ℃孵育過(guò)夜。倒出PBS 溶液，PBST 洗板2 次。每孔加入封閉液200 μL，室溫孵育2 h 后，倒出封閉液，PBST 洗板2 次，PARP1 緩沖液洗板1 次。每孔依次加入含或不含有化合物的反應(yīng)緩沖液50 μL 和PARP 蛋白（0.2 μg/mL，溶于PARP 緩沖液）50 μL，室溫反應(yīng)45 min。倒出反應(yīng)緩沖液，PBST 洗板2 次。每孔加入pADPr 抗體（1∶1 500）100 μL，室溫孵育1 h。倒出溶液，PBST 洗板2 次。每孔加入抗鼠IgG-HRP（1∶2 000）100 μL，室溫孵育30 min。倒出溶液，PBST 洗板4 次。每孔加入TMB 顯色液100 μL，避光反應(yīng)約15 min（觀察顏色），每孔加入2 mol/L H2SO450 μL 以終止反應(yīng)。使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸收度，通過(guò)吸收度計(jì)算出PARP-1 抑制活性，以半數(shù)抑制濃度IC50表達(dá)。

PI3K 酶抑制活性測(cè)試委托上海睿智生物醫(yī)藥有限公司完成。以BKM120 為陽(yáng)性藥，采用ADPGlo 方法測(cè)定PI3K 抑制活性。用Echo 轉(zhuǎn)移的1 ×激酶緩沖液50 nL 到384 孔板的化合物孔，陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中分別轉(zhuǎn)移50 nL的DMSO。用1 × 激酶緩沖液配制2倍終濃度的激酶溶液。在化合物孔和陽(yáng)性對(duì)照孔分別加2 倍終濃度的激酶溶液2.5 μL，在陰性對(duì)照孔中加2.5 μL 的1 × 激酶緩沖液，振蕩混勻后室溫孵育10 min。再用1 × 激酶緩沖液配制2 倍終濃度的ATP 和底物P1P2 的混合溶液，每孔加入2 倍終濃度的ATP 和底物的混合溶液2.5 μL 以起始反應(yīng)，振蕩混勻后室溫反應(yīng)60 min，再加入ADP-Glo 試劑5 μL，振蕩混勻后室溫孵育180 min。最后每孔加入激酶檢測(cè)試劑10 μL，振蕩混勻后室溫孵育30 min。使用酶標(biāo)儀讀取吸收度，并計(jì)算各化合物的抑制率。

2.4 腫瘤細(xì)胞抗增殖活性測(cè)試

以?shī)W拉帕尼和BKM120為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-468，BRCA1 突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCC1937、BRCA2 突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116以及對(duì)奧拉帕尼耐藥的BRCA2突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116R的體外抗細(xì)胞增殖活性。分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔1 500 ～ 4 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種在96 孔板上。培養(yǎng)18 h 后，棄去培養(yǎng)基，施藥區(qū)最大藥物濃度孔加入2倍終濃度的藥液（100 μL），設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，兩倍梯度稀釋得8 個(gè)濃度，最終體系為200 μL。孵育7 d 后，每孔加入MTT 試劑20 μL，孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基和MTT，每孔加入DMSO 150 μL 以溶解甲瓚，搖床上振蕩10 min，使用多功能酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸收度，通過(guò)吸收度計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率，以半數(shù)抑制濃度IC50表達(dá)。

3 結(jié)果與討論

3.1 圖譜解析

N-(4-(4-(4-(7-氨基甲?；?5-氟苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)-6-嗎啉-1,3,5-三嗪-2-基)苯基)-4-甲基哌嗪-1-甲酰胺（8a）

白色固體，收率62.8%。mp：204 ～ 206 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.84（s，1H，40-NH），8.26（d，J= 8.4 Hz，2H，Ar-H），7.97（s，1H，12-NH2），7.89（s，1H，12-NH2），7.77（dd，J= 8.2，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.65 ～ 7.58（m，3H，Ar-H），7.55（s，1H，Ar-H），4.10 ～ 3.82（m，12H，17、18、20、21、30、34-CH2），3.72 ～ 3.66（m，4H，31、33-CH2），3.54 ～ 3.49（m，4H，44、48-CH2），2.44 ～2.35（m，4H，45、47-CH2），2.24（s，3H，49-CH3）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.64，165.04（d，J= 5.05 Hz），164.47，159.88，158.87，157.51，155.06，150.97，147.83，144.48，130.01，129.37（d，J= 11.1 Hz），129.07（2C），121.67（d，J= 8.08 Hz），118.82（2C），114.56，114.29，111.56，111.52，111.30，111.05，66.52（2C），54.96（2C），46.19（2C），44.14（2C），43.75（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C33H37FN10O5：673.293 2，F(xiàn)ound： 673.293 8。

2-(4-(4-(6-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)脲基)吡啶-3-基)-6-嗎啉-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羰基)-5-氟苯并呋喃-7-甲酰胺（8b）

白色固體，收率82.3%。mp：178 ～ 180 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶9.51（s，1H，Ar-H），9.06（s，1H，40-NH），8.45（dd，J= 8.7，2.3 Hz，1H，12-NH2），7.98 ～ 7.86（m，2H，12-NH2，ArH），7.81（s，1H，Ar-H），7.70（dd，J= 8.2，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.57（dd，J= 9.7，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.51 ～7.46（m，2H，42-NH，Ar-H），4.01 ～ 3.93（m，2H，17-CH2），3.89 ～ 3.73（m，10H，18、20、21、30、34-CH2），3.65 ～ 3.59（m，4H，31、33-CH2），3.25 ～3.20（m，2H，45-CH），2.32（t，J= 6.4 Hz，2H，44-CH2），2.14（s，6H，47、48-CH3）；13C NMR（101MHz，DMSO-d6）δ∶168.38，164.79（d，J= 5.05 Hz），164.47，158.87，159.69（d，J =239 Hz），156.08，154.94，150.96，148.28，147.84，138.02，129.42，129.31，125.73，121.70，121.62，114.57，114.30，111.57（d，J= 4.04 Hz），111.31，111.07（d，J= 3.03 Hz），66.49（2C），58.69（2C），45.26（2C），43.76（2C），37.21（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C31H36FN11O5：662.288 5，F(xiàn)ound：662.289 1。

N-(5-(4-(4-(7-氨基甲?；?5-氟苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)-6-嗎啉-1,3,5-三嗪-2-基)-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)4-甲基哌嗪-1-甲酰胺（8c）

白色固體，收率79.5%。mp：184 ～ 186 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶9.97（s，1H，Ar-H），8.81（s，1H，40-NH），8.28（s，1H，12-NH2），7.95（s，1H，12-NH2），7.89（s，1H，Ar-H），7.77（dd，J= 8.2，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.62（dd，J= 9.8，2.7Hz，1H，Ar-H），7.54（s，1H，Ar-H），3.96 ～ 3.90（m，6H，17、18、21-CH2），3.83 ～ 3.75（m，8H，20、30、31、34-CH2），3.69 ～ 3.61（m，6H，33、44、48-CH2），2.37 ～ 2.31（m，4H，45、47-CH2），2.21（s，3H，49-CH3）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.61，164.50，164.47，159.87，158.92，157.49，156.27，154.53，153.96，151.20，150.87，147.84，136.43，129.37（d，J= 10.1 Hz），125.53，124.35（d，J=275 Hz），121.66（d，J= 8.08 Hz），114.40（d，J=27.2 Hz），111.52，111.17（d，J= 25.2 Hz），109.84，66.41（2C），54.55（2C），45.67（2C），43.95（2C），43.14（2C），28.42（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C33H35F4N11O5：742.275 9，F(xiàn)ound：742.276 6。

N-(5-(4-(4-(7-氨基甲?；?5-氟苯并呋喃-2-羰基)哌嗪-1-基)-6-嗎啉-1,3,5-三嗪-2-基)-4-(三氟甲基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺（8d）

白色固體，收率70.4%。mp:218 ～ 220 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶10.03（s，1H，Ar-H），8.81（s，1H，40-NH），8.26（s，1H，12-NH2），7.91（s，1H，12-NH2），7.85（s，1H，Ar-H），7.75（dd，J= 8.2，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.61（dd，J= 9.7，2.7Hz，1H，Ar-H），7.53（s，1H，Ar-H），3.95 ～ 3.89（m，6H，17、18、21-CH2），3.80 ～ 3.75（m，6H，20、30、34-CH2），3.69 ～ 3.62（m，4H，31、33-CH2），3.61 ～3.55（m，4H，44、48-CH2），2.97 ～ 2.92（m，4H，45、47-CH2）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.59，164.50，159.87，158.93，157.49，156.23，154.53，151.22，150.87，147.84，136.77，136.45，129.37（d，J= 10.1 Hz），125.60，123.34（d，J= 275 Hz），121.65（d，J= 8.08 Hz），114.40（d，J= 27.2 Hz），111.52，111.17（d，J= 25.2 Hz），109.82，66.41（2C），44.37（4C），43.74（4C），43.44（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C32H33F4N11O5：728.260 2，F(xiàn)ound：728.260 8。

2-(4-(4-(6-(3-環(huán)丙基脲基)-4-(三氟甲基)吡啶-3-基)-6-嗎啉-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羰基)-5-氟苯并呋喃-7-甲酰胺（8e）

白色固體，收率83.4%。mp:208 ～ 210 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶9.76（s，1H，Ar-H），8.78（s，1H，40-NH），8.20（s，1H，12-NH2），7.91（s，1H，12-NH2），7.86（s，1H，Ar-H），7.82（s，1H，Ar-H），7.75（dd，J= 8.1，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.61（dd，J= 9.7，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.53（s，1H，42-NH），3.98 ～ 3.86（m，6H，17、18、21-CH2），3.82 ～3.74（m，6H，20、30、34-CH2），3.66 ～ 3.61（m，4H，31、33-CH2），2.63 ～ 2.58（m，1H，44-CH），0.70 ～0.64（m，2H，45-CH2），0.49 ～ 0.43（m，2H，46-CH2）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.45，164.50，164.47，159.87，158.90，157.50，155.43，155.38，151.42，150.89，147.84，137.20，136.88，129.35（d，J= 9.09 Hz），124.92，123.22（d，J=274 Hz），121.65（d，J= 8.08 Hz），114.41（d，J=27.2 Hz），111.55，111.17（d，J= 25.2 Hz），108.41，66.41（2C），43.74（4C），22.78（2C），6.75（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd.for C31H30F4N10O5：699.2337，F(xiàn)ound：699.234 2。

2-（4-（4-（6-（3-（2-（二甲基氨基）乙基）脲基）-4-（三氟甲基）吡啶-3-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）哌嗪-1-羰基）-5-氟苯并呋喃-7-甲酰胺（8f）

白色固體，收率85.8%。mp：222 ～ 224 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶9.81（s，1H，Ar-H），8.79（s，1H，40-NH），8.17（s，1H，12-NH2），7.91（s，1H，12-NH2），7.85（s，1H，Ar-H），7.75（dd，J= 8.2，2.7 Hz，1H，Ar-H），7.61（dd，J= 9.8，2.7Hz，1H，Ar-H），7.53（s，1H，Ar-H，），7.46（s，1H，42-NH），4.01 ～ 3.86（m，6H，17、18、21-CH2），3.85 ～3.75（m，6H，20、30、34-CH2），3.69 ～ 3.61（m，4H，31、33-CH2），3.29 ～ 3.24（m，2H，45-CH2），2.41（t，J= 6.3 Hz，2H，44-CH2），2.26（s，6H，47、48-CH3）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.49，164.50，164.46，159.87，158.90，157.50，155.58，154.66，151.42，150.88，147.84，137.47（d，J= 68.6 Hz），136.50，129.35（d，J= 9.09 Hz），124.82，123.25（d，J= 275 Hz），121.65（d，J= 8.08 Hz），114.41（d，J= 27.2 Hz），111.54，111.17（d，J= 25.2 Hz），108.41，108.35，66.41（2C），58.67（2C），45.45（2C），43.73（2C），37.43（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C32H35F4N11O5：730.275 9，F(xiàn)ound：730.276 6。

N-（4-（4-（4-（2-氟-5-（（4-氧代-3，4-二氫酞嗪-1-基）甲基）苯甲酰基）哌嗪-1-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）-4-甲基哌嗪-1-甲酰胺（13a）

白色固體，收率81.5%。mp：188 ～ 190 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶12.61（s，1H，9-NH），8.78（s，1H，46-NH），8.28 ～ 8.25（d，J= 8.0 Hz，1H，Ar-H），8.24 ～ 8.21（d，J= 8.0 Hz，2H，Ar-H），7.98（d，J= 8.0 Hz，1H，Ar-H），7.93 ～ 7.88（t，J= 8.0 Hz，1H，Ar-H），7.87 ～ 7.82（t，J= 8.0 Hz，1H，Ar-H），7.59（d，J= 8.6 Hz，2H，Ar-H），7.46（m，1H，Ar-H），7.39（dd，J= 6.5，2.3 Hz，1H，Ar-H），7.26（t，J= 9.0 Hz，1H，Ar-H），4.35（s，2H，12-CH2），3.99 ～ 3.63（m，14H，23、24、26、27、36、37、40-CH2），3.49 ～ 3.43（m，4H，39、50-CH2），3.28 ～3.24（m，2H，54-CH2），2.36 ～ 3.30（m，4H，51、53-CH2），2.21（s，3H，55-CH3）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶169.62，165.05，164.50，159.85，158.11，155.68，155.03，145.34，144.46，135.31，135.28（d，J= 6.06 Hz），133.96，132.20（d，J =8.08 Hz），132.00，130.01，129.57（2C），129.41（d，J= 4.04 Hz），129.09，128.40，126.55，125.96，124.22，124.04，118.80（2C），116.54，116.32，66.51（2C），54.84（2C），46.01（2C），44.00（2C），43.75，36.94（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C39H42FN11O4：748.340 5，F(xiàn)ound：748.340 8。

1-（2-（二甲基氨基）乙基）-3-（4-（4-（2-氟-5-（（4-氧代-3，4-二氫酞嗪-1-基）甲基）苯甲酰基）哌嗪-1-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲（13b）

白色固體，收率85.4%。mp：192 ～ 194 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶12.61（s，1H，9-NH），9.01（s，1H，46-NH），8.30 ～ 8.21（m，3H，Ar-H），7.98（d，J= 8.1 Hz，1H，Ar-H），7.94 ～ 7.88（m，1H，Ar-H），7.86 ～ 7.80（m，1H，Ar-H），7.53 ～7.43（m，3H，Ar-H），7.38（d，J= 8.6 Hz，1H，Ar-H），7.26（t，J= 9.0 Hz，1H，Ar-H），6.22（t，J= 5.4Hz，1H，48-NH），4.35（s，2H，12-CH2），3.99 ～ 3.58（m，14H，23、24、26、27、36、37、40-CH2），3.28 ～3.16（m，4H，39、50-CH2），2.36（t，J= 6.2 Hz，2H，51-CH2），2.20（s，6H，53、54-CH3）；13C NMR（101MHz，DMSO-d6）δ∶169.61，165.04，164.50，161.52，159.85，158.12，155.68，155.31，145.33，144.42，135.29（d，J= 4.04 Hz），133.95，132.24（d，J= 6.06 Hz），132.16，131.99，129.57，129.51（d，J= 4.04 Hz），129.35（2C），128.39，126.55，125.95，124.23，124.04，116.95（2C），116.53，116.32，66.51（2C），58.85（2C），45.51，45.43（2C），43.74，37.35，36.94；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C38H42FN11O4：736.340 5，F(xiàn)ound：736.341 2。

1-（2-（二甲基氨基）乙基）-3-（5-（4-（4-（2-氟-5-（（4-氧代-3，4-二氫酞嗪-1-基）甲基）苯甲酰基）哌嗪-1-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）吡啶-2-基）脲（13c）

白色固體，收率81.4%。mp：180 ～ 182 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶12.60（s，1H，9-NH），9.57（s，1H，Ar-H），9.10（s，1H，46-NH），8.49（s，1H，Ar-H），8.27（d，J= 7.8 Hz，1H，Ar-H），8.04 ～ 7.95（m，2H，Ar-H），7.91（t，J= 7.6 Hz，1H，Ar-H），7.84（t，J= 7.5 Hz，1H，Ar-H），7.54（d，J=8.8 Hz，1H，Ar-H），7.50 ～ 7.44（m，1H，Ar-H），7.39（dd，J= 6.5，2.3 Hz，1H，Ar-H），7.26（t，J=9.0 Hz，1H，48-NH），4.35（s，2H，12-CH2），3.97 ～3.63（m，16H，23、24、26、27、36、37、39、40-CH2），3.29 ～ 3.24（m，2H，50-CH2），2.43（s，2H，51-CH2），2.24（s，6H，53、54-CH3）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶168.38，164.80，164.50，159.85，158.11，156.10，155.68，154.90，148.31，145.33，138.02，135.30（d，J =3.03 Hz），133.96，132.23（d，J= 9.09 Hz），132.00，129.57，129.40（d，J=4.04 Hz），128.39，126.55，125.96，125.68，124.20，124.02，116.54，116.33，111.06，66.48（2C），58.83（2C），45.43（2C），43.76，37.38（2C），36.93（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C37H41FN12O4：737.335 8，F(xiàn)ound：737.336 5。

1-環(huán)丙基-3-（5-（4-（4-（2-氟-5-（（4-氧代-3，4-二氫酞嗪-1-基）甲基）苯甲?；┻哙?1-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）吡啶-2-基）脲（13d）

白色固體，收率86.8%。mp：236 ～ 238 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶12.60（s，1H，9-NH），9.43（s，1H，Ar-H），9.11（s，1H，46-NH），8.50（s，1H，Ar-H），8.27（dd，J= 7.8，1.5 Hz，1H，Ar-H），8.12（s，1H，Ar-H），7.98（d，J= 8.0 Hz，1H，Ar-H），7.93 ～ 7.87（m，1H，Ar-H），7.84（td，J= 7.5，7.1，1.3 Hz，1H，Ar-H），7.52（d，J= 8.9 Hz，1H，Ar-H），7.49 ～ 7.43（m，1H，Ar-H），7.39（dd，J=6.5，2.3 Hz，1H，Ar-H），7.26（t，J= 9.0 Hz，1H，48-NH），4.35（s，2H，12-CH2），3.92 ～ 3.66（m，14H，23、24、26、27、36、37、40-CH2），3.26（s，2H，39-CH2），2.66 ～ 2.60（m，1H，50-CH），0.70 ～ 0.62（m，2H，51-CH2），0.50 ～ 0.42（m，2H，52-CH2）；13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶168.33，164.79，164.49，159.85，158.10，155.92，155.68，155.64，148.31，145.33，138.07，135.30（d，J= 3.03 Hz），133.96，132.19（d，J= 8.08 Hz），132.00，129.57，129.41（d，J= 4.04 Hz），128.39，126.55，125.95，125.76，124.20，124.02，116.54，116.32，111.06，66.48（2C），43.75（2C），36.93（2C），22.74（2C），6.79（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C36H36FN11O4∶706.293 6，F(xiàn)ound：706.294 1。

1-環(huán)丙基-3-（5-（4-（4-（2-氟-5-（（4-氧代-3，4-二氫酞嗪-1-基）甲基）苯甲酰基）哌嗪-1-基）-6-嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）-4-（三氟甲基）吡啶-2-基）脲（13e）

白色固體，收率81.2%。mp：228 ～ 230 ℃；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ∶12.60（s，1H，9-NH），9.61（s，1H，Ar-H），8.79（s，1H，46-NH），8.27（d，J= 7.7 Hz，1H，Ar-H），8.13（s，1H，Ar-H），7.97（d，J= 7.9 Hz，1H，Ar-H），7.89（s，1H，Ar-H），7.83（s，1H，Ar-H），7.56（s，1H，Ar-H），7.46（s，1H，Ar-H），7.39（dd，J= 6.6，2.3 Hz，1H，Ar-H），7.25（t，J= 9.0 Hz，1H，48-NH），4.35（s，2H，12-CH2），3.86 ～ 3.64（m，14H，23、24、26、27、36、37、40-CH2），3.25（s，2H，39-CH2），2.62（d，J= 7.0 Hz，1H，50-CH），0.69（d，J= 7.1 Hz，2H，51-CH2），0.48（s，2H，52-CH2）；13C NMR（101 MHz，DMSOd6）δ∶169.42，164.53，164.49，159.85，158.10，155.67，155.42，155.39，151.46，145.32，137.03（q，J= 32.3 Hz），135.30（d，J= 3.03 Hz） 133.93，132.21（d，J= 8.08 Hz），131.99，129.56，129.38，128.40，126.55，125.96，124.88，124.17，123.99，121.84，116.55，116.33，108.41（d，J= 6.06 Hz），66.40（2C），43.75（2C），36.95（2C），22.78（2C），6.75（2C）；HRMS（ESI）：m/z［M+H］+Calcd. for C37H35F4N11O4：774.281 0，F(xiàn)ound：774.281 8。

3.2 生物活性實(shí)驗(yàn)

為了研究目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性，測(cè)試了全部11 個(gè)化合物的酶抑制活性以及3 個(gè)化合物的體外抗細(xì)胞增殖活性。選取的細(xì)胞有野生型人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 和MDA-MB-468、BRCA 突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCC1937 和HCT116 以及對(duì)奧拉帕尼耐藥的BRCA 突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116R。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

Table 2 Enzyme inhibition of 8a-8f and 13a-13e against PARP-1 and PI3K (n = 3)

Table 3 Effects of compound 8b,8e and 8f against tumor cell lines (± s, n = 4)

Table 3 Effects of compound 8b,8e and 8f against tumor cell lines (± s, n = 4)

Compd.8b 8e 8f Olaparib BKM120 IC50/(μmol/L)MDA-MB-231 3.61 ± 0.11 1.76 ± 0.16 0.54 ± 0.002 10.30 ± 0.80 1.77 ± 0.03 MDA-MB-468 1.30 ± 0.93 0.10 ± 0.10 0.19 ± 0.18 1.00 ± 0.15 2.72 ± 2.41 HCC1937 4.27 ± 1.17 1.11 ± 0.47 0.91 ± 0.27 11.22 ± 1.92 1.65 ± 0.47 HCT116 7.26 ± 0.08 0.99 ± 0.22 1.10 ± 0.13 4.60 ± 0.51 0.78 ± 0.05 HCT116R 6.92 ± 3.70 1.07 ± 0.71 1.22 ± 0.59 50.82 ± 0.66 1.30 ± 0.55

由表2 可知，化合物8a ～ 8f 的PARP-1 抑制活性稍弱于化合物13a ～ 13e，但化合物8e 和8f 顯示出稍好的PI3K 抑制活性。由13a ～ 13d 可知，當(dāng)芳香環(huán)的4 位沒(méi)有取代基時(shí)，由化合物13d 與PI3Kα蛋白的對(duì)接結(jié)果可知，三嗪環(huán)與吡啶環(huán)之間的夾角較小，吡啶環(huán)的2位氨基與PI3Kα 蛋白的氨基酸殘基之間未能形成氫鍵相互作用（圖4-A），因此PI3K 抑制活性大幅度降低。當(dāng)芳香環(huán)的4 位引入三氟甲基后，由化合物13e 與PI3Kα 蛋白的對(duì)接結(jié)果可知，三嗪環(huán)與吡啶環(huán)之間形成的夾角增大，吡啶環(huán)2 位氨基與PI3Kα 蛋白的氨基酸殘基之間形成了氫鍵作用（圖4-B），從而提高了PI3K 抑制活性。因此，相比于4 位無(wú)取代基的化合物13a ～13d，化合物13e 的PI3K 抑制活性明顯得到提升，但是會(huì)損失小部分的PARP-1 抑制活性。同時(shí)，由8c ～ 8f 可知，通過(guò)脲基團(tuán)連接的末端片段體積或剛性不宜過(guò)大，否則也會(huì)對(duì)PI3K 的抑制活性產(chǎn)生不利影響，但是不會(huì)影響PARP-1 的抑制活性。甚至，如果在末端片段的位置有裸露的NH 基團(tuán)，反而提高了PARP-1的抑制活性。

Figure 4 Binding model analysis of compound 13d and 13e with PI3Kα

根據(jù)酶抑制活性測(cè)定結(jié)果，選擇對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)的抑制活性均較好的化合物8b，8e和8f，測(cè)試它們的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。由表3 可知，3 個(gè)化合物對(duì) MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937 和HCT116R 的增殖抑制活性強(qiáng)于陽(yáng)性藥奧拉帕尼；其中8e 和8f 對(duì)HCT116R 的IC50達(dá)到1 μmol/L 水平。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酶抑制活性結(jié)果基本一致。

本研究選擇化合物8b和8f制成相應(yīng)的鹽酸鹽并進(jìn)行水溶性測(cè)試。其中化合物8f的水溶性較好，為2.9 mg/mL，化合物8b 的水溶性為1.1 mg/mL，與先導(dǎo)化合物相比，化合物的水溶性得到了顯著的提升。

4 總結(jié)與展望

PARP-1 抑制劑對(duì)BRCA1/2 突變的腫瘤患者具有較好的療效，但存在臨床適應(yīng)證窄和易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，從而限制了PARP-1 抑制劑的廣泛應(yīng)用。PI3K 抑制劑可以抑制BRCA1/2 的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP-1 抑制劑敏感。因此，開(kāi)發(fā)PARP-1 和PI3K 雙靶點(diǎn)抑制劑有望拓展PARP-1 抑制劑的臨床使用范圍，解決PARP-1 抑制劑的耐藥性問(wèn)題。

本研究中，以課題組前期研究獲得的PARP-1和PI3K 雙靶點(diǎn)化合物XW-1 和WZ-1 為先導(dǎo)物，以提高化合物水溶性為目標(biāo)，通過(guò)連接脲基團(tuán)并引入成鹽位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了11個(gè)目標(biāo)化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)1H NMR、13C NMR 和 HRMS 確證。通過(guò)PAPR-1和PI3K抑制活性評(píng)價(jià)和腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)化合物8f 不僅具有較強(qiáng)的PAPR-1和PI3K 抑制活性，同時(shí)對(duì)所選的5 種腫瘤細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制活性。與先導(dǎo)化合物相比，化合物8f 鹽酸鹽的水溶性得到顯著提升。本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成藥性好、抑制活性強(qiáng)的PARP-1/PI3K雙靶點(diǎn)抑制劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。