基于HPLC法的黃芩和粘毛黃芩藥用活性成分相似性、多樣性評價

郭　玲，雷成康，楊范莉，段重陽，白成科*(.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安　709；.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安　70054；.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安　7006)

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基于HPLC法的黃芩和粘毛黃芩藥用活性成分相似性、多樣性評價

郭玲1，雷成康2，楊范莉3，段重陽1，白成科1*(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710119；2.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安710054；3.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061)

摘要：目的評價黃芩及粘毛黃芩中活性成分的相似性及多樣性，研究不同干燥方法對兩者的影響。方法在資源調(diào)查、收集的基礎(chǔ)上，經(jīng)不同干燥方法處理后，以HPLC法測定活性成分含量，并進(jìn)行對比分析。結(jié)果60 ℃烘干提高了黃芩中的黃芩素含量，對其他成分沒有顯著影響；但對粘毛黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的含量有一定程度的降低。另外，粘毛黃芩中未檢出野黃芩苷；粘毛黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的含量(分別為9.89%和2.27%)與黃芩(分別為10.23%和2.33%)相比無顯著差異(P>0.05)，但黃芩素和漢黃芩素的含量(分別為0.21%和0.08%)均顯著低于黃芩(分別為0.40%和0.16%)(P<0.05)。結(jié)論不同干燥方法對活性成分有一定影響，粘毛黃芩與黃芩活性成分有差異。

關(guān)鍵詞：黃芩；粘毛黃芩；活性成分；相似性;多樣性；高效液相色譜法

黃芩(Radix Scutellariae)為唇形科(Labiatae)黃芩屬植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根;性寒、味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒和安胎之功，為常用中藥，用量在中藥材市場上位居前10[1-2]。黃芩的化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等[3]，其中黃酮類是其最主要的有效成分，目前鑒定出結(jié)構(gòu)的黃酮類成分已超過40種[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩起主要作用的藥用活性成分為黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)、漢黃芩苷(wogonoside)、漢黃芩素(wogonin)等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、心血管保護(hù)和抗高血糖等生物活性[1,7-9]。

黃芩屬植物達(dá)360多種，我國有98種43個變種，廣泛分布，南北均有，多為野生[2]。除《中國藥典》收載的正品黃芩(S.baicalensisGeorgi)外，在部分地區(qū)，與黃芩同屬的其他近緣植物的根也可代黃芩藥用，如在吉林、河北、內(nèi)蒙和山東等地常用粘毛黃芩(S.viscidulaBge.) 的根作為黃芩的代用品[1,10]。黃芩和粘毛黃芩同為黃芩亞屬狹葉黃芩亞組的黃芩系，分類上種間存在較近的親緣關(guān)系[11]。

筆者所在課題組前期對黃芩屬藥用植物資源實(shí)地調(diào)查和標(biāo)本信息查詢發(fā)現(xiàn)，黃芩野生資源分布在N25°～50°、E100°～130°范圍內(nèi)，主要分布在我國東北地區(qū)(吉林和遼寧)、華北地區(qū)(內(nèi)蒙古、河北和山西)和西北地區(qū)(陜西和甘肅)，其中內(nèi)蒙古東南部、河北、山西大部分地區(qū)和陜西的秦嶺以北地區(qū)是黃芩野生資源主要集中分布區(qū)。前期資源普查結(jié)果表明：黃芩最適宜生長在海拔約1 000 m、中性或偏堿性的土壤、年平均溫度范圍在-1.1～21.3 ℃、年降雨量在487 mm的環(huán)境。由于黃芩市場需求量大幅增加，野生資源已難以滿足市場需求。粘毛黃芩野生資源主要分布在黃河流域和黃土高原地區(qū)，內(nèi)蒙古大部分地區(qū)、河北的南部、山西的中北部和陜西的北部都是粘毛黃芩的集中分布區(qū)。其中內(nèi)蒙古境內(nèi)大部分地區(qū)均有分布，分布面積最多，野生資源儲量也最大。粘毛黃芩一般適宜生長在土壤pH值為8.0左右、海拔1 300 m左右、年降雨量在400 mm的沙質(zhì)土壤中。粘毛黃芩野生資源采挖和破壞較輕，野生資源儲量豐富。

綜合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對黃芩屬藥用植物的研究主要集中在藥用活性成分的提取分離[12-13]、結(jié)構(gòu)鑒定、藥理藥效和種質(zhì)資源收集方面[5-7,14-16]，缺乏深入探討和揭示黃芩屬種間主要藥用活性成分的多樣性及其含量方面的研究。本文在黃芩屬藥用植物種質(zhì)資源調(diào)查、收集和保存鑒定的基礎(chǔ)上，采集種質(zhì)圃同一生態(tài)條件下黃芩和粘毛黃芩的根，采用室內(nèi)自然晾干和烘箱恒溫烘干的方法，應(yīng)用高效液相色譜法測定黃芩及粘毛黃芩中6種藥用活性成分含量，旨在通過揭示黃芩和粘毛黃芩種間藥用活性成分的差異，為進(jìn)一步綜合開發(fā)利用和合理保護(hù)黃芩屬藥用植物資源提供參考。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(Thermo Fisher UltiMate 3000型)；Chromeleon 7.2.1色譜工作站；十萬分之一電子天平(賽多利斯BT25S型)； 超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司KQ-300V型)。

1.2試藥野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素對照品均購于中國藥品生物制品檢定研究院。

課題組在2011年7月進(jìn)行的黃芩屬植物種質(zhì)資源調(diào)查時，分別在河北承德市興隆縣(N40°25′，E117°29′)和內(nèi)蒙古赤峰市翁牛特旗(N42°25′，E119°04′)收集黃芩和粘毛黃芩種質(zhì)資源，扦插蘆頭栽培在陜西師范大學(xué)藥用植物種質(zhì)資源圃(N34°09′，E108°54′)。2014年10月分別采集其根，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為黃芩(S.baicalensisGeorgi)、粘毛黃芩(S.viscidulaBge.)的根。每個樣品分2份，每份0.4 kg，一份經(jīng)室內(nèi)避光自然干燥(晝夜溫度在10～25 ℃)，另一份經(jīng)60 ℃烘箱恒溫干燥，2份均干燥至質(zhì)量基本不再減少(連續(xù)2次稱量質(zhì)量差異在1%以內(nèi))，備用。

2方法

2.1色譜條件及測定法色譜柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動相為甲醇-乙腈-10 mL·L-1甲酸溶液，按照表1進(jìn)行線性梯度洗脫；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為278 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。每份樣品重復(fù)測定3次，取結(jié)果的平均值計算。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 Gradient elution program

時間/min　甲醇/%　　乙腈/%10mL·L-1甲酸/% 0　　15　　5　　80 60　　80　　10　　10 63　　15　　5　　80 80　　15　　5　　80

2.2對照品溶液的制備精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素和漢黃芩素對照品各10 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液。根據(jù)供試品進(jìn)樣后各成分峰面積大小及比例，精密量取相應(yīng)對照品儲備液適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成與樣品中各成分比例接近的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備取上述已干燥的黃芩和粘毛黃芩樣品，按照對角線四分法各取樣100 g，粉碎成細(xì)粉。精密稱取0.25 g置于三角瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲(45 kHz，300 W)30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3結(jié)果與分析

3.1典型色譜圖按照2.3中色譜條件測定對照品及樣品的典型色譜圖。見圖1~2。

圖1對照品色譜圖

1.野黃芩苷;2.黃芩苷;3.漢黃芩苷;4.芹菜素;5.黃芩素;6.漢黃芩素

Fig.1 HPLC chromatograms of the control

1.scutellarin;2.baicalin;3.wogonoside;4.apigenin;5.baicalein;6.wogonin

圖2不同處理方法的樣品色譜圖

a.黃芩(晾干);b.黃芩(烘干);c.粘毛黃芩(晾干);d.粘毛黃芩(烘干)

Fig. 2 Chromatograms of samples with different processing methods

a.S.baicalensis(natural drying);b.S.baicalensis(oven drying);c.S.viscidula(natural drying);d.S.viscidula(oven drying)

用Chromeleon 7.2.1色譜工作站對色譜圖進(jìn)行適用性評價，結(jié)果顯示：在既定的色譜條件下，6種成分均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5；各色譜峰理論板數(shù)均在5 000以上；各峰拖尾因子均小于1.5。證明1.5中色譜條件對黃芩及粘毛黃芩中6種成分的測定是適合的，結(jié)果可信度較高。

3.2不同干燥方法對黃芩和粘毛黃芩藥用活性成分含量的影響黃芩和粘毛黃芩中6種成分不同干燥方法的含量測定結(jié)果見表2。

表2不同干燥方法的含量測定結(jié)果

Tab.2 Determination results of different drying methods

成分名稱質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%自然晾干烘干黃芩野黃芩苷0．08±0．010．11±0．03黃芩苷10．23±0．1710．35±0．14漢黃芩苷2．33±0．102．09±0．15芹菜素--黃芩素0．40±0．031．01±0．07*漢黃芩素0．16±0．010．24±0．04粘毛黃芩野黃芩苷--黃芩苷9．89±0．167．32±0．09*漢黃芩苷2．27±0．081．64±0．03*芹菜素--黃芩素0．21±0．030．27±0．28漢黃芩素0．08±0．020．07±0．03

注：-表示未檢出；*P<0.05表示2種處理方法的含量有顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)中的黃芩、粘毛黃芩樣品中均未檢出芹菜素，粘毛黃芩中未檢出野黃芩苷。故僅對黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4種成分的含量進(jìn)行對比。

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：黃芩采后烘干除黃芩素含量顯著增加外，其他成分含量與自然晾干無顯著性差異。粘毛黃芩烘干后，黃芩苷含量由9.89%降至7.32%，漢黃芩苷含量由2.27%降至1.64%。經(jīng)初步分析認(rèn)為，烘干對粘毛黃芩活性成分影響比黃芩大的原因，可能與黃芩根較粗大、粘毛黃芩根較細(xì)小，烘干導(dǎo)致粘毛黃芩根迅速失水，從而影響次生代謝產(chǎn)物的合成和積累有關(guān)。

3.3黃芩和粘毛黃芩藥用活性成分多樣性及含量比較分析藥用活性成分含量一直是衡量藥材質(zhì)量和品質(zhì)的重要依據(jù)，但用單一成分的含量不足以評價和揭示藥材的品質(zhì)。通過高效液相色譜法分析了黃芩和粘毛黃芩根中藥用活性成分含量，結(jié)果表明，自然晾干處理?xiàng)l件下，黃芩中黃芩苷含量(10.23%)和漢黃芩苷含量(2.33%)與粘毛黃芩相應(yīng)成分含量(黃芩苷含量為9.89%、漢黃芩苷含量為2.27%)無顯著差異(P>0.05)；除粘毛黃芩不含野黃芩苷外，黃芩中黃芩素的含量(0.40%)和漢黃芩素的含量(0.16%)均顯著高于粘毛黃芩中相應(yīng)成分的含量(黃芩素的含量為0.21%、漢黃芩素的含量為0.08%)。見圖3。說明黃芩和粘毛黃芩在主要成分上既有相似性又有多樣性。

圖3黃芩和粘毛黃芩主要成分比較

Fig.3 Comparison of main components inS.baicalensisandS.viscidula

注：*P<0.05二者存在顯著性差異；**P<0.01二者存在極顯著性差異。

4討論

近年來，由于植物化學(xué)和藥理學(xué)的快速發(fā)展，青蒿素和紫杉醇等中醫(yī)藥活性成分對重大疾病的治療及其機(jī)制被逐漸揭示清楚，中醫(yī)藥開始走出國門并逐漸受到世界關(guān)注和廣泛接受[17-18]。黃芩作為清熱燥濕常用中藥材，市場需求量一直居高不下，尤其是20世紀(jì)90年代中后期，隨著國內(nèi)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和中小型植物活性成分提取企業(yè)的增加，黃芩在市場上出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，多年無節(jié)制的破壞性采挖，導(dǎo)致黃芩野生資源急劇下降，甚至面臨枯竭的境地[14-15]。隨著黃芩苷、黃芩素和漢黃芩苷等黃芩藥用活性成分在抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)和抗高血糖等新功效的發(fā)現(xiàn)[5-7]，黃芩藥用活性成分的醫(yī)藥及保健品逐漸增多，從而促使植物提取企業(yè)廣泛關(guān)注藥用活性成分的市場，導(dǎo)致黃芩藥材需求量持續(xù)增加。同屬植物一般具有相似或相近的次生代謝產(chǎn)物，能否在同屬植物中找出新的藥源植物，是研究者面臨的新任務(wù)。

據(jù)文獻(xiàn)記載，黃芩屬7種植物均具有藥用歷史，粘毛黃芩曾被稱為小黃芩而長期被民間中醫(yī)廣泛使用[11]。歷版《中國藥典》僅收錄黃芩為正品藥材，且規(guī)定黃芩苷為其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等是黃芩中已知的黃酮類藥用活性成分，其次生代謝合成屬于苯丙烷代謝途徑的分支[4,19]。黃芩屬其他6種藥用植物同樣含有上述幾種活性成分，只是在含量和種類上存在不同程度的差異[20]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展、開發(fā)和利用，同屬藥用植物的活性成分具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

筆者在前期黃芩屬藥用植物種質(zhì)資源收集保存和遺傳多樣性研究[14-15]的基礎(chǔ)上，以HPLC法探討了不同干燥方法對黃芩和粘毛黃芩藥用活性成分含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的藥用植物，采用適當(dāng)?shù)某跫庸し椒鼙苊馑幱没钚猿煞值慕档?。進(jìn)一步的分析比較發(fā)現(xiàn)，粘毛黃芩除了黃芩苷和漢黃芩苷含量與黃芩無顯著差異外，未檢出野黃芩苷，且黃芩素和漢黃芩素的含量均顯著低于黃芩。從提取藥用植物活性成分角度來看，物種差異并不影響具有相同活性成分的藥用植物資源的開發(fā)利用。因此，本文的研究結(jié)果既為臨床選用中藥材品種提供參考，同時也為提取藥用活性成分從而擴(kuò)大藥用植物資源提供了一定的理論依據(jù)。

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Similarity and diversity evaluation of bioactive ingredients inS.baicalensisand S.viscidulaby HPLC

GUO Ling1，LEI Chengkang2，YANG Fanli3，DUAN Chongyang1，BAI Chengke1*(1.College of Life Science， Shaanxi Normal University，Xi′an 710119，China；2.Xi′ an Municipal Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710054，China；3. School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China)

Abstract:Objective It is aimed to evaluate the similarity and diversity of bioactive components in Scutellaria baicalensis and those in S. viscidula，and to study the effects of drying method on their components. Methods The roots of these medicinal plants were dried at room temperature or in oven at 60 ℃.The content of bioactive components in dried S. baicalensis and S. viscidula were simultaneously determined and analyzed by HPLC. Results The content of baicalein was increased in S. baicalensis roots dried by oven at 60 ℃ compared with those dried at room temperature，while no significant effect was observed on the other components. In contrast，the contents of baicalin and wogonoside were decreased in S. viscidula roots dried by oven at 60 ℃. In addition，the component scutellarin was not detected in S.viscidula, there is no significant difference between the contents of baicalin and wogonoside in S.baicalens (10.23% and 2.33%) and S.viscidula (9.89% and 2.27%)(P>0.05), but there is significant difference between the contents of baicalein and wogonin in S.viscidula (0.21% and 0.08%) and those in S.baicalensis (0.40% and 0.16%)(P<0.05). Conclusion It is indicated that the different drying method of S. viscidula and S. baicalensis showed significant effects on the bioactive components including their type and content.

Key words:S. baicalensis；S. viscidula；bioactive components；similarity; diversity； HPLC

(收稿日期：2015-06-08)

*通信作者：白成科，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師

作者簡介：郭玲，女，在讀博士研究生，實(shí)驗(yàn)師

基金項(xiàng)目：中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(編號:GK261001269)；秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新資助項(xiàng)目(編號：CIC-QBRSD)

中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0115-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.002