刺糖多糖免疫活性的初步研究

趙　津，常軍民，鄭　杰，程煜鳳，李改茹(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830054)

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·藥理·

刺糖多糖免疫活性的初步研究

趙津，常軍民，鄭杰，程煜鳳，李改茹*(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830054)

摘要：目的研究刺糖多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法采用水提醇沉法得刺糖多糖。建立免疫抑制小鼠動(dòng)物模型，小鼠灌胃刺糖多糖，利用碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測(cè)定非特異性免疫功能；血清溶血素實(shí)驗(yàn)反映抗體生成水平；測(cè)定血清中細(xì)胞因子的生成水平來評(píng)價(jià)刺糖多糖的免疫活性。結(jié)果刺糖多糖可以增強(qiáng)免疫抑制小鼠的碳粒廓清能力和血清溶血素水平，能夠提升由環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-10的含量。結(jié)論刺糖多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：刺糖多糖；水提醇沉；免疫活性

刺糖(Saccharumalhagi)是豆科植物蝶形花亞科駱駝刺屬，由駱駝刺葉子中的分泌液凝結(jié)成的糖粒，黃白色，一般呈圓形或橢圓形，氣微，味甜，它的主要成分是糖類物質(zhì)。一般生長(zhǎng)于荒漠、半荒漠區(qū)，在我國主要分布在新疆、甘肅、寧夏及內(nèi)蒙古地區(qū)。具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、益精壯陽、祛痰止咳、消腫止痛等功效，維吾爾醫(yī)常用之與其他藥材配伍使用，治療痢疾、腹瀉、胃脹等疾病[1]。

多糖(polysaccharides)是天然大分子化合物，糖類在人體內(nèi)的主要作用是提供能量資源，維持生命活動(dòng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的能力，從而提高細(xì)胞的活性，進(jìn)一步加強(qiáng)免疫作用；還具有抗腫瘤、抗病毒、抗感染、降血脂、促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成的作用，同時(shí)多糖作為藥物具有天然無毒性的功效，因此廣泛受研究專家的重視[2-4]。本文研究了刺糖多糖對(duì)免疫低下型小鼠的影響，希望為刺糖的進(jìn)一步研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器AB135-S型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；Multifuge X3R型離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；Szz PC型紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；Model 680型酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.2試藥刺糖(購于新疆民族醫(yī)院)；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)14022525)；鹽酸左旋咪唑片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)130105)；墨汁稀釋液：臨用前，將墨汁用生理鹽水稀釋4倍，即得；雞紅細(xì)胞懸液(CRBC)：雞血約10 mL，用肝素抗凝，再加入等體積9 g·L-1的氯化鈉注射液，混勻并多次洗滌，以3 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，繼續(xù)洗滌2~3次，取離心后的紅細(xì)胞4 mL，加入9 g·L-1氯化鈉注射液16 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；豚鼠血清稀釋液：豚鼠3只，取血，離心，冷藏保存，臨用前加生理鹽水稀釋10倍，即得。

1.3動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量18±2 g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(新)2011-0001，室溫環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食、進(jìn)水。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1水提醇沉法提取分離刺糖多糖將藥材置于圓底燒瓶中，加入石油醚，60 ℃恒溫水浴回流2 h，脫脂，將濾渣加入乙醇，80 ℃恒溫水浴中回流2 h， 除去小分子醇溶物，揮干溶劑，將濾渣加蒸餾水回流提取，濃縮濾液，800 g·L-1乙醇醇沉，干燥，得粗多糖[1]。

2.2動(dòng)物分組及給藥方法取實(shí)驗(yàn)小鼠，隨機(jī)分成6組，模型組、空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組及刺糖多糖高(800 mg·kg-1)、中(400 mg·kg-1)、低劑量(200 mg·kg-1)治療組，每組8只?？瞻讓?duì)照組給予生理鹽水，陽性對(duì)照組給予左旋咪唑(50 mg·kg-1)，治療組分別給予不同濃度刺糖多糖提取物，每天灌胃給藥1次，連續(xù)12 d。給藥當(dāng)天起，模型組、陽性對(duì)照組和治療組同時(shí)腹腔注射CTX(50 mg·kg-1)，而空白對(duì)照組用相同方法注射生理鹽水，連續(xù)3 d。

2.3對(duì)碳粒廓清功能的影響小鼠在第12天給藥后禁食不禁水12 h，分別稱定小鼠質(zhì)量，并在每只鼠的尾靜脈注射0.2 mL墨汁稀釋液。分別在注射后2和10 min，用提前經(jīng)肝素處理的定量毛細(xì)管從小鼠眼眶取血40 μL，溶于4 mL 1 g·L-1的碳酸鈉溶液，將溶液與所取血液混勻。在680 nm 處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度Al和A2，以碳酸鈉溶液為空白對(duì)照。脫臼處死小鼠，摘取胸腺、脾臟，稱定小鼠質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算臟器指數(shù)，并用吞噬指數(shù)表示小鼠碳粒廓清能力[5-7]。

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)；碳粒廓清率K=(lgA1-lgA2)/ (T2-T1)；吞噬指數(shù)=K1/3×體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)。

2.4對(duì)血清溶血素含量的影響在給藥第5天時(shí)，各組小鼠每只均腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液0.2 mL。第12天給藥后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，并離心收集血清，加生理鹽水稀釋100倍，取經(jīng)生理鹽水稀釋的血清l mL，與雞紅細(xì)胞懸液、豚鼠血清稀釋液各0.5 mL混合，在37 ℃恒溫箱中孵育30 min后，放入0 ℃冰箱終止反應(yīng)。然后離心，吸取上清液，在540 nm 處比色，將不加小鼠血清的空白對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定吸光度，以吸光度讀數(shù)作為判定血清溶血素的指標(biāo)，比較各組的差異[8-10]。

2.5指標(biāo)檢測(cè)小鼠在末次給藥后禁食不禁水12 h，分別稱定小鼠體質(zhì)量，脫臼處死小鼠，摘眼球取血，按組別裝入EP管，靜置后，4 ℃ 以3 000 r·min-1離心15 min，取血清，分裝，-20 ℃保存，測(cè)定細(xì)胞因子[11-12]。采用ELISA法，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別將小鼠血清以及不同濃度的對(duì)照品加入96孔微孔板的相應(yīng)待測(cè)孔中，每孔50 μL，加樣時(shí)盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，用封板膜封板后置于37 ℃中溫育30 min；棄去液體，甩干，每孔加洗滌液300 μL，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外；37 ℃溫育30 min；棄去液體，甩干，每孔加洗滌液300 μL，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯示15 min；每孔再加入終止液50 μL；以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的A值[13]。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)，分別得出IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-6的線性回歸方程為Y=0.001 3X-0.212 4(r=0.998 1)，Y=0.002 2X+0.032 4(r=0.995 5)，Y=0.004X-0.100 3(r=0.997 4)，Y=0.036 9X+0.130 5(r=0.995 0)。

3結(jié)果

3.1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響見表1。由表1可見，經(jīng)環(huán)磷酰胺構(gòu)建的模型組，其碳粒廓清率和吞噬指數(shù)均低于空白對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，說明環(huán)磷酰胺能顯著降低小鼠的碳粒廓清能力和巨噬細(xì)胞的吞噬功能；陽性藥組的碳粒廓清能力和吞噬指數(shù)均明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)，說明所選用的陽性藥左旋咪唑能明顯增強(qiáng)小鼠的碳粒廓清能力和吞噬功能，并能使其恢復(fù)到正常水平；高劑量組刺糖多糖與模型組比較，碳粒廓清率和吞噬指數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明刺糖多糖能夠增強(qiáng)小鼠碳粒廓清功能和吞噬功能，并與劑量呈正比。

表1刺糖多糖對(duì)小鼠碳粒廓清能力和吞噬功能的影響

Tab.1 Effects of polysaccharides fromSaccharumalhagion carbon granular clearance function and phagocytic function in mice

±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

3.2 對(duì)小鼠免疫器官的影響 見表2。由表2可見，模型組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，說明環(huán)磷酰胺能夠造成小鼠免疫器官的萎縮；陽性藥組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均高于模型組(P<0.01)，基本恢復(fù)到正常水平，說明陽性藥左旋咪唑能對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官萎縮；低劑量組刺糖多糖與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是中、高劑量組刺糖多糖與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，說明刺糖多糖能夠?qū)褂森h(huán)磷酰胺引起的小鼠胸腺萎縮和脾萎縮。

表2刺糖多糖對(duì)小鼠免疫器官的影響

Tab.2 Effects of polysaccharides fromSaccharumalhagion the immune organ in mice

±s，n=8)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

3.3對(duì)小鼠溶血素水平的影響見表3。由表3可見，模型組與空白對(duì)照組比較，其溶血素水平顯著降低(P<0.01)，說明環(huán)磷酰胺能夠影響小鼠的血清溶血素水平，對(duì)小鼠的體液免疫功能有抑制作用；陽性藥組的溶血素水平比模型組高(P<0.05)，說明所選用的陽性藥左旋咪唑能夠明顯提升小鼠的血清溶血素水平，將其恢復(fù)到正常水平；低、中劑量組的刺糖多糖與模型組和空白對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是高劑量組和模型組比較(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，能夠增強(qiáng)小鼠血清溶血素水平；隨著劑量的增加，血清溶血素水平也逐漸增高，具有一定的量效關(guān)系。

表3刺糖多糖對(duì)小鼠溶血素水平的影響

Tab.3 Effects of polysaccharides fromSaccharumalhagion hemolysin level in mice

±s, n=8)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

3.4對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響見表4。由表4可見，環(huán)磷酰胺構(gòu)建的模型組，其IL-2、IFN-γ、IL-10和 IL-6均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；陽性藥組與模型組比較，A值也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，說明所選用陽性藥左旋咪唑能增加免疫抑制小鼠血清中細(xì)胞因子的含量；刺糖多糖低、中劑量組與模型組比較，差異較小，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而刺糖多糖高劑量組與模型組比較，IL-2和IL-10明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IFN-γ和IL-6則僅有較小的提升。綜上所述，刺糖多糖對(duì)環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子的含量有提升作用。

表4刺糖多糖對(duì)小鼠細(xì)胞因子的影響

Tab.4 Effects of polysaccharides fromSaccharumalhagion hemolysin level in mice

±s, n=8)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

4討論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的免疫學(xué)研究方法，用環(huán)磷酰胺造免疫抑制小鼠動(dòng)物模型，灌胃給藥，觀察灌服不同劑量多糖的免疫抑制小鼠的碳粒廓清功能和吞噬指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺糖多糖能對(duì)抗免疫器官萎縮，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的吞噬指數(shù)(P<0.05)。

溶血素是一種抗紅細(xì)胞抗體，動(dòng)物血清與雞血紅細(xì)胞一起可以產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，通過這個(gè)過程中釋放的血紅蛋白量可以確定溶血素的含量，進(jìn)而反映小鼠合成抗體的能力，可以依此評(píng)價(jià)小鼠的體液免疫。研究結(jié)果表明，刺糖多糖可以增強(qiáng)體液免疫，提升免疫抑制小鼠的血清溶血素水平(P<0.05)。

多糖可以通過激活免疫細(xì)胞，誘生多種細(xì)胞因子作用于免疫系統(tǒng)，IL-2是輔助性T細(xì)胞分泌的一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，通過對(duì)IL-2的含量測(cè)定，也從分子水平反映了機(jī)體免疫功能的狀態(tài)[14-15]；IFN-γ主要是由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生的重要的細(xì)胞因子之一，可以有效地促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，IL-10是免疫和炎癥抑制因子，IL-6主要是由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能[16-17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，刺糖多糖能夠增強(qiáng)由環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-10的含量，而對(duì)IFN-γ和IL-6的含量沒有顯著的提升。

機(jī)體免疫力低下是由多種因素引起的，多糖作為一種植物性中藥，可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，作為免疫調(diào)節(jié)劑。刺糖在新疆維吾爾醫(yī)院中常作為一味增強(qiáng)機(jī)體免疫力的維藥。本研究表明，刺糖多糖對(duì)非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫均有促進(jìn)作用，具有良好的開發(fā)前景。

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Preliminary study on the immune activity of polysaccharides fromSaccharumalhagi

ZHAO Jin, CHANG Junmin, ZHENG Jie, CHENG Yufeng, LI Gairu*(Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)

Abstract：ObjectiveTo assess the immunomodulation effects of polysaccharides from Saccharum alhagi in immunosuppression mice. Methods The polysaccharides were extracted with water，and precipitated with ethanol from Saccharum alhagi. Immunosuppression mice model was induced by cyclophosphamide，and intragastrically administered with polysaccharides from Saccharum alhagi. Nonspecific immune function was evaluated by the carbon granular clearance test, antibody level by hemolysin test and cell factor determination，including IL-2，IL-6，and IL-10. Results Polysaccharides from Saccharum alhagi could enhance carbon granular clearance and hemolysin levels in immunosuppression mice，and also increase the content of IL-2 and IL-10. Conclusion The polysaccharides from Saccharum alhagi showed strong immune activities to immunosuppression mice.

Key words：polysaccharides from Saccharum alhagi；water extraction and alcohol precipitation；immune activities

(收稿日期：2015-07-17)

*通信作者：李改茹，女，副教授

作者簡(jiǎn)介：趙津， 女， 碩士研究生

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81460633)

中圖分類號(hào)：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)02-0158-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.014