葡萄酒協(xié)同洋蔥對大鼠痛風(fēng)癥作用的研究

華　菲，曹　宇，宋　凡，張　環(huán)，王四旺，孫紀(jì)元*(.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室,西安 7002；2.秦巴山區(qū)中藥發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 7002；.西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科，西安 7008)

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葡萄酒協(xié)同洋蔥對大鼠痛風(fēng)癥作用的研究

華菲1,2，曹宇1，宋凡1,2，張環(huán)3，王四旺1,2，孫紀(jì)元1,2*(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室,西安 710032；2.秦巴山區(qū)中藥發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710032；3.西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710018)

摘要：目的通過尿酸鈉(monosodium urate monohydrate，MSU)晶體誘導(dǎo)炎癥動物模型，探討紅酒泡洋蔥對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis, GA) 的治療作用。方法選用48只健康雄性SD大鼠，隨機分為6組：空白組，模型組，陽性組，葡萄酒協(xié)同洋蔥低劑量組，葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組和葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組。采用MSU晶體制備大鼠GA模型?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水，陽性組給予雷公藤多苷片，低、中、高劑量組分別給予不同劑量的葡萄酒+洋蔥，檢測血清中UA、IL-1β和CAT活性水平。取踝關(guān)節(jié)滑膜，觀測其病理變化。結(jié)果低劑量(3 mg·kg-1) 能夠顯著降低GA模型大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹度及白細(xì)胞介素濃度(P<0.01)，提高CAT活性 (P<0.01)；低、中(6 mg·kg-1)劑量能夠顯著降低血清中尿酸的含量(P<0.01)；尿酸鈉所致痛風(fēng)癥大鼠的關(guān)節(jié)滑膜病變顯著，經(jīng)給藥后各組大鼠的關(guān)節(jié)滑膜病理情況均有所緩解。結(jié)論葡萄酒泡洋蔥可降低MSU晶體誘導(dǎo)的GA大鼠血清中尿酸及白細(xì)胞介素的水平，增強過氧化氫酶活性，對關(guān)節(jié)滑膜有保護(hù)和修復(fù)作用，其機制可能與抗氧化作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；洋蔥；尿酸鈉；痛風(fēng)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis，GA)是尿酸鈉晶體(monosodium urate crystals，MSU)沉積在關(guān)節(jié)囊、滑膜、軟骨、骨質(zhì)中，刺激關(guān)節(jié)而引起反復(fù)性發(fā)作的炎癥反應(yīng)。目前治療藥物有秋水仙堿、非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇等，這些藥物具有顯著和嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如胃腸毒性、腎毒性或胃腸道出血等，尤其是對老年患者來說難以適應(yīng)。因此，在自然產(chǎn)物中，特別是食物中，發(fā)現(xiàn)能夠治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的、高效低毒的食療藥物具有重要意義。

葡萄酒是抗氧化的良品[1]。葡萄酒中具有抗氧化活性的主要物質(zhì)， 包括多酚類、類黃酮、黃烷醇和花色苷物質(zhì)。單寧酸為葡萄酒中的多酚類物質(zhì)，動物實

驗顯示，單寧酸能加強人體細(xì)胞的抗氧化活性，抑制細(xì)胞突變，阻止細(xì)胞癌變[2-3]。洋蔥，百合科，鱗莖為食用或入藥部分, 有發(fā)散風(fēng)寒、防癌抗癌、降血壓、降血糖、清血脂、消炎抑菌、活血化瘀以及預(yù)防心血管疾病等功效，其中類黃酮化合物由于含有酚羥基結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)出較強的抗氧化作用[4]。葡萄酒泡洋蔥是在西方國家盛行的一種食療方法[5]，但其作用及其作用機制一直沒有實驗證實。

本實驗通過科學(xué)實驗方法研究痛風(fēng)癥與葡萄酒協(xié)同洋蔥的抗炎抗氧化作用間的聯(lián)系，初步探討了葡萄酒協(xié)同洋蔥對SD大鼠急性痛風(fēng)癥的作用機制。

1儀器與材料

1.1儀器離心機(德國Eppendorf)；680酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)；AUW2200型分析天平(日本島津)； KH5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，RT-9600型生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1.2試藥葡萄酒協(xié)同洋蔥，紅皮洋蔥250 g，切成約為0.5 cm2的小塊，置于 500 mL葡萄酒中密封，陰涼處浸泡1周，過濾，濾液在4 ℃中保存[6-7]。尿酸鈉(Sigma公司，批號A-7413)；葡萄酒(盧克魯納酒莊舍拉子干紅葡萄酒，2011 SHIRAZ)；雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，130903)；甲醛(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；ELISA試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)；CAT活性試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；尿酸試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；水合氯醛(分析純，上海山浦化工有限公司，140307)。

1.3實驗動物昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量20±2 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜)字第2014-002號。

2實驗方法

2.1痛風(fēng)癥大鼠模型的制備痛風(fēng)動物模型制作方法在國外Coderre[8-10]等經(jīng)典方法的基礎(chǔ)上略作改進(jìn)：雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，禁食(不禁水)12 h，乙醚麻醉，大鼠仰臥固定，右后肢踝關(guān)節(jié)周圍脫毛，碘伏消毒，踝關(guān)節(jié)彎曲，在踝關(guān)節(jié)背部，用6號注射針從45度方向插入，感覺有落空感后，注射30 g·L-1尿酸鈉溶液100 μL，關(guān)節(jié)囊鼓起?？瞻讓φ战M注射等體積的生理鹽水[11]。

2.2治療方法將48只大鼠隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(雷公藤多苷片)、葡萄酒協(xié)同洋蔥低劑量組、葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組和葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組。定時灌胃給藥，連續(xù)7 d。陽性對照組是8 mg·kg-1的雷公藤多苷片。葡萄酒協(xié)同洋蔥低、中、高劑量組分別按照3，6和9 mL·kg-1的劑量給予葡萄酒協(xié)同洋蔥，正常對照組與模型組按照9 mL·kg-1給予生理鹽水[12]。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1一般體征觀察大鼠肢體的活動情況以及右后肢踝關(guān)節(jié)的外觀等[13]。

2.3.2IL-1β、UA和CAT的測定在給藥第7天，水合氯醛合劑麻醉后，腹主靜脈取血，以3 000r·min-1離心10 min，取上清液，測定血清中IL-1β(白細(xì)胞介素1β)、UA(尿酸)和CAT(過氧化氫酶)的水平。

2.3.3組織病理學(xué)檢查取右后肢踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜組織，中性甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色。顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)變化[14]。

3結(jié)果

3.1動物一般體征在被注射尿酸鹽溶液后第2 天，痛風(fēng)癥模型大鼠肢體不愿著力負(fù)荷，且足爪卷曲、行走遲緩，踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)不同程度的腫脹。有個別動物后肢過度俯屈，甚至跛行。實驗結(jié)束時，正常對照組大鼠精神狀態(tài)好，生長發(fā)育情況好。模型對照組大鼠毛色暗淡，不愛運動，精神狀態(tài)不佳，足踝關(guān)節(jié)腫脹明顯。陽性對照組大鼠的運動情況得到良好改善，與模型組大鼠相比，踝關(guān)節(jié)腫脹情況情況有所緩解和恢復(fù)。葡萄酒協(xié)同洋蔥低、中、高劑量組大鼠的精神以及運動情況，隨劑量遞減而得到相應(yīng)的改善，踝關(guān)節(jié)腫脹情況也有所改善。

3.2 IL-1β、UA和CAT的檢測結(jié)果與空白對照組相比，模型對照組血清中UA和IL-1β水平都明顯升高(P<0.05或0.01)。陽性對照組、葡萄酒協(xié)同洋蔥低劑量組、葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組和葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組與模型對照組相比，腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β炎性介質(zhì)的水平和血清中UA含量明顯降低(P<0.05或0.01)，并接近正常水平，緩解機體的炎癥反應(yīng)，見圖1(A和B)。與空白對照組相比，模型對照組血清中CAT水平顯著降低(P<0.01)。陽性對照組、葡萄酒協(xié)同洋蔥低劑量組、葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組和葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組與模型對照組相比，都能夠顯著升高血清中CAT抗氧化酶活性(P<0.01)，并接近正常水平，見圖1(C)。

圖1葡萄酒協(xié)同洋蔥對大鼠血清中尿酸、 白介素和過氧化氫酶的影響

注： 與模型組比較*P<0.05,**P<0.001

Fig.1 Effect of red wine combined with onion on the UA, IL-1βand CAT in rats

3.3踝關(guān)節(jié)滑膜病理切片檢查正常對照組(A)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞分布均勻，邊緣界限整齊，結(jié)構(gòu)清晰可見，胞漿豐富，核圓居中，且大小均一。模型對照組(B)大鼠滑膜組織中，細(xì)胞萎縮，邊緣界限不清晰，結(jié)構(gòu)紊亂松散。大部分細(xì)胞核固縮變小，脫顆粒明顯。陽性對照組(C)大鼠滑膜，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，邊緣整齊，滑膜組織完整，細(xì)胞體積較正常，但也有少量細(xì)胞呈萎縮狀，細(xì)胞核略有縮小，與正常對照組的滑膜組織相似；葡萄酒協(xié)同洋蔥低劑量組(D)大鼠滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，有一定數(shù)量細(xì)胞核固縮，損傷程度較模型對照組輕。葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組(E)大鼠滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，部分細(xì)胞核固縮，未見其他明顯病變。損傷程度較葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組輕。葡萄酒協(xié)同洋蔥高劑量組(F)大鼠滑膜組織部分細(xì)胞核固縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，未見其他明顯病變。見圖2。

圖2葡萄酒協(xié)同洋蔥對大鼠滑膜病理切片的影響(HE, ×200)

a.正常對照組；B.模型對照組；C.陽性對照組；D.葡萄酒協(xié)同洋蔥小劑量組；E.葡萄酒協(xié)同洋蔥中劑量組；F.葡萄酒協(xié)同洋蔥大劑量組

Fig.2 The effect of red wine combined with onion on the pathological section of synovial in rats(HE，×200)

a. control group: the structure of synovial was normal；B. model group: the structure of synovialwasdisorder and cell shrinkage, and inflammatory cell infiltration；C. positive control group: the structure of synovial was normal；D. wine combined with onion group (low)；compared with model group, the structure of synovial and cell shape improved， inflammatory cells reduced；E．wine combined with onion group (middle): compared with model group, the structure of synovialand cell shape improved， inflammatory cells reduced；F.wine combined with onion group (high)：compared with model group, the structure of synovial and cell shape improved， inflammatory cells reduced

4討論

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝異常、尿酸合成增加或排泄不良導(dǎo)致血中尿酸升高。腎功能異常時，由于腎臟代謝障礙，尿酸清除率下降，會引起尿酸水平上升[15]，血漿中的尿酸達(dá)到飽和時，會引起尿酸鈉結(jié)晶沉積在血管相對缺乏的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)周圍組織中，這種結(jié)晶的蓄積可導(dǎo)致單關(guān)節(jié)或者多關(guān)節(jié)的急性炎性滑膜炎。表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)嚴(yán)重的疼痛、腫脹、紅斑、僵硬和發(fā)熱，且癥狀發(fā)生較突然。目前該疾病的治療包括大劑量非甾體抗炎藥或者秋水仙堿，以及關(guān)節(jié)清理術(shù)、植入式關(guān)節(jié)成形術(shù)和關(guān)節(jié)融合術(shù)等方法[16]。

近年來，許多研究報道， 葡萄酒和洋蔥都具有抗炎、 抗氧化作用。葡萄酒中的花青素、 單寧酸和白藜蘆醇等，都是抗氧化劑，可有效降低病變部位的炎癥反應(yīng)[17]。洋蔥中的槲皮素和硒元素是有效的抗氧化劑，能刺激人體免疫反應(yīng)[18]。中醫(yī)學(xué)中亦有痛風(fēng)病名，且歷代醫(yī)學(xué)家對此有所論述。主要分為濕熱阻痹、瘀熱內(nèi)郁、痰濕阻滯、肝腎陰虛、風(fēng)寒濕痹型。主要原因是： 風(fēng)、寒、濕三氣雜至，侵襲機體，痹阻經(jīng)絡(luò)，氣血運行不暢，不通則痛，故見肢體、關(guān)節(jié)疼痛。風(fēng)邪偏勝者則關(guān)節(jié)呈游走性痛；寒偏勝者則見關(guān)節(jié)劇痛，痛有定處；濕邪偏勝者則以關(guān)節(jié)腫脹腫痛、肌膚麻木為主，寒濕之邪均為陰邪，故見陰雨天加重。而洋蔥味甘、微辛、性溫，入肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有潤腸、理氣和胃、健脾進(jìn)食、發(fā)散風(fēng)寒、溫中通陽、消食化肉、提神健體和散瘀解毒的功效，對于痛風(fēng)癥具有顯著的療效[19]。

該實驗運用尿酸鈉破壞大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜引起實驗性痛風(fēng)癥[20]。尿酸鈉被認(rèn)為與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)病的發(fā)病機制有關(guān)。痛風(fēng)發(fā)作時，尿酸鈉晶體蓄積在滑膜組織和關(guān)節(jié)軟骨處，繼而被關(guān)節(jié)液中的白細(xì)胞吞噬，隨后白細(xì)胞破裂，關(guān)節(jié)液中蓄積大量的蛋白酶和炎性因子，促使關(guān)節(jié)液中的白細(xì)胞增多，白細(xì)胞繼續(xù)吞噬了尿酸鹽結(jié)晶，再破裂釋放出酶和炎性成分，因而形成惡性循環(huán)[21]，進(jìn)一步加劇了急性滑膜炎和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[22-23]。尿酸在組織中的濃度很低，用尿酸鈉造模方便、有效、快捷，是實驗性痛風(fēng)癥模型普遍使用的藥物。

葡萄酒協(xié)同洋蔥對急性痛風(fēng)癥模型小鼠治療進(jìn)行實驗研究，發(fā)現(xiàn)葡萄酒協(xié)同洋蔥低、中劑量組與模型對照組相比，可顯著降低腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β炎性介質(zhì)的水平和血清中UA含量(P<0.05或0.01)，顯著升高血清中CAT抗氧化酶活性(P<0.01)，這表明葡萄酒協(xié)同洋蔥對大鼠的痛風(fēng)癥具有明顯的治療作用，且低劑量組優(yōu)于高劑量組。究其原因，可能與葡萄酒、洋蔥可減弱尿酸鈉對關(guān)節(jié)滑膜的損傷或減輕痛風(fēng)部位的炎癥反應(yīng)有關(guān)，但其作用機制仍待進(jìn)一步研究。根據(jù)以上實驗結(jié)果，可以推斷出葡萄酒協(xié)同洋蔥的作用:①抗氧化作用，提高過氧化氫酶的活性，提高痛風(fēng)部位的抗氧化效率，可能加速過氧化氫等氧自由基的分解，減緩?fù)达L(fēng)部位的氧化反應(yīng)，改善病情；②抗炎作用：顯著降低血液中白細(xì)胞介素含量，可能降低痛風(fēng)部位的炎癥反應(yīng)，消腫、 止痛，改善病情；③對尿酸的清除作用：血液中的尿酸含量減少，可能對關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)滑膜中的尿酸結(jié)晶起清除作用，消除了病因并改善病情，但其具體機制還有待進(jìn)一步研究。

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Study on wine combined with onion in the treatment of acute gouty arthritis

HUA Fei1,2, CAO Yu1, SONG Fan1,2, ZHANG Huan3, WANG Siwang1,2, SUN Jiyuan1,2*(1.Department of Natural Medicine, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China; 2. Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine in Qinba Moutains, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China; 3.Department of Cardiovascular Medicine, Xi′an Central Hospital, Xi′an 710018, China)

Abstract:ObjectiveTo study the therapeutic effect of wine combined with onion on acute gouty arthritis (GA) in the animal model of sodium urate (monosodium urate monohydrate, MSU) crystal-induced inflammations. Methods 48 healthy male SD rats were randomly divided into six groups: control group, model group, positive group, low dose group, middle dose group and high dose group. GA models were made by using MSU. Control group and model group were given normal saline, positive group were given Tripterygiumwilfordii Glycosides Tablets, and low dose group, middle dose group and high dose group were given different doses of wine (onion). Wine (onion), Tripterygiumwilfordii Glycosides Tablets or normal saline was given orally. The 1evels of UA, IL-1β and CAT in plasma were determined with thiobarbituric acid (TBA).The pathological changes of ankle synovial were observed with microscope. Results Low dose of 3 mg·kg-1wine (onion) significantly reduced ankle swelling and the contents of IL-1β (P<0.01) in GA rat, increased the activity of CAT (P<0.01); Low and middle (6 mg · kg-1) dose significantly declined the level of serum UA (P<0.01); Ankle synovial showed remarkable lesions in MSU-induced GA rats, treated with wine combined with onion, and the pathology of ankle synovial were alleviated. Conclusion Wine combined with onion can reduce the levels of serum UA and IL-1β in MSU-induced GA rats, enhance the activity of CAT, indicating the therapeutic effect of protecting and repairing the ankle synovial disease, the mechanism of which may be related to the antioxidant effects.

Key words:wine; onion; sodium urate; gouty arthritis

(收稿日期：2015-07-12)

*通信作者：孫紀(jì)元，男，副教授

作者簡介：華菲，女，碩士研究生

中圖分類號：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0168-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.017