柱前衍生化HPLC法測定不同產(chǎn)地胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸的含量

馮　歡，李新霞，馮　崴，李琳琳*(.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理教研室，烏魯木齊　800；.新疆醫(yī)科大學分析測試中心，烏魯木齊　800；.金駿陽光生物科技有限公司，烏魯木齊　800)

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柱前衍生化HPLC法測定不同產(chǎn)地胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸的含量

馮歡1，李新霞2，馮崴3，李琳琳1*(1.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理教研室，烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學分析測試中心，烏魯木齊830011；3.金駿陽光生物科技有限公司，烏魯木齊830011)

摘要：目的柱前衍生化法測定4-羥基異亮氨酸含量。方法采用異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑，色譜柱(Zorbax Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agile)；流動相A：乙腈，流動相B：1 mL·L-1磷酸水，梯度洗脫(A相∶B相):(0~20 min，20∶80；20 min，60∶40)；流速：1.5 mL·min-1；進樣體積：20 μL ；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。結(jié)果4-羥基異亮氨酸在質(zhì)量濃度4.2～20.9 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 3)，平均回收率為96.8%，RSD為1.7%。結(jié)論該方法簡便、穩(wěn)定，結(jié)果準確，可作為4-羥基異亮氨酸的含量測定方法。

關(guān)鍵詞：胡蘆巴；4-羥基異亮氨酸；柱前衍生化法；反相高效液相色譜法

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴屬胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的種子，具有溫腎壯陽、祛寒除濕等功效[1]。胡蘆巴作為一種藥食兩用的中藥材，其含有的化學成分種類繁多，各類甾體皂苷、黃酮類化合物、氨基酸、生物堿等成分被認為是主要的功效成分。胡蘆巴中的氨基酸有4-羥基異亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。其中4-羥基異亮氨酸的含量占胡蘆巴中游離氨基酸的80%以上[2]。近年來，國內(nèi)外學者對4-羥基異亮氨酸的活性及其藥理作用的研究結(jié)果表明，4-羥基異亮氨酸除了具有顯著地降血糖活性外，還具有改善肝功能、降低血脂及膽固醇[3]、抗炎[4]、抗抑郁[5]等作用。

4-羥基異亮氨酸本身無紫外吸收，可通過HPLC-ELSD法測定胡蘆巴[6]及胡蘆巴提取物[7]中4-羥基異亮氨酸的含量，或者采用氨基酸柱前衍生化法測定含量[8]。本文采用異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑，通過反相高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸的含量。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(LC-20AB泵，SPD-20A紫外雙波長檢測器，日本島津)；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(AB135-S，梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥胡蘆巴種子(新疆本草堂中藥飲片公司，產(chǎn)地為山東、安徽、新疆，經(jīng)新疆醫(yī)科大學分析測試中心鑒定)；4-羥基異亮氨酸對照品，異硫氰酸苯酯(Sigma公司)；磷酸、三乙胺為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱(Zorbax Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent)；流動相A：乙腈；流動相B：1 mL·L-1磷酸水。梯度洗脫[A相∶B相](0~20 min，20∶80；20 min，60∶40)。流速：1.5 mL·min-1；進樣體積：20 μL；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

2.2對照品溶液的制備取4-羥基異亮氨酸對照品2.0 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入10 mL乙腈-水-三乙胺(40∶12∶8)溶解后，加入500 μL異硫氰酸苯酯，振搖5 min，加入60 mL甲醇，加水定容至刻度。

2.3供試品溶液的制備胡蘆巴種子粉粹成粗粉，取胡蘆巴粉2.0 g，精密稱定，置于具塞試管中，加入8 mL甲醇-水(1∶1)，65 ℃水浴加熱5 min，超聲5 min，離心，取上清液，置于25 mL量瓶中，重復提取1次，合并2次提取液，置于25 mL量瓶中，用甲醇-水(1∶1)溶液稀釋至刻度，得樣品儲備液。

取樣品儲備液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，加入10 mL乙腈-水-三乙胺(40∶12∶8)溶液溶解后，加入500 μL異硫氰酸苯酯，振搖5 min，加入60 mL甲醇，加水定容至刻度，得到衍生化后的樣品溶液，再取衍生化后的樣品溶液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇-水(2∶1)溶液定容至刻度，混勻。進樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜器過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4方法學驗證

2.4.1專屬性實驗見圖1。

圖1HPLC圖

a.空白；B.對照品；C.樣品；1.4-羥基異亮氨酸

Fig.1 HPLC chromatograms

a.blank sample；B. reference substance；C.Trigonellafoenum-graecumL. sample；1.4-hydroxyisoleucine

2.4.2線性與范圍精密量取對照品溶液2，4，6，8和10 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇-水(2∶1)定容至刻度，搖勻，得到系列標準溶液。分別進樣20 μL，記錄色譜峰面積A，以色譜峰面積A對質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)進行線性回歸，得4-羥基異亮氨酸回歸方程：Y=6.1×107X+15 852(r=0.999 3)，結(jié)果表明，4-羥基異亮氨酸在4.2～20.9 μg·mL-1范圍內(nèi)，與其色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度實驗精密吸取對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次進樣20 μL，記錄4-羥基異亮氨酸的峰面積，結(jié)果顯示，RSD為0.73%，精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性實驗精密吸取同一供試品溶液，每隔2 h測定1次，連續(xù)進樣7次，每次進樣20 μL，記錄4-羥基異亮氨酸的峰面積，RSD為0.78%。

2.4.5加樣回收率實驗取已知含量的同一批樣品9份，精密稱定，分別制備供試品溶液，精密加入高、中、低濃度的4-羥基異亮氨酸對照品溶液，按照2.3項下方法分別制備供試品儲備液。按照2.1項下方法分析，4-羥基異亮氨酸的平均加樣回收率為96.8%，RSD為1.7%。結(jié)果見表1。

表14-羥基異亮氨酸加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of 4-hydroxyisoleucine recovery test

(n=9)

3.5樣品測定取新疆產(chǎn)、安徽產(chǎn)、山東產(chǎn)胡蘆巴粉各2.0 g，精密稱定，按照2.3項下方法，分別制備供試品溶液。進樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜器過濾，取續(xù)濾液備用。按照2.1項下方法，不同產(chǎn)地胡蘆巴粉平行測定3次。新疆產(chǎn)胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸平均含量為0.49%，RSD為1.5%；安徽產(chǎn)胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸平均含量為0.48%，RSD為1.8%；山東產(chǎn)胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸平均含量為0.61%，RSD為0.94%。

4討論

4-羥基異亮氨酸由于無紫外吸收，故對其含量測定的檢測方法多采用蒸發(fā)光散射進行檢測。而柱前衍生化法則可以將待測樣品衍生化后通過不同檢測器進行檢測，方法更簡便快速。對于柱前衍生化法，已有學者使用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑進行衍生化，但相比使用異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑，鄰苯二甲醛的配制過程較復雜。

本實驗參照美國草藥典[9]，采用異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑，實驗結(jié)果表明，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生化后的溶液穩(wěn)定，測定結(jié)果準確可靠。

參考文獻：

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[3]高峰，蔡琴，蔡倫，等.4-羥基異亮氨酸的研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)藥導報，2014，33(10):1261-1264.

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[5]Vaibhav Gaur，Subhash L., Bodhankar，et al.Antidepressant-like effect of 4-hydroxyisoleuine fromTrigonellafoenumgraecumL. seeds in mice[J]. Biomed Aging Pathol，2012，2(3):121-125.

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[9]American Herbal Pharmacopoeia[S].2014.

Determination of 4-hydroxyisoleucine in the seeds ofTrigonellafoenum-graecumL. from different habitats by precolumn derivatization HPLC

FENG Huan1，LI Xinxia2，F(xiàn)ENG Wei3，LI Linlin1*(1.Department of Pharmacology，Basic Medicine College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Analytical and Testing Center of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3.Jinjun Yangguang Biotechnology Limited Company，Urumqi 830011，China )

Abstract:Objective To establised a method for the determination of 4-hydroxyisoleucine in the seeds of Trigonella foenum-grae-

cumL. from different habitats. Method Precolumn derivatization HPLC was adopted using phenylisothiocyanate as the derivative reagent. Zorbax Eclipse XDB-C18column was used. The mobile phase was A [acetonitrile]∶B [1 mL·L-1phosphoric acid in water] (0-20 min，20∶80；20 min，60∶40)，with a flow rate of 1.5 mL·min-1at 30 ℃. Result A good linearity was obtained in the range of 4.2-20.9 μg·mL-1(r=0.999 3) for 4-hydroxyisoleucine. The average recovery of 4-hydroxyisoleucine was 96.8%，RSD=1.7%. Conclusion Using phenylisothiocyanate as the derivative reagent，the precolumn derivatization HPLC method is simple，reproducible and accurate.

Key words:Trigonella foenum-graecum L.；4-hydroxyisoleucine；precolumn derivatization；HPLC

(收稿日期：2015-06-23)

*通信作者：李琳琳，女，教授，博士生導師

作者簡介：馮歡，女，碩士研究生

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目(編號：201233150)；吉林大學-新疆醫(yī)科大學聯(lián)合基金項目(編號： 01040050503)

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0136-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.008