真核細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其對骨重塑的作用

劉 勃，尹鵬濱，張立海，陳思斌，全宸良，王 松 綜述 唐佩福 審校

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真核細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其對骨重塑的作用

劉 勃，尹鵬濱，張立海，陳思斌，全宸良，王 松 綜述 唐佩福 審校

自噬；骨重塑；骨穩(wěn)態(tài)；骨代謝疾病

眾所周知，骨骼為軀體提供支撐和保護(hù)，骨功能的發(fā)揮需要骨形態(tài)、骨量、骨質(zhì)等的長期穩(wěn)定。骨骼是個(gè)不斷變化的器官，在整個(gè)生命周期中，一直存在骨吸收和骨生成活動(dòng)。機(jī)體通過骨重塑過程達(dá)到或維持骨穩(wěn)態(tài)。在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等細(xì)胞、激素、相關(guān)理化因子的密切配合下，其過程受到精密調(diào)控。骨重塑過程障礙會(huì)導(dǎo)致骨硬化癥、骨質(zhì)疏松癥、佩吉特骨病等多種骨病。越來越多的研究表明，自噬參與調(diào)控成、破骨及骨細(xì)胞生命活動(dòng)。自噬很可能參與骨重塑過程。筆者將對自噬參與骨重塑過程的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 真核細(xì)胞自噬現(xiàn)象

自噬是真核細(xì)胞生物主要的降解系統(tǒng)之一，細(xì)胞通過自噬將胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)、受損和老化的細(xì)胞器、病原體等降解，產(chǎn)生氨基酸、核苷酸等供機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)合成、能量代謝等生命活動(dòng)。自噬具有重要意義：一方面，細(xì)胞長期維持低水平的自噬活動(dòng)，清除生命活動(dòng)中產(chǎn)生的各種“不良”物質(zhì)，維持胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定；另一方面發(fā)生營養(yǎng)匱乏、缺氧、炎性反應(yīng)、感染等應(yīng)激狀況時(shí)，胞內(nèi)自噬活動(dòng)增強(qiáng)，產(chǎn)生更多氨基酸、核苷酸等，細(xì)胞藉此對抗應(yīng)激、維持存活[1]。自噬分為啟動(dòng)、成核、延伸、融合降解四個(gè)階段，每個(gè)階段都受到相關(guān)蛋白的精密調(diào)控。自噬啟動(dòng)時(shí)，ULK1脫磷酸，ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復(fù)合體活化，激活A(yù)mbra1，Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1復(fù)合體在成核部位聚集并活化，Ambra1與TRAF6還可活化ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復(fù)合體，活化的Beclin-1-Vsp34-Vsp15-ATG14L-Ambra1復(fù)合體產(chǎn)生PI3P，PI3P募集DFCP1、WIPI等蛋白促進(jìn)成核(nucleation)；成核部位出現(xiàn)游離雙層膜結(jié)構(gòu)；ATG7、ATG10作用下，ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物形成，ATG7、ATG3作用下，水溶性LC-I結(jié)合PE變?yōu)橹苄缘腖C-II；兩者(ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物和LC-II)均結(jié)合在新生成的雙層膜結(jié)構(gòu)上，共同促使雙層膜結(jié)構(gòu)不斷延伸，包裹部分胞漿及待分解的底物，形成自噬體；隨后自噬體外膜與溶酶體融合，內(nèi)膜及包裹的底物釋放到溶酶體腔中被降解并循環(huán)利用，包括p62、NBR1、NDP52等多種支架蛋白參與此過程[2]。

2 自噬對骨重塑的作用

骨重塑是一個(gè)受到精密調(diào)控的過程，多種細(xì)胞、大量細(xì)胞因子及相關(guān)生化因子參與其中。細(xì)胞方面，來源于造血干細(xì)胞的破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收。隨后來源于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞合成骨基質(zhì)，并參與其礦化，生成新骨。成骨細(xì)胞包埋在礦化的骨基質(zhì)中變?yōu)榻K末分化的骨細(xì)胞，骨細(xì)胞感受骨內(nèi)的應(yīng)力及激素水平變化，調(diào)控成、破骨細(xì)胞活動(dòng)。大量研究表明，自噬相關(guān)蛋白參與調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞的生命活動(dòng)；全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因與身高及骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。種種跡象表明自噬參與骨重塑及相關(guān)疾病的調(diào)控過程。

2.1 成骨細(xì)胞與自噬 成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨形成，骨形成受到精密調(diào)控。諸如PTH、TGFβ-1、IGF、BMP等大量激素和細(xì)胞因子參與其調(diào)控[3]。有研究表明，BMP具有強(qiáng)烈成骨作用，它的拮抗劑NOG可以使急性胰腺炎細(xì)胞中LC-II降低，而加入過量BMP2后，這種效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，且BECN1、LAMP2水平會(huì)升高[4]。間接說明成骨活動(dòng)可能受到自噬調(diào)節(jié)。自噬受體NBR1是一種重要的支架蛋白，它一方面通過LIR結(jié)構(gòu)域與自噬體膜上的LC-II結(jié)合，另一方面通過UBA結(jié)構(gòu)域與底物結(jié)合，從而使底物結(jié)合到自噬體中。Whitehouse等[5]采用基因修飾的方法使NBR1的LIR和UBA結(jié)構(gòu)域缺失，構(gòu)建了Nbr1tr/tr小鼠模型。Nbr1tr/tr小鼠體內(nèi)自噬水平低，出生9個(gè)月時(shí)骨量、骨礦物質(zhì)密度與對照組相比顯著增加。細(xì)胞學(xué)研究表明，Nbr1tr/tr小鼠成骨細(xì)胞MAPK信號(hào)通路激活，細(xì)胞分化及成骨能力顯著增強(qiáng)[5]。然而有人得出不同結(jié)論，Liu等[6]靶向敲除了成骨細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬發(fā)生的ULK1-ATG13-ATG101-FIP200復(fù)合體的重要構(gòu)成物FIP200，構(gòu)建了FIP200F/F小鼠模型；出生6個(gè)月后小鼠體內(nèi)自噬水平低，骨質(zhì)及骨量較對照組明顯降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FIP200F/F小鼠成骨細(xì)胞的晚期分化能力以及礦化新合成的骨基質(zhì)的能力降低。與此相一致，Darcy等[7]發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Nollet等[8]發(fā)現(xiàn)敲除ATG7、BECN1的成骨細(xì)胞礦化新合成的骨基質(zhì)的能力降低，并指出自噬體可能是成骨細(xì)胞分泌羥基磷灰石的載體?？偟目磥恚允墒谴龠M(jìn)還是抑制成骨細(xì)胞分化、增殖及礦化成骨仍是一個(gè)懸而未決的問題，且涉及的分子機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。

2.2 破骨細(xì)胞與自噬 破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收。來源于造血干細(xì)胞的破骨前體細(xì)胞，受M-CSF、RANKL刺激后，分化為破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)中的有機(jī)物和無機(jī)物，致使骨基質(zhì)表面凹凸不平，形成細(xì)胞樣的骨陷窩。破骨細(xì)胞面向骨陷窩的一側(cè)，伸出許多絨毛樣的凸起，構(gòu)成刷狀緣。破骨細(xì)胞通過刷狀緣分泌酸及CTSK、MMP9、MMP13等水解酶來分解骨質(zhì)[3]。自噬可抑制破骨細(xì)胞增殖、分化及功能活化。DeSelm等[9]發(fā)現(xiàn)，敲除破骨細(xì)胞前體的ATG5、ATG7，破骨細(xì)胞刷狀緣形成障礙，水解酶分泌減少，骨吸收能力下降；而分化情況未受影響。免疫抑制藥雷帕霉素通過阻斷mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬。Sanchez等[10]發(fā)現(xiàn)給幼年大鼠飼喂雷帕霉素后其脛骨骨骺處破骨細(xì)胞數(shù)目減少，自噬水平降低。Smink等[11]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過C/EBPβ-MafB信號(hào)通路抑制自噬同時(shí)減少破骨細(xì)胞生成。但也有研究者認(rèn)為，自噬促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)。ZHAO等[12]使用自噬抑制藥3-MA處理缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的類破骨細(xì)胞RAW264.7，發(fā)現(xiàn)其增殖分化能力明顯降低，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞通過HIF-1a/BNIP3信號(hào)通路調(diào)控自噬及破骨細(xì)胞生成分化。越來越多研究表明，自噬參與破骨細(xì)胞增殖、分化及功能活化，細(xì)胞自噬活動(dòng)異常可能導(dǎo)致某些骨疾病的發(fā)生。通過前期研究人們對破骨細(xì)胞自噬活動(dòng)有了一定了解，但是對參與調(diào)控的相關(guān)分子通路仍然缺乏足夠了解，有待進(jìn)一步地研究。

2.3 骨細(xì)胞與自噬 骨細(xì)胞在骨重塑過程中發(fā)揮重要作用：一方面它合成骨硬化蛋白，通過Wnt信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞成骨[13]；另一方面合成RANKL，通過RANKL/RANK/OPG軸促進(jìn)破骨細(xì)胞破骨[14]。研究表明，骨細(xì)胞幫助破骨細(xì)胞識(shí)別骨重塑的發(fā)生部位，其凋亡崩解后釋放含有RANKL的凋亡小體，促進(jìn)破骨[15]。骨細(xì)胞是終末分化的成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞包埋在新合成的骨基質(zhì)中，伸出突起與周圍細(xì)胞形成縫隙連接，分化為骨細(xì)胞。骨組織內(nèi)缺氧且營養(yǎng)相對匱乏，骨細(xì)胞在其中長期生存，存在較高自噬水平。Zahm等[16]發(fā)現(xiàn)小鼠長骨來源的骨樣細(xì)胞MLO-A5細(xì)胞系在營養(yǎng)匱乏、缺氧等應(yīng)激條件下自噬水平升高，進(jìn)而推測自噬是骨細(xì)胞在骨組織應(yīng)激條件下得以長期生存的原因。Onal等[17]發(fā)現(xiàn)，靶向敲除骨細(xì)胞Atg7，小鼠自噬水平降低，皮質(zhì)骨變薄，骨量明顯下降，與衰老時(shí)骨骼的表現(xiàn)一致，因此，可以推測動(dòng)物衰老后骨量減低與骨細(xì)胞的較低自噬水平有關(guān)。Luo等[15]定期向衰老大鼠腹腔注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，3個(gè)月后大鼠骨細(xì)胞自噬水平升高，骨量下降速度減緩。目前關(guān)于骨細(xì)胞自噬的研究相對較少，現(xiàn)有的證據(jù)表明自噬可能延長骨細(xì)胞存活時(shí)間，防止骨流失。關(guān)于自噬如何調(diào)控骨細(xì)胞功能發(fā)揮還有待進(jìn)一步闡明。

2.4 骨疾病與自噬 骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減低、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特點(diǎn)的代謝性骨病。好發(fā)于老年人及絕經(jīng)后婦女，它起病隱匿，患者往往在發(fā)生骨折或是體檢時(shí)才發(fā)現(xiàn)患病。致死、致殘率高，給患者及其家庭帶來巨大的身心痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨重塑異常被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的可能病因[18]。目前，人們對調(diào)控骨重塑的分子通路仍然缺乏足夠認(rèn)識(shí)。通過研究各種骨細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及相關(guān)分子機(jī)制，有助于深入了解骨質(zhì)疏松癥的病因并找到對應(yīng)的藥物靶點(diǎn)。骨折是骨的完整性和連續(xù)性遭到破壞。骨折后，骨及周圍組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)被打破，機(jī)體發(fā)生一系列生理和病理反應(yīng)來恢復(fù)骨折前的平衡狀態(tài)。以往的研究表明，對抗應(yīng)激、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是自噬的基本作用。那么，骨折后機(jī)體的自噬水平是否發(fā)生變化？能否通過調(diào)控自噬來影響骨折恢復(fù)進(jìn)程呢？對于這些問題一些研究小組已經(jīng)進(jìn)行了初步的探索。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)骨折局部細(xì)胞增殖水平和自噬水平正相關(guān)。Ge等[20]發(fā)現(xiàn)，通過腹腔給予骨折大鼠自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以使其自噬水平提高、骨痂形成量增多、骨折愈合加速。然而，雷帕霉素不良反應(yīng)較大，找到傷害小、療效好的自噬調(diào)節(jié)劑是未來研究的一個(gè)方向。

雖然前期研究取得部分進(jìn)展，但還有許多問題亟待解決。如，是自噬相關(guān)蛋白還是自噬過程本身參與調(diào)控骨重塑過程？自噬通過哪些分子通路調(diào)控各類骨細(xì)胞的增殖、分化及功能活化？自噬過程如何影響各類骨細(xì)胞的生存和死亡？研究自噬活動(dòng)與骨重塑的關(guān)系意義重大：一方面可以加深對諸如骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨病病因及骨折愈合過程的了解，發(fā)現(xiàn)代謝性骨病的新治療靶點(diǎn)以及加速骨折愈合的方法；另一方面可以探索新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，拓展原有技術(shù)的應(yīng)用范圍。相信隨著研究技術(shù)的進(jìn)步和相關(guān)知識(shí)的積累，在這方面的研究會(huì)取得越來越多的成果。

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(2016-04-05收稿 2016-07-15修回)

(責(zé)任編輯 張 楠)

劉 勃，碩士研究生。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科

張立海，E-mail:zhanglihai74@qq.com

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