間歇式低氧對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群的影響

周仙杰,李 軍,魯飛翔,夏靖媛,劉慶春

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間歇式低氧對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群的影響

周仙杰1,李 軍2,魯飛翔1,夏靖媛1,劉慶春1

目的 了解間歇式低氧對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction, TAC)模型小鼠腸道菌群的影響。方法 18只C57 BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)常氧組(C組)，主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組(TC組)，主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組(TH組)，每組各6只。間歇式低氧的條件為氧濃度10.5%，每天8 h低氧，16 h常氧，交替進(jìn)行，連續(xù)10 d。獲取小鼠盲腸糞便中細(xì)菌DNA，經(jīng)16 S rDNA測(cè)序檢測(cè)小鼠盲腸糞便中微生物組成，應(yīng)用微生物生態(tài)學(xué)定量觀察進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組與假手術(shù)常氧組、主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組相比，互營(yíng)桿菌科顯示出更低的豐度。TC組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，TC組與TH組比較P=0.013。結(jié)論 間歇式低氧處理使主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群發(fā)生了改變，這種改變對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄的進(jìn)程是否有影響仍需進(jìn)一步研究。

間歇式低氧；主動(dòng)脈弓縮窄；腸道菌群

間歇式低氧是低氧和常氧反復(fù)交替周期循環(huán)的一種供氧模式[1]。間歇式低氧訓(xùn)練可用于適應(yīng)高海拔時(shí)的低氧環(huán)境和提高需氧耐受。同時(shí)可增加紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白濃度，降低運(yùn)動(dòng)時(shí)的心率反應(yīng)[2]。此外,間歇性低氧可增加心肌血管，冠狀動(dòng)脈血流，心肌紅蛋白和增加抗氧化酶和應(yīng)激蛋白的表達(dá)[3]。本課題組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠心臟發(fā)生肥大且肺內(nèi)有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，間歇式低氧處理可以抑制主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)。通過(guò)基因和蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，間歇式低氧處理后主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠的S100A8和S100A9的表達(dá)量增加。S100A8和S100A9是固有免疫效應(yīng)分子抗菌肽的成員，同時(shí)也是鈣結(jié)合蛋白S100家族的成員[4]。鈣結(jié)合蛋白是炎性反應(yīng)性腸病的標(biāo)志物[5]，炎性反應(yīng)性腸病發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變，同時(shí)宿主腸道菌群的組成和功能也會(huì)發(fā)生改變。腸道菌群可通過(guò)多條途徑參與免疫反應(yīng)，對(duì)炎性反應(yīng)的發(fā)生和抑制具有重要作用[6]。從菌對(duì)機(jī)體的影響來(lái)說(shuō)，腸道內(nèi)微生物可分為致病菌、條件致病菌和益生菌等。從氧依賴的角度來(lái)說(shuō)，腸道內(nèi)微生物主要包括專性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，隨著宿主免疫狀態(tài)的改變，這些菌處于動(dòng)態(tài)變化中。腸道菌群不僅可參與免疫調(diào)節(jié)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)血壓，參與機(jī)體內(nèi)多種反應(yīng)的進(jìn)行[7]。目前，間歇式低氧處理能否通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)抑制主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)及其相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。本研究將通過(guò)16S rDNA測(cè)序的方法檢測(cè)間歇式低氧處理后小鼠腸道內(nèi)微生物的組成，探討間歇式低氧處理后主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選擇8～10周齡清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠18只，體重20～25 g。購(gòu)自北京維通利華提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào) SYXK(京)2011-0003。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食和飲水，光照為明暗12/12 h交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，動(dòng)物隨機(jī)分為3 組，假手術(shù)常氧組(C組)，主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組(TC組)，主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組(TH組)，每組各6只。

1.2 方法

1.2.1 主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù) 將雄性C57BL/6小鼠麻醉后，去除頸部和胸部的毛，再用優(yōu)碘和酒精清洗后置于仰臥位，用加熱墊使溫度保持在37 ℃。水平切開(kāi)0.5～1.0 cm胸骨上切跡皮膚。撥開(kāi)胸腺，在胸骨近端處，縱向切割2～3 mm，為低放大倍率觀察主動(dòng)脈弓提供視野。一端帶有圈套的線從右無(wú)名小管根部和左頸總動(dòng)脈之間的主動(dòng)脈下穿過(guò)，用6-0縫合線綁在圈套上將線從主動(dòng)脈拉出。彎曲的27號(hào)針頭放于主動(dòng)脈弓旁，然后緊貼針和主動(dòng)脈周圍縫合。結(jié)扎后，迅速取出針。閉合皮膚，將小鼠放在暖墊上恢復(fù)，直到他們完全清醒[8-10]。假手術(shù)組，除不結(jié)扎，其他與主動(dòng)脈弓縮窄組相同。

1.2.2 間歇式低氧處理 模型制作后，常規(guī)飼養(yǎng)第8天對(duì)TH組小鼠進(jìn)行間歇式低氧干預(yù)。間歇式低氧條件為，通過(guò)制氮機(jī)(北京創(chuàng)文氣體有限公司)、凍干機(jī)(杭州超濾)和空氣壓縮機(jī)(美國(guó)英格索蘭) 共同作用將空氣中的氮?dú)馔ㄈ雱?dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)達(dá)到10.5%的氧濃度(相當(dāng)于海拔4500 m的高度)，每天8 h低氧，16 h常氧，交替進(jìn)行，連續(xù)10 d。C組和TC組小鼠在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，氧濃度為21%。

1.2.3 小鼠盲腸糞便中細(xì)菌DNA的提取 間歇式低氧干預(yù)后，小鼠頸椎脫臼處死，稱取0.1～0.2 g小鼠盲腸糞便，提取細(xì)菌DNA。使用強(qiáng)力糞便DNA提取試劑盒，購(gòu)自深圳市安必勝科技有限公司，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Qubit檢測(cè)來(lái)確定DNA的大小和質(zhì)量。TC組1只小鼠DNA樣品量未達(dá)到樣品測(cè)序要求，因此后續(xù)試驗(yàn)TC組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)為5只。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和16S rDNA測(cè)序 小鼠盲腸糞便中細(xì)菌DNA提取和檢測(cè)后，將16S rDNA基因V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物為341F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)。反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性1 min； 30 個(gè)循環(huán)(98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s)； 72 ℃，5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物， GeneJET 膠回收試劑盒(購(gòu)自Thermo Scientific 公司)純化2次。NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit建庫(kù)試劑盒(購(gòu)自New England Biolabs 公司)構(gòu)建文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用Illumina公司的HiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序后得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分類單元(operational Taxonomic Units，OTUs)聚類和物種分類分析，結(jié)合物種注釋信息，從而得到每組樣品的OTUs數(shù)和物種注釋的基本分析結(jié)果。再根據(jù)物種注釋結(jié)果，進(jìn)行組間群落組成分析，挖掘組間樣品的物種組成差異[11,12]。

1.3 觀測(cè)指標(biāo) 測(cè)序后的序列進(jìn)行分類聚類和物種注釋。通過(guò)各組總的序列數(shù)目、無(wú)法聚類到OTUs的序列數(shù)目、聚類到OTUs但沒(méi)有獲得注釋信息的序列數(shù)目和構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列數(shù)目，了解測(cè)序的基本情況。根據(jù)注釋結(jié)果，計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和Chao1指數(shù)，用以評(píng)估樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度。根據(jù)各組樣品OTUs(物種)數(shù)目，獲得組間共有的物種數(shù)和特有的物種數(shù)。同時(shí)通過(guò)分析不同細(xì)菌水平樣品中微生物的組成，獲得門、科和屬三個(gè)細(xì)菌水平上，相對(duì)豐度較高的菌的組成，并篩選差異菌。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重的變化 實(shí)驗(yàn)處理前后，小鼠體重C組和TC組、TC組和TH組組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。處理后C組和TC組小鼠體重與各自處理前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但TH組間歇式低氧處理后與處理前相比小鼠體重有增加的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠低氧處理前后體重比較 ；g)

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組；P1. 處理前組間P值；P2. 處理后組間P值；P3. 各組處理前后P值

2.2 間歇式低氧組和常氧組小鼠腸道菌群多樣性評(píng)估 將測(cè)序后C組獲得的41 505條序列，TC組獲得的42 739條序列和TH組獲得的39 072條序列進(jìn)行分類單元(OTUs)聚類和注釋，其中C組有38 664條序列，TC組有41 143條序列，TH組有37 491條序列構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息，TC組和C組比較P值為0.661，TH組和TC組比較P值為0.296，各組聚類和注釋情況見(jiàn)圖1。根據(jù)聚類和注釋結(jié)果，利用α-多樣性指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和Chao1評(píng)估樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度，見(jiàn)表2。TC組和C組比較，TH組和TC組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明本研究處理?xiàng)l件下樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度并未發(fā)生改變。將構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列均一化處理之后進(jìn)行后續(xù)分析。C組有827個(gè)OTU，TC組有704個(gè)OTU，TH組有777個(gè)OTU用于分析。其中C組、TC組和TH組共有的OTUs數(shù)目為578，C組和TC組共有的OTUs數(shù)目為69，C組和TH組共有的OTUs數(shù)目為113，TC組和TH組共有的OTUs數(shù)目為39。C組、TC組和TH組特有的OTUs數(shù)目分別為67、18和47。不同組間共有和特有的OTU數(shù)目(物種數(shù)目)，見(jiàn)圖2。

2.3 間歇式低氧組和常氧組小鼠糞便樣本中微生物16S rDNA序列分析 根據(jù)OTUs的注釋結(jié)果，分析不同細(xì)菌水平樣品中微生物的組成。在門水平， 相對(duì)豐度較高的菌為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，見(jiàn)圖3。TC組和C組相比，擬桿菌門的相對(duì)豐度為0.404和0.428，厚壁菌門的相對(duì)豐度為0.302和0.357，變形菌門的相對(duì)豐度為0.27和0.202，組間均無(wú)顯著性差異。TH組和TC組相比，擬桿菌門的相對(duì)豐度為0.447和0.404，變形菌門的相對(duì)豐度為0.25和0.27，組間均無(wú)顯著性差異。厚壁菌門的相對(duì)豐度為0.258和0.302，與TC組相比，TH組厚壁菌門的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，差異顯著，但厚壁菌門與擬桿菌門相對(duì)豐度的比值并無(wú)顯著性差異。在科水平，組間有差異的細(xì)菌主要是乳酸桿菌科和互營(yíng)桿菌科，見(jiàn)表3。與C組相比，TC組乳酸桿菌科和互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度有降低的趨勢(shì)，差異有顯著性。與TC組相比，TH組互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)，差異有顯著性。TC組和C組、TH組比較，互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度具有顯著性差異。在屬水平，TC組和C組相比，有顯著性差異的菌屬為乳桿菌屬(P=0.045)，梭菌屬(P=0.034)和吉氏副擬桿菌屬(P=0.045)。同時(shí)TC組相比于C組乳桿菌屬和梭菌屬的相對(duì)豐度降低，吉氏副擬桿菌屬的相對(duì)豐度增加。TH組和TC組相比，有顯著性差異的菌屬為Butyricicoccus，P=0.028，且TH組Butyricicoccus的相對(duì)豐度較低。本研究，TC組和C組比較，主要的菌門的相對(duì)豐度未發(fā)現(xiàn)顯著性變化，但科水平上乳酸桿菌科和互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度發(fā)生改變，同時(shí)屬水平上吉氏副擬桿菌屬、乳桿菌屬和梭菌屬的相對(duì)豐度發(fā)生改變。TH組和TC組比較，主要的菌門中厚壁菌門的相對(duì)豐度發(fā)生改變，但厚壁菌門與擬桿菌門相對(duì)豐度的比值并未發(fā)生改變。主要的菌科中互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度發(fā)生改變，且主要的菌屬中Butyricicoccus的相對(duì)豐度發(fā)生改變。因此TC組和C組、TH組相比，互營(yíng)桿菌科的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 C組、TC組和TH組樣品OTUs聚類

注：Total_Tag：測(cè)序后各組總的序列數(shù)目；Unique_Tag：無(wú)法聚類到OTUs的序列數(shù)目；Unclassified_Tag：聚類到OTUs但沒(méi)有獲得注釋信息的序列數(shù)目；Taxon_Tag：構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列數(shù)目

組別nChao1P1ShannonP2C組6518.00±56.28-6.17±0.41-TC組5483.20±91.680.4585.60±0.550.08TH組6462.33±45.030.6335.67±1.030.991

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組；P1. Chaol組間P值；P2. Shannan組間P值

圖2 C組、TC組和TH組樣品OTUs(物種)數(shù)目

注： C組、TC組和TH組共有的OTUs為578個(gè)； C組和TC組共有的OTUs為69個(gè)； C組和TH組共有的OTUs為113個(gè)； TC組和TH組共有的OTUs為39個(gè)

表3 C組、TC組和TH組科水平物種的相對(duì)豐度

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動(dòng)脈弓縮窄模型低氧組；P1. Lactobacillaceae組間P值；P2. Odoribacteraceae組間P值；P3. Syntrophobacteraceae組間P值

3 討 論

本研究運(yùn)用16S rDNA測(cè)序的方法檢測(cè)了間歇式低氧處理后主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠腸道微生物的組成。間歇式低氧處理后TH組小鼠體重與處理前相比顯著性增加。此外TC組和C組、TH組相比，Syntrophobacteraceae的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究顯示持續(xù)性低氧可能影響蛋白質(zhì)的代謝，導(dǎo)致體重的丟失[13]。本研究間歇式低氧處理后小鼠體重出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這表明間歇式低氧模式可能對(duì)小鼠具有有利的影響，其因果關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果顯示，門水平上，相對(duì)豐度較高的菌為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，這與其他腸道微生物相關(guān)研究的結(jié)果是一致的。主動(dòng)脈弓縮窄模型常氧組與假手術(shù)常氧組相比，科水平上，Lactobacillaceae、Odoribacteraceae和Syntrophobacteraceae的相對(duì)豐度發(fā)生改變。屬水平上Lactobacillus、Odoribacter、Clostridium和Parabacteroides的相對(duì)豐度發(fā)生改變。Lactobacillus對(duì)血壓的影響目前還存在爭(zhēng)議，Odoribacter和Parabacteroides與主動(dòng)脈弓縮窄相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，Lactobacillus、Odoribacter和Parabacteroides與主動(dòng)脈弓縮窄的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。Clostridium屬于厭氧芽孢桿菌，在主動(dòng)脈弓縮窄組顯著性減少，間歇式低氧組未出現(xiàn)降低趨勢(shì)。其下屬的丁酸梭菌可以促進(jìn)腸道有益菌的增值和抑制有害菌的繁殖，其代謝產(chǎn)物丁酸對(duì)腸上皮組織和鈉的吸收具有促進(jìn)作用，對(duì)血壓具有一定的影響。間歇式低氧處理后相對(duì)豐度發(fā)生改變的菌主要是Syntrophobacteraceae和Butyricicoccus。低氧處理后Syntrophobacteraceae的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)。Syntrophobacteraceae屬于厭氧互營(yíng)菌，參與丙酸鹽向乙酸鹽、二氧化碳和氫氣等有機(jī)物的降解過(guò)程，可以為其他微生物提供基質(zhì)[14]。同時(shí)有研究顯示，依賴腸道菌群產(chǎn)生的丙酸鹽可通過(guò)嗅覺(jué)受體78(Olfr78)和G蛋白偶聯(lián)受體41(Gpr41)調(diào)節(jié)血壓[15]。Butyricicoccus可以代謝產(chǎn)生丁酸鹽，間歇式低氧Butyricicoccus相對(duì)豐度降低，這與已報(bào)道的Butyricicoccus的相關(guān)研究結(jié)果不一致。這可能與Butyricicoccus的活性受到抑制相關(guān)，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)豐度發(fā)生改變的菌多是厭氧菌，間歇式低氧處理可能通過(guò)改變小鼠腸道內(nèi)氧氣的濃度，提高厭氧菌耐受和代謝，通過(guò)小鼠腸道內(nèi)微生物組成的改變及其產(chǎn)物的代謝對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄小鼠的血壓和炎性反應(yīng)等具有一定的影響。間歇式低氧處理是如何通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)抑制主動(dòng)脈弓縮窄模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)的相關(guān)內(nèi)容仍需進(jìn)一步研究。

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(2016-05-11收稿 2016-09-23修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Effect of intermittent hypoxia on transverse aortic constriction of intestinal flora in a murine model

ZHOU Xianjie1,LI Jun2, LU Feixiang1, XIA Jingyuan1, and LIU Qingchun1.1.General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China;2.Laboratory Animal Center, Peking University, Beijing 100871, China

Objective To study the influence of intermittent hypoxia on transverse aortic constriction (TAC) of intestinal flora in a murine model.Methods Eighteen C57BL/6 mice were evenly and randomly divided into three groups: Group C, Group TC and Group TH. Twelve of these mice were subjected to transverse aortic constriction and six model mice to a pattern of intermittent hypoxia (8 h at 10.5% O2 and 16 h at room air) for 10 days. Twelve mice served as normoxic controls. Faecal samples were obtained and microbiome composition was determined by 16 S rDNA pyrosequencing and bioinformatics analysis by Quantitative Insights into Microbial Ecology.Results A lower abundance of Syntrophobacteraceae was detected in the normoxic-exposed transverse aortic constriction model mice than in controls.The difference between TC and C was of statistical significance (P=0.004), but wasP=0.013 between TC and TH.Conclusion sIntermittent hypoxia can alter intestinal flora in a mouse model. Whether this change has influence on the progress of the transverse aortic constriction needs to be further studied.

intermittent hypoxia；transverse aortic constriction；intestinal flora

周仙杰，碩士研究生。

1.100039 北京，武警總醫(yī)院采購(gòu)中心;2.100871，北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

劉慶春，E-mail：lqc@vip.163.com

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