縫隙連接在重度失血性休克兔腦損傷延生復(fù)蘇中對(duì)細(xì)胞能量代謝的作用

李珍，高鴻，李?lèi)?ài)媛

（1.湖南省婦幼保健院 麻醉科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

重度失血性休克所致腦缺血性腦損傷引起腦水腫是腦損傷中的重要病理過(guò)程，腦水腫與腦缺血互為因果惡性循環(huán)加重腦損傷，甚至導(dǎo)致患者出現(xiàn)不可逆腦損傷。已知“低溫”對(duì)腦有保護(hù)作用，采用低溫措施已證明能夠減輕腦水腫，降低死亡率[1]，并有研究報(bào)道低溫可能通過(guò)抑制GJ通訊功能來(lái)發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。但事故現(xiàn)場(chǎng)條件的限制往往使低溫措施不能很好實(shí)施，與低溫相比，如藥物能達(dá)到同樣的腦保護(hù)效果則在搶救現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)際應(yīng)用中有明顯的優(yōu)越性，因此探尋低溫及能替代低溫而防治腦水腫內(nèi)在機(jī)制，尋找簡(jiǎn)便易行的藥物和方法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)延生復(fù)蘇具有重要的意義。自1984年Bellamy和Safar提出“延生復(fù)蘇”以來(lái)，延生復(fù)蘇迅速成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究休克患者救治策略的熱點(diǎn)。許多學(xué)者認(rèn)為延生復(fù)蘇可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞能量保存及降低細(xì)胞氧自由基等途徑減輕休克患者重要器官在腦缺血缺氧期間的損傷。

本課題組先前的研究提示縫隙連接（gap junction, GJ）與重度失血性休克兔腦損傷密切相關(guān)[3]，抑制縫隙連接可減輕腦水腫，本研究在早先研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用重度失血性休克兔模型，進(jìn)一步探討抑制縫隙連接對(duì)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力的影響，以期深入探討研究GJ在腦損傷中作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器試劑

BL-420E+生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，中國(guó)）；TKR-200A小動(dòng)物呼吸機(jī)（江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司，中國(guó)）；辛醇（Sigma公司，美國(guó)）；超微量Na+-K+-ATP酶試劑盒、超微量Ca2+-ATP酶試劑盒（南京建成生物公司）；兔抗Cx43多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的24 只健康家兔，體重1.8～2.2 kg，雌雄不限。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，隨機(jī)分為4組：A組（常規(guī)復(fù)蘇組）、B組（低溫復(fù)蘇組）、C組（辛醇復(fù)蘇組）和D組（低溫+辛醇復(fù)蘇組），每組6只。

1.3 動(dòng)物模型制作

動(dòng)物麻醉后，記錄基礎(chǔ)（T1時(shí)點(diǎn)）的左室收 縮 壓（left ventricular systolic pressure, LVSP）、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure, MAP）和心率（heart rate, HR）等生理指標(biāo)。根據(jù)改良的Wiggers法分三期制作重度失血性休克兔模型：Ⅰ期（失血休克期80 min），常規(guī)肝素化500 u/kg，15 min內(nèi)經(jīng)股動(dòng)脈插管快速放血，使MAP降至50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），穩(wěn)定5 min，然后經(jīng)血液回輸或放血使MAP維持在35～40 mmHg，持續(xù)60 min，記錄各生理指標(biāo)（T2時(shí)點(diǎn)）。Ⅱ期（院外救助期30 min）,對(duì)A組兔快速輸入1 ml/（kg·min）平衡鹽液，使MAP迅速大于等于80 mmHg；B組兔冰水帽頭部冰敷，冰袋置于大血管處，維持肛溫在35℃左右；C組99.5%辛醇（縫隙連接抑制劑）0.35 ml/kg緩慢注入腹腔；D組兔同時(shí)接受B組加C組處理。救助30 min后記錄各生理指標(biāo)（T3時(shí)點(diǎn)）。Ⅲ期（院內(nèi)復(fù)蘇期180 min），前30 min內(nèi)回輸全部放出的血液及等量的平衡液，后以2.5 ml/ （kg·h）的速度輸注平衡液。觀察150 min后記錄各生理指標(biāo)（T4時(shí)點(diǎn)）。兔處死后，取前右半腦組織作腦干濕重比檢測(cè)，置于零下20℃冰箱中保存；并留取部分腦皮層組織作Cx43免疫組化，取腦組織測(cè)Na+- K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力。

1.4 腦組織干濕重比測(cè)定

動(dòng)物處死后切開(kāi)腦，冠狀面截取右側(cè)大腦組織前半部分，以無(wú)菌生理鹽水充分洗掉血跡，用吸水紙吸干腦組織表面水，置于干燥的電子分析天平稱(chēng)（Sartorius BS223S型）稱(chēng)重，重量精確到0.1 mg，再將標(biāo)本放于95～100℃的紅外線干燥箱內(nèi)烘72 h，稱(chēng)取干質(zhì)量。計(jì)算公式為：腦組織干濕重比=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.5 Cx43免疫組織化學(xué)檢測(cè)

每個(gè)標(biāo)本取6至8張切片，常規(guī)抗原微波熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗滌2次，加正常山羊血清室溫封閉40 min；滴加稀釋成1:100的小鼠抗大鼠Cx43單克隆抗體，4℃冰箱過(guò)夜，37℃復(fù)溫45 min；PBS洗滌3次后，加生物素羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG），37℃孵育40 min；再PBS洗滌3次，加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex, SABC）37℃濕盒孵育40 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯通明，封片，鏡檢，照相。每張切片按從左到右選3行，每行3個(gè)視野，每個(gè)視野直徑為0.2 cm，共9個(gè)視野在顯微鏡下觀察并記錄胞內(nèi)表達(dá)Cx43的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 Na+-K+-ATP酶測(cè)定

先用電子分析天平稱(chēng)稱(chēng)出腦組織重量，按重量體積比制成10%勻漿，以考馬斯亮蘭法測(cè)定腦組織蛋白含量；按照南京建成生物公司的說(shuō)明書(shū)先后進(jìn)行酶促反應(yīng)、定磷，用分光光度計(jì)測(cè)量各管標(biāo)本吸光光度值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算Na+-K+-ATP酶活力。

1.7 Ca2+-ATP酶測(cè)定

先稱(chēng)取腦組織重量，勻漿后以考馬斯亮蘭法測(cè)定腦組織蛋白含量；根據(jù)南京建成生物公司的說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行酶促反應(yīng)、定磷，以分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光光度值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算Ca2+-ATP酶活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間整體分析采用單因素方差分析，后續(xù)組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織干濕重比測(cè)定結(jié)果

A、B、C和D組腦干濕重比（%）分別為85.712±1.731、79.035±0.460、79.812±1.201 和79.167±0.378。4組腦組織干濕重比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.648,P=0.000）；A組腦干濕重比明顯高于B組、C和D組（q?=20.481, 19.134,20.352;P＜0.05）；B、C和D 3組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.302,P=0.134）。

2.2 Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況

A、B、C和D組Cx43免疫組化的每高倍鏡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)分別是：23.333±5.315、39.666±2.549、36.444±3.126 和 38.333±2.828；方差分析顯示4組Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=129.667,P=0.000）；B組Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于A組（q?=11.047,P＜0.05），C組Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于A組（q?=8.905,P＜0.05），D組Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于 A 組（q?=10.145,P＜0.05） ；B、C、D 3組Cx43免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.479,P=0.223）。見(jiàn)圖1。

2.3 各組兔腦組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力

4組Na+-K+-ATP酶活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.433,P=0.000）；B組 Na+-K+-ATP酶活 力 明 顯 高 于 A組（q=7.498,P＜0.05），C組Na+-K+- ATP酶 活 力 明 顯 高 于 A 組（q?=6.795,P＜0.05），D 組 Na+-K+-ATP酶 活 力 明 顯 高于 A 組（q=6.778,P＜0.05）；B、C、D 3組Na+-K+- ATP酶活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.177,P=0.840）。4組Ca2+-ATP酶 活 力 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.839,P=0.000）；B組Ca2+-ATP酶活力明顯高于A組（q?=10.064,P＜0.05），C組Ca2+- ATP酶活力明顯高于 A組（q?=12.792,P＜0.05），D 組 Ca2+-ATP酶 活 力 明顯 高 于 A 組（q?=11.224,P＜0.05）；B、C、D 3 組Ca2+-ATP酶活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.045,P=0.164）。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組化檢測(cè)Cx43的表達(dá)（SABC×100）

表1 各組兔腦組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力比較 [±s, μmol/(mg·h), n =6]

表1 各組兔腦組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力比較 [±s, μmol/(mg·h), n =6]

注：?與A組比較，P ＜0.05。

組別 Na+-K+-ATP酶活力 Ca2+-ATP酶活力A 3.559±0.672 1.653±0.169 B 5.486±0.633? 2.248±0.098?5.305±0.354? 2.410±0.205?D 5.300±0.780? 2.317±0.077?C

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換及信息傳遞除突觸外，縫隙連接（gap junction, GJ）起著舉足輕重的作用。一個(gè)完整縫隙連接由相鄰兩個(gè)細(xì)胞膜上的兩個(gè)半通道兩兩相對(duì)銜接而成。由6個(gè)GJ蛋白（connexin, Cx）組成的半通道是個(gè)中空六聚體結(jié)構(gòu)，相鄰細(xì)胞的胞漿由小體中的管道連接，GJ鑲嵌于兩層細(xì)胞膜上，形成兩層細(xì)胞間的偶合通道[4]。成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)的GJ蛋白是Cx43。GJ的開(kāi)啟和關(guān)閉受到pH值、ATP濃度、跨膜電壓、細(xì)胞內(nèi)Ga2+濃度等神經(jīng)體液及其他蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子的影響。由于GJ可允許分子量＜1.2 KDa或直徑＜1.5 nm的小分子物質(zhì)和各種信息離子通過(guò)[5]，如水分子、所有的氨基酸、短肽、相關(guān)的離子（Cl-、Na+、K+及Ca2+）、第二信使（cAMP、IP3等）、代謝產(chǎn)物和一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，由此提供了細(xì)胞之間直接通訊的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，它們通過(guò)GJ通訊，在機(jī)體正常生理情況和遭受有害刺激時(shí)，可維持胞內(nèi)、胞外離子的穩(wěn)定和代謝物質(zhì)的交換[6]及各種信息因子等縫隙連接影響腦細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等諸多基本生理功能，并參與腦組織的增殖和分化、凋亡，從而與癲癇、腦腫瘤、缺血缺氧性腦病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

既往研究對(duì)腦組織缺血缺氧時(shí)GJ的作用存在不同看法，有人認(rèn)為抑制GJ對(duì)腦細(xì)胞有損傷作用，如：Blanc等[7]采用胎鼠海馬神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)，采用四氧硫化鐵和4-羥基壬烯醛（FeSO4and 4-hydroxynonenal）氧化性刺激，發(fā)現(xiàn)予以GJ脫偶聯(lián)劑18-α-甘草次酸處理后，與對(duì)照組相比神經(jīng)元死亡增多，胞內(nèi)氧自由基增多，鈣離子嚴(yán)重超載。作者認(rèn)為：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間的通訊連接阻斷，增加了神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧應(yīng)激的易損性。Li等[8]通過(guò)在活體大鼠制作大腦MCAO（middle cerebral artery occlusion，中動(dòng)脈閉塞）模型，局部缺血2 小時(shí)，再灌注24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)Cx43 mRNA表達(dá)降低，細(xì)胞縫隙連接通訊（gap junction intercellular communication, GJIC）功能降低，缺血再灌注前或后，采用銀杏葉提取物或尼莫地平都可增加Cx43表達(dá)，GJIC提高。但有人持相反觀點(diǎn)，國(guó)內(nèi)鄧方等[9]利用線栓法制作MCAO模型，觀察給予GJ解耦聯(lián)劑辛醇后腦梗死面積變化及病理學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)給予辛醇后梗死面積縮小，病理改變較輕，張光運(yùn)等[10]采用甘珀酸作為GJ阻斷劑觀察其對(duì)局灶腦梗死腦缺血損傷的保護(hù)作用，亦獲得類(lèi)似結(jié)果。Rawanduzy等[11]運(yùn)用MCAO模型，通過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，術(shù)前辛醇預(yù)處理的大鼠腦梗死體積明顯減小。作者認(rèn)為通過(guò)阻斷GJIC，可減少潛在的毒性細(xì)胞介質(zhì)由壞死區(qū)向非缺氧細(xì)胞區(qū)擴(kuò)散，從而減少局部缺血損傷的蔓延放大。鄧方等[12]綜述了GJ加重缺血性腦卒中過(guò)程中的腦損傷機(jī)制：①參與向半影區(qū)傳播有害介質(zhì)；②介導(dǎo)擴(kuò)散性抑制波向半影區(qū)的傳播；③導(dǎo)致鄰近細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失。也有人認(rèn)為增強(qiáng)或抑制GJ通訊就像一把“雙刃劍”，在不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中何時(shí)該增強(qiáng)或降低應(yīng)視具體情況具體分析。如機(jī)體在遭受重度損傷時(shí)應(yīng)抑制GJ間的通訊，以減少有害的信息從受損的細(xì)胞向周?chē)】档募?xì)胞擴(kuò)散，從而使損傷放大；而損傷修復(fù)期應(yīng)增強(qiáng)GJ間的通訊，使修復(fù)信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入待修復(fù)的細(xì)胞[13]。筆者認(rèn)為細(xì)胞通過(guò)縫隙連接既可傳遞對(duì)細(xì)胞有害的信息，也可傳遞對(duì)細(xì)胞有益的信息。而在重度失血性休克后，機(jī)體細(xì)胞遭受了嚴(yán)重的缺血缺氧性打擊，細(xì)胞接受的最強(qiáng)的信息主要以損傷為主，其傳遞給臨近細(xì)胞有害（損傷）信息大大掩蓋了修復(fù)信息的作用。

采用免疫組化發(fā)現(xiàn)辛醇復(fù)蘇組、低溫復(fù)蘇組及辛醇+低溫復(fù)蘇組Cx43蛋白表達(dá)水平均較常規(guī)復(fù)蘇組有升高。GJ是一種處于動(dòng)態(tài)平衡的膜通道結(jié)構(gòu)，辛醇致GJ解耦聯(lián)，阻斷縫隙鏈接間信息通訊，但并未破環(huán)Cx43，細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)Cx蛋白合成增加來(lái)維持膜上一定數(shù)量的GJ；低溫可降低GJ的通訊功能，可能亦通過(guò)影響GJ而產(chǎn)生類(lèi)似作用。因此，筆者認(rèn)為抑制縫隙連接間的通訊對(duì)重度失血性休克缺血性腦損傷延生復(fù)蘇有利，為證明是否存在其他機(jī)制筆者進(jìn)一步檢測(cè)了Na+-K+-ATP酶活力、Ca2+-ATP酶活力。

Na+-K+-ATP酶又稱(chēng)Na+-K+泵，由α、β兩亞基組成，既有Na+、K+結(jié)合位點(diǎn)，又有ATP酶活性。α亞基為分子量約120 KD的跨膜蛋白，β亞基為小亞基，是分子量約50 KD的糖蛋白。Na+-K+泵主要參與維持細(xì)胞的滲透性，保持細(xì)胞的體積，以及維持低Na+高K+的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持細(xì)胞的靜息電位。Na+-K+-ATP酶活力是一項(xiàng)能反映機(jī)體早期生理功能衰退的極為敏感的指標(biāo)[14]，有研究證實(shí)在創(chuàng)傷性腦水腫的大鼠中其酶活力明顯下降[15]。Ca2+-ATP酶又稱(chēng)Ca2+-Mg2+-ATP酶（即鈣泵）是存于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上的一種蛋白酶，在人體內(nèi)起著非常重要的作用，是反映各細(xì)胞能量代謝能力及功能有無(wú)障礙的重要指標(biāo)。鈣泵的失調(diào)與許多疾病密切相關(guān)。Ca2+泵是一種十分重要的信號(hào)物質(zhì)，廣泛地分布在動(dòng)、植物細(xì)胞質(zhì)樣膜，線粒體內(nèi)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣囊膜上，對(duì)細(xì)胞代謝，肌肉運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，凋亡等主要生理病理功能有重要調(diào)節(jié)功能。重度失血性休克后腦組織缺血缺氧可導(dǎo)致Na+- K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力降低，在辛醇及低溫處理后二者活力升高。GJ允許ATP等小分子通過(guò)，Eltzschig等[16]發(fā)現(xiàn)在Cx43小鼠中性粒細(xì)胞被激活后，ATP的釋放較野生型中性粒細(xì)胞減少15%。Turner等[17]發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞缺氧及復(fù)氧過(guò)程中，Cx43存在可逆性的磷酸化與去磷酸化，可以影響細(xì)胞內(nèi)ATP水平，另一方面，剝奪細(xì)胞內(nèi)ATP可導(dǎo)致GJ激活，并加劇細(xì)胞壞死[18-19]。在重度失血性休克后腦細(xì)胞一方面ATP消耗增加，另一方面細(xì)胞內(nèi)ATP外流。辛醇/低溫阻斷縫隙連接后，缺氧細(xì)胞內(nèi)ATP外流阻斷，Na+-K+-ATP酶及Ca2+- ATP酶活性相對(duì)提高，將胞內(nèi)多余的Na+泵出胞外，細(xì)胞水腫減輕。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，盡管縫隙連接抑制劑和低溫有腦保護(hù)作用，都可上調(diào)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力，二者作用相似，聯(lián)合應(yīng)用亦未見(jiàn)協(xié)同作用，具體機(jī)制仍不清楚。

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