微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的代謝工程研究進(jìn)展

董迅衍， 王小元*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的代謝工程研究進(jìn)展

董迅衍1，2， 王小元*1，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

L-蘇氨酸作為一種必需氨基酸被廣泛用于食品、飼料、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)。目前L-蘇氨酸主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。代謝工程技術(shù)的應(yīng)用為菌種選育開辟了有效途徑，使在現(xiàn)有高產(chǎn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高氨基酸的產(chǎn)量成為可能。作者對兩大氨基酸生產(chǎn)菌——大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的L-蘇氨酸生物合成相關(guān)途徑、代謝調(diào)控機(jī)理以及運(yùn)用代謝工程技術(shù)提高L-蘇氨酸產(chǎn)量所取得的成果進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。

L-蘇氨酸；谷氨酸棒桿菌；大腸桿菌；代謝工程；發(fā)酵

氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)規(guī)模在過去10年中整整擴(kuò)大了一倍，目前達(dá)到了500萬t/年。大腸肝菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）及其亞種是發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的主力軍。其中，由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)、年產(chǎn)量排名前三的分別是L-谷氨酸（220萬t）、L-賴氨酸（195萬t）和L-蘇氨酸（33萬t）[1-2]。如圖1所示，由1993年的0.4萬t/年到2014年的330萬t/年，L-蘇氨酸的世界年產(chǎn)量提高了82倍。目前，全球L-蘇氨酸以每年超20%的增長率高速增長，這主要是因?yàn)長-蘇氨酸在飼料添加劑行業(yè)的需求量增長迅速。近年來的研究表明，作為8種必需氨基酸之一，L-蘇氨酸是豬飼料的第二限制氨基酸和家禽飼料的第三限制氨基酸。以添加了蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但降低了飼喂成本，還有利于家禽吸收，可促進(jìn)家禽的生長[3]。除了可以緩解天然蛋白質(zhì)的匱乏，家禽飼料營養(yǎng)配比合理還可以有效減少動(dòng)物氨的排放，從而減少環(huán)境污染，有利于社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。此外，L-蘇氨酸在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的用量也呈長期穩(wěn)定增長趨勢。在食品領(lǐng)域，L-蘇氨酸是各類氨基酸保健飲品的配方成分，也是重要的食品強(qiáng)化劑，可以與其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，還可以與葡萄糖共熱產(chǎn)生焦香味。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-蘇氨酸有促進(jìn)人體生長發(fā)育、促進(jìn)骨髓T淋巴細(xì)胞前體分化發(fā)育成為成熟T淋巴細(xì)胞和抗脂肪肝的藥用療效，因此在臨床方面有著廣泛的應(yīng)用。此外，L-蘇氨酸還是制造高效低過敏的抗生素單酰胺菌素等藥物的中間體。在化妝品領(lǐng)域，L-蘇氨酸的分子具有羥基結(jié)構(gòu)，因此可用作保濕劑[4]。

圖1 L-蘇氨酸世界年產(chǎn)量Fig.1 L-threonine world annual yield

1 L-蘇氨酸的生物合成途徑

L-蘇氨酸的生物合成以TCA循環(huán)中間代謝物草酰乙酸為前體。底物葡萄糖代謝經(jīng)過糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)及C3-C4回補(bǔ)途徑等中心代謝途徑，由草酰乙酸經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化生成L-天冬氨酸，即進(jìn)入L-蘇氨酸合成途徑，見圖2。此轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中，由L-谷氨酸提供氨基基團(tuán)。其中，C3-C4回補(bǔ)途徑是指在磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-草酰乙酸節(jié)點(diǎn)處發(fā)生的C3化合物的羧化反應(yīng)以及C4化合物的脫羧反應(yīng)。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PC）分別催化的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的羧化反應(yīng)，直接生成草酰乙酸；而由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化的草酰乙酸和蘋果酸的脫羧反應(yīng)，則直接消耗掉草酰乙酸。在E.coli和C.glutamicum中，PEPC、PEPCK和PC均分別由ppc、pck和pyc基因編碼[5]。

由L-天冬氨酸起，L-蘇氨酸途徑包含5步酶催化反應(yīng)：1）天冬氨酸激酶（AK），催化L-天冬氨酸γ-羧基磷酸化生成磷酰天冬氨酸；2）天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）以NADPH為還原力，催化磷酰天冬氨酸還原生成天冬氨酸半醛；3）高絲氨酸脫氫酶（HD）以NADPH為還原力，催化天冬氨酸半醛脫羧生成L-高絲氨酸；4）高絲氨酸激酶（HK），催化L-高絲氨酸磷酸化，生成磷酰高絲氨酸；5）蘇氨酸合酶（TS）催化磷酰高絲氨酸脫磷酸基團(tuán)，生成L-蘇氨酸。在E.coli中，AK有三種同工酶，分別為AKI、AKII和AKIII[14-15]；HD有兩種同工酶，分別為HDI和HDII。AKI和HDI組成雙功能酶，由thrA基因編碼；AKII和HDII組成雙功能酶，由metL基因編碼[8]；單功能的AKIII則由lysC基因編碼[17]。在3種EcAK中，EcAKI的蛋白質(zhì)豐度最高，而EcAKII的蛋白質(zhì)豐度最低。EcASD、EcHK和EcTS則均為單一酶，分別由 asd、thrB和 thrC基因編碼[18-19]。在C.glutamicum中，上述5種酶均不存在同工酶：AK由lysC基因編碼[10]；ASD由asd基因編碼[9]；HD由hom基因編碼[10]；HK由thrB基因編碼[10]；TS由thrC基因編碼[10]。L-蘇氨酸由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的限速步驟。在E.coli中，有3種L-蘇氨酸輸出蛋白質(zhì)：RhtA、RhtB和RhtC，分別由rhtA、rhtB和rhtC基因編碼[11-12]。在C. glutamicum中，目前僅發(fā)現(xiàn)1種L-蘇氨酸輸出蛋白ThrE，由thrE基因編碼[26-27]。

圖2 L-蘇氨酸生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of L-threonine

對于L-蘇氨酸生物合成而言，碳流的浪費(fèi)主要是由以下4條途徑造成：1）其合成途徑上的L-賴氨酸旁支路途徑；2）L-甲硫氨酸旁支路途徑；3）其合成后在胞內(nèi)被降解為甘氨酸；4）用于合成L-異亮氨酸。L-賴氨酸旁支路途徑在E.coli和C.glutamicum中都是由dapA基因編碼的二氫吡啶二羧酸合酶（DDPS）催化起始[15]。L-甲硫氨酸旁支路途徑在E.coli中則由metA基因編碼的琥珀?；D(zhuǎn)移酶（SCT）催化起始[16]；在 C.glutamicum中則由metX基因編碼的乙?；D(zhuǎn)移酶（ACT）催化起始。需要特別說明的是，在C.glutamicum中，分別存在2條L-賴氨酸合成途徑（split pathway，在二氫吡啶二羧酸節(jié)點(diǎn)處分裂成兩條途徑）[17]和2條L-甲硫氨酸合成途徑 （在氧乙酰高絲氨酸節(jié)點(diǎn)處分裂成兩條途徑）[18]。L-蘇氨酸降解成甘氨酸的途徑L-蘇氨酸降解生成甘氨酸的途徑在E.coli中有兩條，分別由tdh基因[19]編碼的蘇氨酸脫氫酶（TDH）和ltaE基因[20]編碼的蘇氨酸醛縮酶（TA）催化起始；而在C.glutamicum中目前只發(fā)現(xiàn)了一條，是由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）催化一步生成。

2 L-蘇氨酸生物合成調(diào)控機(jī)制

在E.coli中，L-蘇氨酸合成途徑上所有基因的轉(zhuǎn)錄都受終端產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控：thrA、thrB和thrC基因的轉(zhuǎn)錄受L-蘇氨酸和L-異亮氨酸協(xié)同反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控；metL基因的轉(zhuǎn)錄受L-甲硫氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控；lysC基因的轉(zhuǎn)錄受L-賴氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控；asd基因的轉(zhuǎn)錄受L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸共價(jià)反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控[21]。其中，thrA、thrB和thrC基因在染色體上組成thrABC操縱子[22]。在thrA基因可讀編碼框上游存在一段178 bp長度的前導(dǎo)序列thrL。L-蘇氨酸和L-異亮氨酸對這三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控由thrL介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制實(shí)現(xiàn)。在thrA基因上游37個(gè)堿基位點(diǎn)處插入一個(gè)G堿基可解除該轉(zhuǎn)錄衰減調(diào)控[23-24]。L-賴氨酸對lysC基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控則由其上游的前導(dǎo)序列介導(dǎo)的翻譯衰減機(jī)制實(shí)現(xiàn)[25]。而在酶活水平上，EcAKI-EcHDI、EcAKIII、EcHK受終端產(chǎn)物反饋抑制調(diào)節(jié)。EcAKI的活性受L-蘇氨酸不完全反饋抑制調(diào)節(jié)。L-蘇氨酸既可通過改變EcAKI的構(gòu)象，又可通過與底物L(fēng)-天冬氨酸競爭結(jié)合位點(diǎn)抑制其活性。EcHDI的活性同樣也受L-蘇氨酸不完全反饋抑制調(diào)節(jié)，但抑制機(jī)制為非競爭性[6]。L-賴氨酸可以通過改變EcAKIII的構(gòu)象而完全抑制其活性[26-27]。定點(diǎn)突變T344M、S345L及T352I均可部分解除EcAKIII受L-賴氨酸的抑制[27]。EcHK受反饋抑制情況較為復(fù)雜。它不但受終端產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的競爭性反饋抑制及L-賴氨酸的非競爭性反饋抑制，還受底物L(fēng)-高絲氨酸（濃度高于1 mmol/L時(shí)）和ATP（濃度高于3 mmol/L時(shí)）的抑制調(diào)節(jié)[6]。

在C.glutamicum中，L-蘇氨酸合成途徑上只有hom和thrB兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄受L-甲硫氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)。這兩個(gè)基因在染色體上按5’hom-thrB 3’方向組成一個(gè)操縱子。該操縱子5’端上游有一長串反向重復(fù)序列，預(yù)示存在衰減子作用，與hom和thrB的轉(zhuǎn)錄受L-甲硫氨酸反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)有關(guān)[28]。而在酶活水平上，CgAK、CgHD和CgHK三個(gè)酶的活性受終端產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)。CgAK是變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，其活性受終產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制調(diào)節(jié)。多個(gè)CgAK編碼基因上的突變位點(diǎn)均可完全解除該反饋抑制[29]。CgHD的活性受L-蘇氨酸反饋抑制調(diào)節(jié)。L-蘇氨酸的結(jié)合單元位于CgHD的C-端[30]。2 mmol/L L-蘇氨酸即可完全抑制野生型CgHD的活性。Dieter等通過對hom基因進(jìn)行G1133A單堿基突變得到的CgHDG378E突變體在25 mmol/L L-蘇氨酸存在時(shí)完全不受抑制；且半抑制L-蘇氨酸濃度高達(dá)100 mmol/L[31]。CgHK的活性略受L-蘇氨酸反饋抑制調(diào)節(jié)。酶學(xué)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-蘇氨酸對此酶的抑制作用系競爭性抑制：隨著其底物L(fēng)-高絲氨酸濃度提高，受抑制程度降低。野生型CgHK的半抑制L-蘇氨酸濃度為25 mmol/L[32]。基于競爭性抑制機(jī)制——底物與抑制物結(jié)合位點(diǎn)為同一個(gè)，抑制的解除不能通過改變酶蛋白結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，而只能依靠提高底物L(fēng)-高絲氨酸的濃度來緩解[33]。

3 L-蘇氨酸生產(chǎn)菌代謝工程研究狀況

L-蘇氨酸生產(chǎn)菌構(gòu)建過程中采用的代謝工程策略主要有：1）高效表達(dá)合成途徑關(guān)鍵酶基因，以提高合成途徑碳流量；2）削弱競爭支路的碳流量，以聚攏碳流，同時(shí)減少副產(chǎn)物的合成；3）削弱L-蘇氨酸的胞內(nèi)降解；4）加快L-蘇氨酸向胞外分泌，以減少L-蘇氨酸的胞內(nèi)降解及避免胞內(nèi)產(chǎn)物濃度積累過高而抑制關(guān)鍵酶的催化活性。

3.1 加強(qiáng)L-蘇氨酸合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)

高效表達(dá)合成途徑關(guān)鍵酶的編碼基因，尤其是抗反饋抑制的突變體基因，可以有效地提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。在E.coli中，高效表達(dá)thrABC操縱子是最常用的策略。Livshits等[11]在L-蘇氨酸生產(chǎn)菌E.coli MG442中通過用質(zhì)粒載體表達(dá)帶有突變位點(diǎn)的thrA442BC操縱子，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由8 g/L提高到18.4 g/L。張雪等在野生型菌株E.coli W3110中通過用高拷貝質(zhì)粒載體pMD19-T表達(dá)thrA345BC操縱子實(shí)現(xiàn)了 9.2 g/L L-蘇氨酸胞外積累[34]。在C.glutamicum中，高效表達(dá)lysC，hom和thrB這三個(gè)關(guān)鍵基因被證實(shí)對提高L-蘇氨酸合成有利。Eikmanns等[35]在 C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中通過采用質(zhì)粒載體高效表達(dá)homr-thrB操縱子，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由6.3 mmol/L提高至14.1 mmol/L。Colon等[32]通過在 L-賴氨酸生產(chǎn)菌C.lactofermentum ATCC21799（AECr）中用質(zhì)粒載體組成型高效表達(dá)homr，同時(shí)誘導(dǎo)型高效表達(dá)thrB，實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸胞外積累達(dá)11.8 g/L，而原產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸的產(chǎn)量由22.0 g/L降至0.8 g/L。

3.2 加強(qiáng)L-蘇氨酸向胞外分泌

當(dāng)L-蘇氨酸積累達(dá)到一定濃度時(shí)，其由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)成為生產(chǎn)的限速步驟。高濃度的胞內(nèi)L-蘇氨酸積累會(huì)抑制合成途徑關(guān)鍵酶的催化活性，增加降解代謝產(chǎn)物的合成，甚至抑制細(xì)胞生長。因此，加強(qiáng)L-蘇氨酸向胞外分泌是非常有效的代謝工程策略。Kruse等[12]在E.coli MG422中通過用質(zhì)粒載體分別表達(dá)內(nèi)源的rhtB、rhtC和來自C.glutamicum的thrE，將L-蘇氨酸產(chǎn)量分別提高了1.4倍、2倍和2.9倍。Livshits等[11]在E.coli MG422（pAYC32-thrArBC）菌株中通過對染色體上rhtA基因起始密碼子上游1個(gè)堿基進(jìn)行G→A替換突變以加強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由18.4 g/L提高到36.3 g/L。Simic等[36]通過在L-蘇氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum DR-17中用質(zhì)粒載體表達(dá)內(nèi)源的thrE基因，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由5.8 g/L提高到了8.1 g/L。Diesveld等[37]通過在C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中用質(zhì)粒載體異源表達(dá)來自E.coli的rhtC基因，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由0.9 g/L提高到了3.7 g/L，并將副產(chǎn)物甘氨酸的產(chǎn)量由1.1 g/L降低至0.15 g/L。

3.3 削弱L-蘇氨酸在胞內(nèi)的消耗

L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的過程中主要產(chǎn)生的副產(chǎn)物有L-甘氨酸、L-異亮氨酸和L-賴氨酸，其中前兩者為L-蘇氨酸胞內(nèi)降解代謝產(chǎn)物。由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和降解代謝途徑之間相互競爭共同底物L(fēng)-蘇氨酸，因此，減少胞內(nèi)消耗損失可提高L-蘇氨酸產(chǎn)量，還可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而降低下游提取成本。Lee等[38]在一株E.coli L-蘇氨酸生產(chǎn)菌中通過對染色體上ilvA基因進(jìn)行C290T突變以降低其編碼的TD的催化活性，并通過敲除染色體上的tdh基因以減少 L-蘇氨酸胞內(nèi)消耗。Diesveld等[24]在 C. glutamicum DM1800-T中通過對染色體上ilvA基因進(jìn)行定點(diǎn)突變使其編碼的TD失活，將L-蘇氨酸產(chǎn)量由2.5 g/L提高到4 g/L。

3.4 系統(tǒng)代謝工程

系統(tǒng)代謝工程技術(shù)的應(yīng)用給L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建帶來了突破性的進(jìn)展。通過系統(tǒng)代謝工程改造，研究人員成功構(gòu)建出了幾株E.coli L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株。最典型的案例是由Lee等[72]從野生型的E.coli W3110構(gòu)建出高產(chǎn) L-蘇氨酸的 TH28C（pBRThrABCR3）。他們首先將E.coli W3110染色體上的lacI基因敲除，使一些強(qiáng)啟動(dòng)子如Ptac和Ptrc可以進(jìn)行組成型轉(zhuǎn)錄。其次，通過三步改造來加強(qiáng)L-蘇氨酸合成途徑：1）對染色體上thrA和lysC基因分別進(jìn)行C1034T和C1055T定點(diǎn)突變，以解除AKI和 AKIII的反饋抑制調(diào)節(jié)；2）將染色體上thrABC操縱子的啟動(dòng)子替換成Ptac啟動(dòng)子，以解除反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)；3）將解反饋抑制的thrABC操縱子放到質(zhì)粒載體上過表達(dá)。接著，通過削弱競爭支路途徑及L-蘇氨酸降解代謝途徑來減少副產(chǎn)物并聚攏碳流：1）敲除染色體上的lysA基因（編碼L-賴氨酸合成途徑上最后一個(gè)酶）以阻斷L-賴氨酸的合成；2）敲除染色體上的metX基因以阻斷L-甲硫氨酸支路；3）敲除染色體上的tdh基因減少L-蘇氨酸向甘氨酸的轉(zhuǎn)化；4）通過對染色體上ilvA基因進(jìn)行C290T突變以降低TD的催化活性，從而減少L-蘇氨酸向L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化。隨后，通過加強(qiáng)前體草酰乙酸的供應(yīng)來提高L-蘇氨酸產(chǎn)量：1）將染色體上ppc基因的啟動(dòng)子替換成Ptrc啟動(dòng)子以加強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄；2）敲除染色體上編碼異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合酶的阻遏蛋白的iclR基因，以加強(qiáng)乙醛酸循環(huán)。再者，通過敲除L-蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因tdcC以及用質(zhì)粒載體過表達(dá)rhtA、rhtB和rhtC基因來加強(qiáng)L-蘇氨酸的分泌。最后，通過將染色體上乙酰輔酶A合酶編碼基因acs的啟動(dòng)子替換成Ptrc啟動(dòng)子以加強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，從而減少乙酸的積累。最終構(gòu)建得到的菌株TH28C（pBRThrABCR3）在罐上分批補(bǔ)料發(fā)酵50 h可生產(chǎn)82.4 g/L L-蘇氨酸。L-蘇氨酸-葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到39.3%。并且不積累L-乳酸，僅積累2.35 g/L乙酸，見圖3。

另一個(gè)典型案例是Lee等[39]從基因組精簡的E.coli MDS42出發(fā)構(gòu)建出一株不含游離質(zhì)粒的L-蘇氨酸高產(chǎn)菌MDS-205。在MDS-205中，染色體上thrABC操縱子的啟動(dòng)子被Ptac啟動(dòng)子替換，而lacI、tdh基因被敲除；L-蘇氨酸吸收蛋白基因tdcC和sstT被突變型L-蘇氨酸分泌蛋白基因rhtA23所替換。MDS-205在罐上發(fā)酵30 h可生產(chǎn)40.1 g/L L-蘇氨酸，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到39.3%。該菌最大的特點(diǎn)是細(xì)胞生長強(qiáng)勁，尤其適合高密度細(xì)胞培養(yǎng)，可縮短發(fā)酵周期。

4 展望

隨著市場需求量的不斷加大，L-蘇氨酸產(chǎn)業(yè)優(yōu)化需要進(jìn)一步提高產(chǎn)量、降低成本。我國L-蘇氨酸生產(chǎn)起步較晚，21世紀(jì)初主要依靠進(jìn)口，近幾年雖然自主生產(chǎn)發(fā)展迅速，但是，我國飼料產(chǎn)業(yè)對L-蘇氨酸的需求量進(jìn)一步加大。隨著人們保健意識(shí)的加強(qiáng)以及L-蘇氨酸作為藥物中間體等新價(jià)值的開發(fā)，L-蘇氨酸在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用越來越廣。因此，構(gòu)建L-蘇氨酸高產(chǎn)菌對社會(huì)發(fā)展及國民經(jīng)濟(jì)具有重要意義。目前工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸普遍采用E. coli菌株。其優(yōu)點(diǎn)是生長迅速，發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高。而在工業(yè)上產(chǎn)量排名前三（發(fā)酵法生產(chǎn)）的氨基酸中，除了L-蘇氨酸，L-谷氨酸和L-賴氨酸均采用C. glutamicum發(fā)酵生產(chǎn)。C.glutamicum是非致病的格蘭氏陽性菌，符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，不生芽孢，并且生長也較快，被普遍認(rèn)為是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的理想菌種。然而C.glutamicum的L-蘇氨酸合成能力在過去20年中始終未獲得突破性的提高——L-蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都遠(yuǎn)低于E.coli。作者所在團(tuán)隊(duì)從開發(fā)適用于C.glutamicum的分子操作工具（如基因表達(dá)和敲除載體）入手[40-43]，致力于C.glutamicum的氨基酸代謝工程研究[44-47]，對C.glutamicum的L-蘇氨酸合成能力仍在挖掘中[48-50]。目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化率僅為40%~50%，與理論最大轉(zhuǎn)化率81%相比[38]，還有很大提升空間。運(yùn)用代謝工程技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)菌相對于傳統(tǒng)育種的優(yōu)點(diǎn)是可以大大縮短菌種選育的周期。此外，由于構(gòu)建出的菌株遺傳背景明確，后期發(fā)酵優(yōu)化過程將可相應(yīng)得到簡化。

圖3 L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的代謝工程優(yōu)化Fig.3 Metabolic engineering of L-threonine production strains

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Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production

DONG Xunyan1，2， WANG Xiaoyuan*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

As an essential amino acid for mammals，L-threonine has a wide application in the food，feeds，pharmaceutical and cosmetics industries.To date，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed.

L-threonine，Corynebacterium glutamicum，Escherichia coli，metabolic engineering，fermentation

Q 933

A

1673—1689（2016）12—1233—08

2016-07-08

國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB725202）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NSFC31370131）；江南大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目（JUDCF11025）。作者簡介：董迅衍（1986—），女，江蘇無錫人，發(fā)酵工程博士研究生，主要從事氨基酸生產(chǎn)菌株代謝工程方面的研究。Email：xunyandong@gmail.com

*通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物代謝工程方面的研究。E-mail：xwang@jiangnan.edu.cn