中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)鑒定

曹 雪， 陳占寬， 白仲虎， 楊艷坤*， 陳繼峰

（1．鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；3.河南天茂生物有限公司，河南 鄭州450001）

中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)鑒定

曹 雪1，2， 陳占寬3， 白仲虎2， 楊艷坤*2， 陳繼峰1

（1．鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；3.河南天茂生物有限公司，河南 鄭州450001）

有機(jī)磷污染是食品安全的重大隱患，乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase，AChE）可用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。中華蜜蜂是我國(guó)獨(dú)有的蜜蜂當(dāng)家品種，蜜蜂對(duì)農(nóng)藥的敏感性很高，中華蜜蜂來(lái)源的乙酰膽堿酯酶基因尚未被克隆并應(yīng)用于食品安全監(jiān)測(cè)。以中華蜜蜂頭部組織總RNA為模板，經(jīng)RACE方法獲得了AChE基因cDNA全序列，全長(zhǎng)約1.8 kb。構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC3.5K-AChE，將目的基因表達(dá)盒整合入畢赤酵母GS115的基因組中獲得重組菌株，0.5%甲醇誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)AChE蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、酶活性分析表明，中華蜜蜂AChE基因首次克隆成功并首次在畢赤酵母中獲得成功表達(dá)，篩選出一株酶活性較高的菌株，純化的重組乙酰膽堿酯酶其活性為10 568 U/mg，可以用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

食品安全；有機(jī)磷檢測(cè)；中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶；巴斯德畢赤酵母；克隆表達(dá)

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平逐漸提高，越來(lái)越多的消費(fèi)者對(duì)食品的安全、營(yíng)養(yǎng)等方面的要求的不斷提高。重視食品安全，已經(jīng)成為衡量人民生活質(zhì)量、社會(huì)管理水平和國(guó)家法制建設(shè)的一個(gè)重要方面[1]。為食品安全定義一個(gè)切實(shí)有效的標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)前食品安全工作的重中之重，而食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)是判斷食品安全與否的一個(gè)重要指標(biāo)。

農(nóng)藥能夠防治病蟲(chóng)害、去除雜草、控制人畜傳染病、提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，其發(fā)明和使用大大提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量，但農(nóng)藥的大量及不合理使用使食品中的農(nóng)藥殘留對(duì)人類(lèi)健康造成的負(fù)面影響也日益顯露出來(lái)[2-4]。農(nóng)藥殘留對(duì)食品安全構(gòu)成的威脅就是農(nóng)殘超標(biāo)[5]。近年來(lái)，由于農(nóng)產(chǎn)品中高毒農(nóng)藥殘量超標(biāo)造成的中毒事故屢有發(fā)生[6]，研究證實(shí)，農(nóng)藥對(duì)人體有致畸致癌的作用，因此做好農(nóng)藥殘留檢測(cè)的工作就成了重中之重。

快速檢測(cè)技術(shù)是目前的農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要方法之一，原理是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥能抑制昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲(chóng)中毒致死。這一毒理學(xué)原理也用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中[7]。近年來(lái)，已有公司研制出農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀器和試紙，但這些產(chǎn)品使用的酶原料主要來(lái)自生物體的蛋白質(zhì)提取液，存在很多雜蛋白質(zhì)，很大程度上影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性且酶原料的量受限于生物體的數(shù)量，這些問(wèn)題極大地限制了這些產(chǎn)品的大量推廣應(yīng)用。

中華蜜蜂是我國(guó)獨(dú)有的蜜蜂當(dāng)家品種，近年來(lái)因農(nóng)藥中毒導(dǎo)致蜜蜂死亡的現(xiàn)象遍及全球，中華蜜蜂對(duì)農(nóng)藥的靈敏度很強(qiáng)[8]。自20世紀(jì)以來(lái)我國(guó)雖已開(kāi)展了中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶對(duì)農(nóng)藥敏感度的研究工作[8-9]，但至今未見(jiàn)關(guān)于中華蜜蜂AChE用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道，也未發(fā)現(xiàn)任何有關(guān)于利用基因工程技術(shù)在外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)中華蜜蜂AChE的文獻(xiàn)與專(zhuān)利的報(bào)道。當(dāng)前雖已開(kāi)展了多種生物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶的研究[10-13]，但其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用并不是最優(yōu)的，有必要研究出一種更有效更靈敏的酶源。

作者根據(jù)中華蜜蜂的獨(dú)有特征鑒定得到中華蜜蜂。并在研究前期通過(guò)RACE方法獲得了中華蜜蜂AChE基因的cDNA全序列，與GeneBank中查到的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶部分基因序列片段同源對(duì)比相似性達(dá)到99%，與意大利蜜蜂的相似性達(dá)到了94%。取中華蜜蜂頭部組織總RNA經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲得AChE基因cDNA全序列并構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K-AChE，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115進(jìn)行表達(dá)，探索分析重組AChE的性質(zhì)，為其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

電擊杯與電轉(zhuǎn)儀：BIO-RAD公司；PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)：HITCHI；電子分析天平：梅特勒-托利多儀器；凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD；蛋白質(zhì)電泳儀：北京六一儀器廠(chǎng)；G560E型振蕩儀：Scientific Industries。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

1.2.1 主 要 試 劑 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 （Reverse Transcriptase），PCR高保真酶 （LA Taq）：TaKaRa公司；SnaBⅠ、NotⅠ和SalⅠ：Thermo公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：Axygen公司；山梨糖醇（sorbitol）、遺傳霉素（G418）：北京索來(lái)寶公司；3-吲哚乙酰酯（3-indoxyl acetate）：TCI公司；海貍磁珠純化試劑盒：海貍生物科技有限公司；ZYD-NYM-500型農(nóng)藥檢測(cè)試劑盒：北京智云達(dá)科技有限公司。

1.2.2 主要培養(yǎng)基的配制

1）LB培養(yǎng)基（g/dL）：酵母膏0.5，胰蛋白胨1，NaCl 1；調(diào)節(jié)pH至7.0。

2）YPD培養(yǎng)基（g/dL）：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。

3）MD培養(yǎng)基（g/dL）：酵母無(wú)氨基酸氮源（YNB）1.34，葡萄糖2，生物素4×10-5。

4）BMGY液體培養(yǎng)基（g/dL）：酵母膏1，蛋白胨2，YNB 1.34，生物素4×10-5，1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）1，甘油1。

5）BMMY液體培養(yǎng)基 （g/dL）：將BMGY中的1%甘油換成0.5%甲醇。

6）固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5 g/dL瓊脂。

1.2.3 主要試劑的配制

1）100 mg/mL Amp：稱(chēng)取0.5 g氨芐青霉素加入10 mL蒸餾水溶解，過(guò)濾除菌分裝后存于-20℃。

2）50 mg/mL G418：稱(chēng)取1 g G418溶于20 mL蒸餾水中，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌分裝（1 mL）后存于-20℃。

3）0.1 mol/L 3-吲哚乙酰酯：稱(chēng)取17.519 mg的3-吲哚乙酰酯溶解于1 mL的二甲基亞砜中，避光室溫保存。

4）磷酸鹽緩沖液：按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制。

1.3 宿主菌和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；pMD20-T Vector：TaKaRa公司，巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）GS115及其胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K：作者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，參考實(shí)驗(yàn)前期獲得的中華蜜蜂AChE基因序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物。用于AChE cDNA RT-PCR的一對(duì)引物ACF和ACR，在ACF的5’端引入SnaBⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，在ACR的5’端引入NotⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)、6×His標(biāo)簽和終止密碼子TAA。乙醇氧化酶基因通用引物AOX5P和AOX3P是針對(duì)pPIC3.5K載體上的AOX基因而設(shè)計(jì)的引物。對(duì)于重組酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定設(shè)計(jì)了重組子的特異性引物OACF/AOX3P，引物ACF/ ACR與AOX5P/AOX3P也可用于重組子的鑒定。所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 RT-PCR與克隆基因的序列分析

提取中華蜜蜂 （AC）腦部組織Total RNA，以Total RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出AChE cDNA全長(zhǎng)，使用特異性引物ACF/ACR擴(kuò)增出目的片段，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接到 pMD20-T Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含100 ng/mL Amp的LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。所涉及的PCR擴(kuò)增、膠回收、連接轉(zhuǎn)化及酶切方法均為分子克隆常規(guī)方法。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定

將測(cè)序正確的AChE基因克隆到pPIC3.5K載體上，利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將重組表達(dá)盒整合入酵母基因組中，涂布于MD平板培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。根據(jù)重組子在MD平板上的生長(zhǎng)狀況及其遺傳霉素（G418）抗性初步篩選菌株，使用引物ACF和AOX3P通過(guò)菌落PCR反應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌株。

1.7 搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

培養(yǎng)基裝瓶體積分?jǐn)?shù)10%，30℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)。先用BMGY培養(yǎng)基種培養(yǎng)至OD600為4，離心收集菌體，用兩倍體積的BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的三角瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)144 h，每24小時(shí)添加甲醇，保持終濃度為0.5%。為確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間，在誘導(dǎo)后每24小時(shí)取樣500 μL，凍存于-70℃冰箱備用。

1.8 重組AChE的檢測(cè)

1.8.1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平測(cè)定 離心收集菌體，用預(yù)冷的pH 7.5的50 mmol/L Tris HCl（含2 mmol/L EDTA）緩沖液在振蕩儀作用下破碎細(xì)胞，離心，收集上清液，上清液即為胞內(nèi)總蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠4 g/dL，分離膠12 g/dL），使用考馬斯亮藍(lán)R250染色，分析目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定 利用Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]測(cè)定胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。首先在96孔板中按1∶5比例加入不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）與考馬斯亮藍(lán)液，混合均勻后反應(yīng)15 min，測(cè)A595，制定出蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，接著測(cè)定樣品與考馬斯亮藍(lán)混合反應(yīng)后的A595值，根據(jù)其A595值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.8.3 酶活性檢測(cè) 以同時(shí)誘導(dǎo)過(guò)的轉(zhuǎn)化空載體的重組菌作為對(duì)照，利用微量羥胺比色法[15]在96孔板上對(duì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)進(jìn)行顯色反應(yīng)。在96孔板上加入200 μL的蛋白質(zhì)樣品與4 μL、0.1 mol/L 3-吲哚乙酰酯混勻，室溫放置30 min，肉眼觀察顏色變化。在初步篩選出有活性的AChE的基礎(chǔ)上測(cè)定AChE的比酶活。

1.9 重組AChE的純化

誘導(dǎo)高活性的畢赤酵母重組菌株表達(dá)AChE 120 h后提取酵母胞內(nèi)總蛋白質(zhì)。按照海貍磁珠組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒用戶(hù)手冊(cè)純化蛋白質(zhì)，并對(duì)純化過(guò)程中收集到的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。實(shí)驗(yàn)中用于純化的緩沖溶液：

1）Buffer A（Binding Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑。

2）Buffer B（Washing Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，100 mmol/L咪唑。

3）Buffer C（Elution Buffer）：20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑。

1.10 純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶用于有機(jī)磷殘留的檢測(cè)

購(gòu)買(mǎi)的市售有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)試劑盒是采用Ellman法[16]測(cè)定AChE的活性。采用純化的乙酰膽堿酯酶替換試劑盒中的乙酰膽堿酯酶粗酶液，利用試劑盒中已有的顯色劑和底物，在96孔板上按比例加入磷酸緩沖液、酶液、顯色劑（105∶10∶10），混勻，37℃放置5 min，加入與顯色劑等體積的底物，立即置于酶標(biāo)儀中，測(cè)定405 nm波長(zhǎng)下前3分鐘吸光度的變化值（ΔOD/min）。同時(shí)測(cè)定試劑盒中酶液的活性。

采用有機(jī)磷農(nóng)藥氯吡硫磷作為抑制劑，利用上述方法測(cè)定405 nm波長(zhǎng)下前3分鐘吸光度的變化值，計(jì)算抑制率（Ri）。

酶活性的計(jì)算公式=（ΔOD/min）/（1.36×104L/（mol·cm）×0.61cm）×103。

抑制率的計(jì)算公式：Ri（%）=（ΔA0-ΔA）/ΔA0

其中，ΔA0為不加抑制劑的酶活性反應(yīng)吸光度變化值，ΔA為加入抑制劑的酶活性反應(yīng)吸光度變化值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AChE基因片段的克隆

采用特異性引物ACF/ACR，以中華蜜蜂頭部組織所提取的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)出1條約1.8 kb的條帶，與預(yù)期大小相一致，見(jiàn)圖1。

圖1 AChE cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification of cDNA of AChE

2.2 重組AChE酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆于pMD20-T上的AChE基因經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，用SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切并回收，與經(jīng)相同的酶雙酶切后的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)空載體pPIC3.5K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，得到的陽(yáng)性菌經(jīng)菌液PCR及雙酶切鑒定后，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-AChE。重組表達(dá)質(zhì)粒由蘇州金唯智科技公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的pPIC3.5KAChE相一致。整個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖2。

2.3 重組子的篩選鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切線(xiàn)性化后即可電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。pPIC3.5K為酵母胞內(nèi)表達(dá)載體，整個(gè)重組基因表達(dá)盒受上游的乙醇氧化酶（AOX1）啟動(dòng)子的調(diào)控表達(dá)，pPIC3.5K的Kan基因賦予大腸桿菌卡那基因抗性，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。以遺傳霉素基因（Kan）與組氨酸脫氫酶基因（His4）為篩選標(biāo)志，用SalⅠ酶切的線(xiàn)性化表達(dá)載體pPIC3.5K-AChE約10.8 kb的表達(dá)單位，在山梨糖醇的介導(dǎo)下，于電擊杯中以750 V/mm的電壓作用，穿透酵母細(xì)胞壁及核膜，與畢赤酵母GS115的基因組發(fā)生同源重組。采用不同方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定，利用MD平板進(jìn)行表型篩選。獲得45個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接著在含0.25 mg/mL G418的YPD平板上培養(yǎng)重組菌，利用pPIC3.5K-AChE基因上的特異性序列射擊類(lèi)引物OACF和AOX3P，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，由于該對(duì)引物只有含pPIC3.5K-AChE片段的載體才能擴(kuò)增出，避免了畢赤酵母GS115中的AOX1基因與非特異性片段的干擾，擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的片段，約1 740 bp，PCR結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.2 Construction of plasmid pPIC3.5K-AChE

圖3 利用特異性引物對(duì)酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.3 PCR analysis of Pichia integrants with specific primer

2.4 搖瓶培養(yǎng)初篩高表達(dá)菌株

在對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行多重鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)經(jīng)PCR鑒定出的菌株進(jìn)行小規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。由于蛋白質(zhì)表達(dá)量有限，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在57 000處有一條與預(yù)期目的蛋白質(zhì)大小一致的條帶（箭頭所指位置），但條帶并不是特別明顯，見(jiàn)圖4。作者所在實(shí)驗(yàn)室在設(shè)計(jì)AChE基因插入pPIC3.5K時(shí)，方案為將基因插入到不含ATG的pPIC3.5K中，利用基因自身攜帶的337 bp處的ATG作為起始密碼子，其最終翻譯形成的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為57 000。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)120 h后重組AChE的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant AChE after induced 120 h

用3-?；胚犸@色法檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)的相對(duì)活性，發(fā)現(xiàn)含重組菌株在搖瓶10%培養(yǎng)120 h時(shí)，表達(dá)的AChE比活性最高。而與市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的AChE相比，本實(shí)驗(yàn)的重組AChE的活性略高于購(gòu)買(mǎi)的AChE，顯色結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同重組酵母表達(dá)的AChE與3-酰基吲哚的顯色反應(yīng)Fig.5 Chromogenic reaction with 3-indoxyl acetate due to AChE of different strains

2.5 重組蛋白質(zhì)純化

挑取比活性最高的重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白質(zhì)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)兩次洗脫后，在57 000處有一條明顯的條帶，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖6 重組AChE純化過(guò)程的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant AChE at various stage of purification

2.6 純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶用于有機(jī)磷殘留的檢測(cè)

購(gòu)買(mǎi)的市場(chǎng)上現(xiàn)有銷(xiāo)售的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒是可直接用于農(nóng)藥檢測(cè)工作的，并未標(biāo)明酶的來(lái)源及活性水平。因此用農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒中的顯色劑與底物同時(shí)與純化的1.64×10-3mg中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶和1.64×10-3mg原試劑盒中的酶液反應(yīng)，在96孔板上同時(shí)測(cè)定兩種酶液引起的405 nm處吸光度的變化值，計(jì)算出酶的比活性，發(fā)現(xiàn)試劑盒的酶液比活性為9 948 U/mg，而純化的中華蜜蜂AChE比活性為10 568 U/mg。使用濃度為1×10-7mol/L的氯吡硫磷作為抑制劑測(cè)定酶受氯吡硫磷抑制的抑制率，發(fā)現(xiàn)1×10-7mol/L的氯吡硫磷對(duì)重組乙酰膽堿酯酶和試劑盒中乙酰膽堿酯酶的抑制率分別為79%和75%，可以看出氯吡硫磷對(duì)本實(shí)驗(yàn)純化得到的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶的抑制效果要高于市場(chǎng)上現(xiàn)有農(nóng)殘檢測(cè)試劑盒中的酶。

可見(jiàn)純化的中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶可以用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)工作，且靈敏度更高。

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)是世界第一養(yǎng)蜂大國(guó)，養(yǎng)蜂歷史悠久，約有2 000多年的歷史，目前我國(guó)飼養(yǎng)的蜜蜂主要是意大利蜜蜂、中華蜜蜂和東北黑蜂。其中，中蜂是我國(guó)獨(dú)有的蜜蜂當(dāng)家品種。蜜蜂作為一類(lèi)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，不僅為人類(lèi)提供了營(yíng)養(yǎng)豐富功能多樣的蜂產(chǎn)品，而且在農(nóng)業(yè)授粉促進(jìn)植物繁衍和維持生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用[17]。2006年中華蜜蜂被列入農(nóng)業(yè)部國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種，所以研究中蜂的生物學(xué)特性對(duì)我國(guó)本地蜂種的利用以及我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)的保護(hù)都有一定的促進(jìn)意義，目前國(guó)內(nèi)已開(kāi)展了很多關(guān)于中華蜜蜂的研究[18-19]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年使用農(nóng)藥制劑100萬(wàn)t左右[20]，而蜜蜂對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑極為敏感[21]。1990年至今，因農(nóng)藥中毒導(dǎo)致蜜蜂死亡、蜂群數(shù)量驟減的現(xiàn)象遍及北美、歐洲、亞洲等許多國(guó)家和地區(qū)，已成為全球普遍關(guān)注的環(huán)境污染與生物安全問(wèn)題[22]。研究中華蜜蜂AChE不僅可以用于食品安全中農(nóng)藥殘留檢測(cè)工作，還可作為判斷中蜂是否接觸殺蟲(chóng)劑的生化指標(biāo)，為我國(guó)的養(yǎng)蜂事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。

目前已有多種AChE利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)得到了很好的表達(dá)，例如，Ayman S.Hussein等[23]利用該系統(tǒng)表達(dá)了巴西日?qǐng)A線(xiàn)蟲(chóng)（Nippostrongylus brasiliensis）乙酰膽堿酯酶，Mendslson I等[24]利用該系統(tǒng)大量表達(dá)了電鰩（Torpedo californica）乙酰膽堿酯酶。在本研究中，作者構(gòu)建了一系列含有中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶基因的畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒，選擇了不同的線(xiàn)性化酶切位點(diǎn)，用于挑選出一組表達(dá)效果及酶活性水平較好的組合。在實(shí)驗(yàn)中，我們依據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，采用了多種方法來(lái)篩選和鑒定重組菌株，包括在MD和MM平板上進(jìn)行Mut+和Muts表型篩選、遺傳霉素抗性篩選、特異性引物的菌落PCR。本實(shí)驗(yàn)使用Ellman法來(lái)定義AChE的活力單位（1 U=1 μmolACh/min，即AChE在37℃、pH 7.2的條件下，每分鐘水解1 μmol的ACh定義為1個(gè)活力單位）。與市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒中的AChE相比，本實(shí)驗(yàn)得到的酶的比活力高于試劑盒中的AChE。而本實(shí)驗(yàn)中酵母表達(dá)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)由于培養(yǎng)條件、蛋白質(zhì)提取方法和酶活測(cè)定方法均未經(jīng)過(guò)優(yōu)化，得到的酶活并不一定是其最佳活力。因此要得到更高的活力以及更靈敏地應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測(cè)工作中，還需要進(jìn)一步優(yōu)化整個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)工藝。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃華飛.控制農(nóng)藥殘留加強(qiáng)食品安全[J].農(nóng)家之友，2008，12：75-76. HUANG Huafei.Control the pesticide residue to nhance food safety[J].Friends of the Farm，2008，12：75-76.（in Chinese）

[2]吳蘭團(tuán)，陳國(guó)代.果蔬殘余農(nóng)藥對(duì)人體危害芻議[J].南平師專(zhuān)學(xué)報(bào)，2001，20（4）：106-108. WU Lantuan，CHEN Guodai.A discussion of the harm to human health of pesticide residues in fruit and vegetable[J].Nanping Teachers Journal，2001，20（4）：106-108.（in Chinese）

[3]高桂枝，王圣巍，王俏，等.殘留農(nóng)藥污染危害及其防治[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，21（1）：52-53. GAO Guizhi，WANG Shengwei，WANG Qiao，et al.The pollution hazard and prevention of pesticide residues[J].Yan'an University Journal：Natural Sciences，2002，21（1）：52-53.（in Chinese）

[4]于徊萍，王彩梅.食品農(nóng)藥殘留分析的現(xiàn)代進(jìn)展[J].吉林糧食高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2001，16（1）：15-17. YU Huiping，WANG Caimei.Modern advances of pesticide residue analysis in food[J].Jilin Grain College Journal，2001，16（1）：15-17.（in Chinese）

[5]呂建華，安紅周，郭天松.農(nóng)藥殘留對(duì)我國(guó)食品安全的影響及相應(yīng)對(duì)策[J].食品科技，2006，11：16-20. LU Jianhua，AN Hongzhou，GUO Tiansong.The impact of pesticides on food safety and appropriate countermeasures[J].Food Science and Technology，2006，11：16-20.（in Chinese）

[6]伍小紅，李建科，惠偉.農(nóng)藥殘留對(duì)食品安全的影響及對(duì)策[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（6）：80-84. WU Xiaohong，LI Jianke，HUI Wei.The influence of pesticide residues on food safety and countermeasure[J].Food and Fermentation Industries，2005，31（6）：80-84.（in Chinese）

[7]高曉輝.蔬菜上農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)勢(shì)在必行[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2000，21（1）：16-17. GAO Xiaohui.Rapid detection of pesticide residues on vegetables is imperative to implement[J].Pesticide Science and Administration，2000，21（1）：16-17.（in Chinese）

[8]王瀛寰，張艷峰，張旭，等.五種農(nóng)藥對(duì)中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂的經(jīng)口毒性比較[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（4）：453-456. WANG Yinghuan，ZHANG Yanfeng，ZHANG Xu，et al.Oral toxicity comparison of five kind of pesticides to drones of Apiscerana cerana and Apis mellifera[J].Pesticide Science Journal，2012，14（4）：453-456.（in Chinese）

[9]張瑩，黃建，高希武.兩種蜜蜂頭部乙酰膽堿酯酶對(duì)殺蟲(chóng)藥劑敏感度比較[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7（3）：221-226. ZHANG Ying，HUANG Jian，GAO Xiwu.Sensitive comparison of acetylcholinesterase to insecticides in two bees head[J]. Pesticide Science Journal，2005，7（3）：221-226.（in Chinese）

[10]MA Xingyuan，TAN Jianhua，WEI Dongzhi，et al.High-level secretion and purification of recombinant acetylcholinesterase from human cerebral tissue in P.pastoris and identification by chromogenicreaction[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，72：316-322.

[11]TAN Furong，WANG Ligang，WANG Jinbin，et al.Enhanced pesticide sensitivity of novel housefly acetylcholinesterases：a new tool for the detection of residual pesticide contamination[J].Bioprocess Biosyst Eng，2011，34（3）：305-314.

[12]LI Jingquan，BA Qian，YIN Jun，et al.Surface display of recombinant Drosophila melanogaster acetylcholinesterase for detection of organic phosphorus and carbamate pesticides[J].PLoS One，2013，8（9）：e72986.

[13]SATO R，MATSUMOTO T，HIDAKA N，et al.Cloning and expression of carp acetylcholinesterase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J].Protein Expr Purif，2009，64（2）：205-312.

[14]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[15]VILLATTE F，BACHMAN T T，HUSSEIN A S，et al.Acetylcholinesterase assay for rapid expression screening in liquid and solid media[J].Bio Techniques，2001，30：81-86.

[16]ELLMAN G L，COURTNEY K D，ANDRES V，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J].Biochem Pharmacol，1961，7：88-95

[17]孔常興.蜜蜂及其作用[J].西藏科技，2010，8：15-19. KONG Changxing.The bees and their effect[J].Tibet Science and Technology，2010，8：15-19.（in Chinese）

[18]劉俊峰，劉亭亭，王歡，等.中華蜜蜂銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆-序列分析及表達(dá)特征[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（8）：1512-1519.LIU Junfeng，LIU Tingting，WANG Huan，et al.Cloning of Apiscerana cerana copper/zinc superoxide dismutase gene-sequence analysis and expression characteristics[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2012，24（8）：1512-1519.（in Chinese）

[19]倪翠俠，張林雅，李紅亮，等.中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白基因家族克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（8）：1706-1715. NI Cuixia，ZHANG Linya，LI Hongliang，et al.Molecular cloning and expression profiles analysis of chemosensory protein genes family in the Chinese honeybee（Apis cerana cerana）[J].Scientia Agricultura Sinica，2013，46（8）：1706-1715.（in Chinese）

[20]王獻(xiàn)忠.我國(guó)農(nóng)藥生產(chǎn)和使用現(xiàn)狀及其展望[J].科技信息（農(nóng)林論壇），2011，13：777-816. WANG Xianzhong.The present situation and outlook of pesticides’production and usage in China[J].Science and Technology Information（Agriculture，F(xiàn)orestry Forum），2011，13：777-816.（in Chinese）

[21]RAHMAN M F，SIDDIQUI M K，ANJUM F，et al.Acute toxicity and anti acetylcholinesterase potential of some biphenyl derivatives to non target species[J].Indian J Exp Biol，1989，27（2）：138-140.

[22]卜元卿，單正軍，周軍英.農(nóng)藥對(duì)蜜蜂生物毒性及安全性評(píng)價(jià)研究回顧[J].農(nóng)藥，2009，48（6）：399-401. BO Yuanqing，SHAN Zhengjun，ZHOU Junying.A reviewof pesticides biological toxicity and safety evaluation to bees[J]. Agrochemicals，2009，48（6）：399-401.（in Chinese）

[23]HUSSEIN A S，CHACON M R，SMITH A M，et al.Cloning，expression，and properties of a nonneuronal secreted acetylcholinesterase from theparasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis[J].J Biol Chem，1999，274：9312-9319.

[24]MENDELSON I，KRONMAN C，ARIEL N，et al.Bovine acetylcholinesterase：cloning，expression and characterization[J].J Biochem，1998，334：251-259.

Cloning，Expression and Identification of Apiscerana cerana Acetylcholinesterase Gene in Pichia pastoris

CAO Xue1，2， CHEN Zhankuan3， BAI Zhonghu2， YANG Yankun*2， CHEN Jifeng1
（1.School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Henan Tianmao Biological Co. Ltd.，Zhengzhou 450001，China）

Organophosphate （OP） pollution is amajorhidden dangerto food safety，acetylcholinesterase can be used to detect the residual OP pesticide.Apiscerana cerana is a unique kind of Apoidea which has not been found in other countries except for China，and it has a high sensitivity to pesticides.On the other hand，acetylcholinesterase gene from Apiscerana cerana has not been cloned and applied in food safety detection.In this study，using the total RNA from Apiscerana cerana head tissue as a template，a 1.8kb AChE cDNA sequence was obtained by RACE method，then the target sequence was cloned into the yeast expression vector pPIC3.5K.AChE was expressed and located in Pichia pastoris GS115 after induced with 0.5%methanol.The SDS-PAGE and activityanalysis showed that Apiscerana cerana AChE gene was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris for the first time.A strain with higher activity AChE was selected to express AChE，and its AChE activity was 10 568 U/mg，which could be used to detect the residual OP pesticide.

food safety，organophosphate detection，Apiscerana cerana acetylcholinesterase，Pichia pastoris，cloning and expression

Q 78

A

1673—1689（2016）12—1336—08

2015-01-30

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP51401A）。

*通信作者：楊艷坤（1978—）男，河北石家莊人，理學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物學(xué)、基因工程、分子遺傳、蛋白質(zhì)的分離純化及特性等方面的研究。E-mail：yangyankun@jiangnan.edu.cn