血管內皮生長因子-A siRNA對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響及機制

申建剛　張定國　朱惠明

(深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院消化內科，廣東　深圳　518000)

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血管內皮生長因子-A siRNA對人肝癌HepG2細胞凋亡的影響及機制

申建剛張定國1朱惠明1

(深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院消化內科，廣東深圳518000)

〔摘要〕目的通過RNA干擾技術特異性地使人肝癌細胞株HepG2中血管內皮生長因子(VEGF)-A表達下調，檢測細胞凋亡率變化及p-Akt、生成素、caspase-3表達。方法采用脂質體介導將針對靶基因VEGF-A的小片段RNA導入人HepG2細胞內，用Western印跡和RT-PCR技術檢測人HepG2細胞內VEGF-A、p-Akt、生成素、caspase-3的表達，用膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡。結果細胞轉染成功后，VEGF-A siRNA組VEGF-A mRNA表達量顯著降低，較RNA干擾組下降80.88%(0.26±0.07 vs 1.36±0.05，P<0.01)，VEGF-A蛋白表達量顯著降低，較RNA干擾組下降75.34%(0.18±0.02 vs 0.73±0.06，P<0.01)；細胞凋亡率增加，VEGF-A siRNA組較RNA干擾組增高21.96%(28.21%±1.75% vs 6.25%±0.82%，P<0.01)。伴隨p-Akt和生存素蛋白水平降低和caspase-3表達上調(P<0.01)。結論通過RNA干擾技術特異性地使人肝癌細胞株HepG2中VEGF-A表達下調，可以誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，這可能是通過PI3K/ p-Akt/生存素信號轉導通路實現(xiàn)的。

〔關鍵詞〕肝癌細胞；小干擾RNA；血管內皮生長因子；p-Akt；生存素

1深圳市人民醫(yī)院消化內科

第一作者：申建剛(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸病學和肝病學研究。

誘導肝癌細胞凋亡是治療肝癌的一個重要策略。腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生和轉移過程中的關鍵環(huán)節(jié)，其中血管內皮生長因子(VEGF)與其受體(VEGFR)在腫瘤血管生成中起最重要的作用〔1〕。 本研究通過RNA干擾技術抑制VEGF-A表達，觀察其對肝癌細胞凋亡及生成素、p-Akt的影響，探討其在肝癌細胞凋亡中的分子機制。

1材料與方法

1.1人肝癌HepG2細胞株細胞培養(yǎng)及主要試劑人肝癌HepG2細胞株接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入適量RPMI1640培養(yǎng)液(含10%的小牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 μg/ml)，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。無支原體胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，RMPI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，VEGF-A、p-Akt、生成素、caspase-3多克隆抗體、VEGF-A RNAi試劑盒(美國Santa Cruz公司)。RNA提取試劑盒Trizol、膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)細胞凋亡檢測試劑盒(北京賽百盛基因有限公司)，RT-PCR擴增系統(tǒng)(美國Promega公司)。LipofectamineTM2000脂質體(Invitrogen)。實驗分組：HepG2對照組、RNA干擾組和VEGF-A siRNA組。

1.2細胞轉染采用陽離子脂質體介導的方法進行細胞轉染，根據(jù)Lipofectamine Reagent提供的實驗步驟操作。

1.3RT-PCR檢測VEGF-A mRNA的表達常規(guī)Trizol法提取各標本的總RNA，紫外分光光度計測定A260和A280，以檢mRNA含量和純度，并置于-70℃保存。VEGF-A上游引物序列：5′-CCCACTGAGGAGTCCAACAT-3′，下游引物序列：5′-GAGAGATCTGGTTCCCGAAA-3′，目的片段180 bp；GAPDH上游引物序列：5′-GCCATGTACGTTGCTATCCA-3′，下游引物序列：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，目的片段293 bp。取5 μl PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下凝膠成像。結果以目的基因與GAPDH的積分吸光度的比值表示。

1.4Western 印跡檢測細胞VEGF-A、p-Akt、caspase-3和生存素蛋白表達收集細胞以冷PBS清洗2次，以裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取適量蛋白上樣，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離，轉膜，封閉，一抗、二抗反應，曝光、顯影、定影，結果以目的蛋白與GAPDH積分吸光度的比值表示。

1.5Annexin V-FIYC/碘化丙啶(PI)雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡收集細胞，加入100 μl磷酸鹽緩沖液，混勻，用10 FIYC和5 PI進行染色，4℃避光作用30 min后，再加入300 μl磷酸鹽緩沖液，混勻，將細胞置激發(fā)光為488 nm波長的FACS Calibur型流式細胞儀檢測。ModFit LT軟件分析結果。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1RNAi下調HepG2細胞中VEGF-A的表達HepG2對照組和RNA干擾組VEGF-A mRNA表達量比較無明顯差異(1.26±0.02 vs 1.36±0.05)；VEGF-A siRNA組VEGF-A mRNA為0.26±0.07，顯著低于RNA干擾組(P<0.01)，見圖1。HepG2對照組和RNA干擾組VEGF-A蛋白表達量比較無明顯差異(0.86±0.07 vs 0.73±0.06)；VEGF-A siRNA組VEGF-A蛋白表達為0.18±0.02，顯著低于RNA干擾組，P<0.01，見圖2。

1~3：HepG2對照組、RNA干擾組、VEGF-A siRNA組，下圖同圖1　RT-PCR 檢測RNA干擾技術沉默VEGF-A

圖2　Western印跡檢測RNA干擾技術沉默VEGF-A

2.2VEGF-A表達下調促進HepG2/siRNA細胞凋亡HepG2對照組和RNA干擾組的凋亡率分別為5.43%±0.18%和6.25%±0.82%，均明顯低于VEGF-A siRNA組的28.21%±1.75%，VEGF-A siRNA組較RNA干擾組增高21.96%。

2.3VEGF-A表達下調抑制p-Akt和生成素蛋白水平表達HepG2對照組和RNA干擾組p-Akt蛋白表達量比較無明顯差異(3.78±0.38 vs 4.13±0.47)；VEGF-A siRNA組p-Akt蛋白表達量為0.57±0.06，較RNA干擾組顯著降低(P<0.01)。HepG2對照組和RNA干擾組生存素蛋白表達量比較無明顯差異(0.38±0.07 vs 0.31±0.02)；VEGF-A siRNA組生存素蛋白表達量為0.11±0.02，較RNA干擾組下降64.52 %(P<0.01)(圖3)。

圖3　蛋白印跡技術檢測生存素表達

2.4VEGF-A表達下調促進caspase-3蛋白水平表達HepG2對照組和RNA干擾組caspase-3蛋白表達量比較無明顯差異(0.54±0.04 vs 0.62±0.04)；VEGF-A siRNA組caspase-3蛋白表達量為3.43±0.36，較RNA干擾組顯著升高(P<0.01)(圖4)。

圖4　Western印跡技術檢測p-Akt和caspase-3表達

3討論

VEGF家族成員包括VEGF-A (即通常所指的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E等。VEGF在許多腫瘤組織中有高表達，目前發(fā)現(xiàn)VEGF對腫瘤的影響機制可能有：① 促進腫瘤血管形成，這與VEGF能增加血管通透性、促進血管內皮細胞增殖、促進血管支持物生長有關；②促進腫瘤淋巴管生長；③ 對腫瘤細胞的細胞動力影響；④ 增強腫瘤細胞對放療的耐受性及影響免疫功能等〔2〕。

目前VEGF對腫瘤細胞增殖的影響還存在著爭論，但對抑制腫瘤細胞的凋亡作用已獲得了一定的共識〔3〕，其機制尚不明確。本實驗使用小RNA干擾方法，下調人肝癌HepG2細胞中VEGF-A的表達，可以誘導肝癌HepG2細胞凋亡，并檢測到caspase-3表達增加，從而證實抑制VEGF-A表達可通過caspase-3途徑誘導HepG2細胞凋亡。

近年來，P13K/Akt/生存素信號通路逐漸為人們所熟悉〔3,4〕。P13K/Akt信號通路是體內重要的信號轉導通路之一，在維持細胞生長、分化、代謝等方面起著關鍵作用。Akt是一類調節(jié)細胞凋亡/存活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt作為一潛在的癌基因，Akt的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療產生的耐藥性密切相關〔5〕，作為凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的新成員〔6〕，生存素在細胞增殖、凋亡的平衡中起重要的調控作用，生存素可通過抑制凋亡通路下游的caspase-3和caspase-7發(fā)揮抗凋亡作用，其潛在的臨床意義是肝癌早期診斷、判斷轉移、評估預后及預測對放化療的敏感性等，并成為抗腫瘤治療的一個新靶點。

近年來，在實體瘤中VEGF和生成素表達相關性已受到越來越多的重視。研究證實〔7~9〕，VEGF可通過上調生成素表達促進血管內皮細胞增殖；VEGF在腫瘤血管生成過程中的內皮細胞抗凋亡作用依賴于其誘導的生成素表達增加，高表達的生成素抑制caspase的凋亡途徑，使內皮細胞免于凋亡；生成素的反義寡核苷酸可抵消VEGF的抗凋亡作用，導致內皮細胞凋亡增加及毛細血管退化〔10〕。上述結果表明，VEGF與生成素之間有密切的關系。對VEGF及生存素在人HepG2細胞中表達相關性的研究不多。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A在基因水平和蛋白水平表達下降時生存素蛋白表達也隨之下調，并可檢測到p-Akt的表達下調。由此推測VEGF-A對生存素表達具有調控作用，這可能是通過P13K/Akt/生存素信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)在人HepG2細胞內下調VEGF-A表達，可以誘導HepG2細胞凋亡，這可能是通過抑制P13K/Akt/生存素信號轉導通路表達實現(xiàn)的，這將為臨床選擇新的治療靶點提供理論依據(jù)。

4參考文獻

1Ferrar N,Gerber HP,LeCouter J．The biology of VEGF and its receptors 〔J〕.Nat Med,2003;9(6):669-76.

2Ebos JM,Lee CR,Kerbel RS.Tumor and host-mediated pathways of resistance and disease progression in response to antiangiogenic therapy〔J〕.Clin Cancer Res,2009;15(16):5020-5.

3Tolosa L,Mir M,Asensio VJ,etal.Vascular endothelial growth factor protects spinal cord motoneurons against glutamate-induced excitotoxicity via phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕.J Neurochem,2008;105(4):1080-90.

4Xiong YQ,Sun HC,Zhu XD,etal.Bevacizumab enhances chemosensitivity of hepatocellular carcinoma to adriamycin related to inhibition of survivin expression 〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2011;137(3):505-12.

5Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt signaling pathway in human malignancy〔J〕.Cell Signal,2002;14(5):381-95.

6Mita AC,Mita MM,Nawrocki ST,etal.Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics 〔J〕.Clin Cancer Res,2008;14(16):5000-5.

7崔斐，陳斌，陳錦章，等.凋亡抑制蛋白Survivin和血管內皮生長因子在肝細胞癌中的表達及其臨床意義〔J〕.南方醫(yī)科大學學報，2008；28(5)：7610-3.

8Beierle EA,Nagaram A,Dai W,etal.VEGF-mediated survivin expression in neuroblastoma cells〔J〕.J Surg Res,2005;127(1):21-8.

9Kanwar JR,Kamalapuram SK,Kanwar RK.Targeting survivin in cancer: the cell-signalling perspective〔J〕.Drug Discov Today,2011;16(11-12):485-94.

10Chun JY,Hu Y,Pinder E,etal.Selenium inhibition of survivin expression by preventing Sp1 binding to its promoter 〔J〕.Mol Cancer Ther,2007;6(9):2572-80.

〔2014-03-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：深圳市科技計劃項目(No.201003021)

〔中圖分類號〕R363

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0542-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.011