Eag1鉀離子通道在卵巢癌組織中的表達及意義

陳　慧，張　蘭，郭以河，林月麗，洪麗玲

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·論著·

Eag1鉀離子通道在卵巢癌組織中的表達及意義

陳慧1，張?zhí)m1，郭以河2，林月麗1，洪麗玲1

[摘要]目的檢測Ether à go-go 1(Eag1) 鉀離子通道在人卵巢癌中的表達，對人卵巢癌細胞株SKOV3的影響及與卵巢癌患者臨床特征的關系。方法用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應 (qRT-PCR) 檢測卵巢癌細胞SKOV3中Eag1的表達；用噻唑藍比色法 (MTT) 檢測Eag1鉀離子通道抑制劑阿司咪唑 (Astemizole) 對SKOV3細胞增殖的影響；用流式細胞儀檢測阿司咪唑對對SKOV3細周期的影響；用蛋白印跡法 (Western blot) 和免疫組織化學的方法檢測36例卵巢癌組織中Eag1蛋白的表達并結合臨床病例資料進行分析。結果阿司咪唑可明顯抑制SKOV3細胞增殖，阻滯細胞周期于G0/G1期。在卵巢癌標本中，Eag1蛋白的陽性表達率明顯高于正常卵巢組織。其在不同的臨床分期方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論Eag1鉀離子通道異常表達于人卵巢癌組織中，并可能成為卵巢癌診斷和治療的靶點。

[關鍵詞]Eag1；阿司咪唑；增殖；免疫組織化學；卵巢癌

作者單位：363000福建漳州，廈門大學附屬東南醫(yī)院，1.婦產(chǎn)科，2.病理科

引用格式：陳慧，張?zhí)m，郭以河，等.Eag1鉀離子通道在卵巢癌組織中的表達及意義[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):17-20.

卵巢惡性腫瘤是婦產(chǎn)科常見的惡性腫瘤之一[1-2]。其發(fā)病率僅此于子宮體癌和子宮頸癌，但其致死率卻為婦科惡性腫瘤首位[3]，因為卵巢解剖位置深，且缺乏早期診斷和晚期治療的方法。Eag1是EAG(ether à go-go)鉀離子通道家族的成員[4]，近期研究發(fā)現(xiàn)Eag1在腫瘤組織和相應起源的正常組織中差異性表達，不僅可能參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程[5]，還可能成為預測腫瘤發(fā)生、提示腫瘤預后的標志和治療靶點[6-11]。本研究首先用qRT-PCR 和Western blot檢測了Eag1在卵巢中的表達，之后用MTT和流式細胞儀檢測了Eag1抑制劑對卵巢癌細胞增殖和周期的影響，最后用免疫組化法檢測Eag1在不同臨床分期的卵巢癌組織中的表達情況，以期探討其表達水平與卵巢癌患者預后之間的關系。

1材料與方法

1.1臨床資料選取2008年1月-2010年12月在廈門大學附屬東南醫(yī)院婦產(chǎn)科進行卵巢癌手術切除的卵巢惡性腫瘤標本36例。另取因子宮肌瘤行附件切除的正常卵巢組織標本10例及1例進行乳腺癌手術切除的乳腺癌標本。按2006年FIGO卵巢惡性腫瘤的手術病理分期進行臨床分期[1]，Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期20例(其中Ⅲa期5例，Ⅲb期7例，Ⅲc期8例)，Ⅳ期2例。研究前所有患者均已簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2材料人卵巢癌細胞株SKOV3、人乳腺癌細胞株MCF-7和人胚腎細胞株HEK 293購自中國科學院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基和小牛血清購自美國Hyclone公司；反轉錄試劑盒、MTT、MarkerDL2000、瓊脂糖、二甲基亞砜、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色劑購自西安舟鼎國公司；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；兔抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG抗體購自美國Santa Cruz公司；ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自美國Millipore公司；兔抗人EAG1單克隆抗體購買自以色列Alomone公司，MaxVision試劑盒購自福州邁新公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)37 ℃、5% CO2條件下，RPM-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素)培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKOV3、人乳腺癌細胞株MCF-7和人胚腎細胞株HEK 293。

1.3.2RT-PCR 用Trizol法提取各組細胞的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書的步驟制備cDNA，引物序列如下：Eag 1，上游：5′-GCT TTT GAG AAC GTG GAT GAG-3′，下游：5′-CGA AGA TGG TGG CAT AGA GAA-3′，475bp，56 ℃；β-actin，上游：5′-TCC ACC TTC CAG CAG ATG TG-3′，下游：5′-GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′，75 bp，54 ℃。反應體系：0.5 μL cDNA，7.5 μL超純水，上下游引物各1.0 μL，SYBR Green 10.0 μL，共計20 μL。反應條件：①預變性94 ℃,4 min：②變性：94 ℃，45 s；③退火：54 ℃，45 s；④延伸：72 ℃，45 s，循環(huán)30次。

1.3.3四氮唑藍(MTT)比色實驗100 μL細胞懸液 (1×105/mL) 均勻分布于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后孔中加入100 μL阿司咪唑溶液(10 μM)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，為防止藥物與MTT反應，小心用PBS清洗每孔2次。之后每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min。選擇490 nm波長，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(美國Bio-Rad公司)測定各孔吸光值。按照公式：細胞存活率=實驗組吸光值/陽性對照吸光值×100%。為提高實驗結果的準確性，每組設置10個復孔。與實驗平行，加細胞、培養(yǎng)基不加抑制劑的組為陽性對照組；與實驗平行，只加培養(yǎng)基不加細胞的孔設置為空白對照組，比色時空白對照組調零。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞周期加入阿司咪唑溶液后細胞在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。1×106細胞中加入1 mL 70%冰甲醇，30 min后離心，去上清。4 ℃，PBS 清洗3次。加入100 μL PBS、100 μL核糖核酸酶，加入碘化丙錠(PI)染色，使其最終濃度達到50 μg/mL。染色后的細胞于4 ℃、避光處保存2 h后在流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)上檢測，結果用CELLQUEST軟件分析。

1.3.5Western blot檢測Eag1的表達冷PBS洗滌不同組織，各培養(yǎng)皿加入適量4℃的RIPA裂解液，冰上孵育40 min。收集裂解物，超聲勻漿, 4 ℃, 12 000×g離心25 min，取上清-80 ℃保存。根據(jù)樣品蛋白濃度，按蛋白總量30 μg計算體積。SDS-PAGE垂直電泳，轉移至硝酸纖維素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes, NC)。使用5%脫脂奶粉(溶于TBS-T緩沖液)室溫封閉1 h，兔抗Eag1一抗(1∶200)，兔抗β-actin 一抗(1∶2000), 4 ℃孵育過夜。TBS-T振蕩清洗5 min ×3次。室溫下相應加入山羊抗兔IgG抗體 (1∶10 000) 或山羊抗兔IgG抗體(1∶8000)孵育1 h，同前法洗膜3次，用ECL化學發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影。

1.3.6免疫組化按試劑盒說明書進行免疫組化操作。染色結果判定以靠近細胞核的胞漿染色為主，淺黃色、棕黃色、棕褐色均為陽性著色，隨機觀察4個高倍視野200個細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)，陽性細胞所占比例大于10%即認定為陽性表達[6]。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0軟件對統(tǒng)計結果進行分析。Eag1在不同組織中表達水平的比較、抑制劑對細胞增殖的影響采用Mann-Whitney U 檢驗和Kruskal-Wallis檢驗。卵巢癌不同分期各組率之間的比較采用χ2檢驗和Fisher’s精確概率法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Eag1蛋白在卵巢癌組織中的表達研究已證實Eag1在人乳腺癌細胞和組織中高表達[7]，因此將其作為陽性對照。人胚腎細胞株HEK 293和人正常卵巢組織作為正常對照。圖1示Eag1 mRNA在人卵巢癌細胞株SKOV3中的表達水平與其在人乳腺癌細胞株MCF-7表達水平相似(P>0.05)，均明顯高于其在人胚腎細胞株HEK 293的表達水平(P<0.05)。圖2示W(wǎng)estern blot分析Eag1蛋白在人卵巢癌組織中的表達水平與其在人乳腺癌組織的表達水平相似，均明顯高于在正常卵巢組織的表達。

與陰性對照組HEK 293細胞相比，*P<0.05圖1　qRT-PCR檢測三株細胞中 Eag1 mRNA的表達水平

1：人正常卵巢組織；2：人卵巢癌組織；3：人乳腺癌組織圖2　Western blot檢測Eag1在人卵巢癌組織中的表達

2.2阿司咪唑對SKOV3細胞增殖的影響與對照組(100.00±3.61)%相比，阿司咪唑可明顯抑制SKOV3細胞增殖(35.40±4.26)%，兩組間差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05,圖3)。

與對照組相比，*P<0.05圖3　阿司咪唑對SKOV3細胞增殖的影響

2.3阿司咪唑對SKOV3細胞周期的影響阿司咪唑處理后可阻滯細胞周期于G0/G1 期(P<0.05)，并導致S 期(P<0.05)、G2/M期比例的減少。與對照組相比，阿司咪唑可明顯阻滯SKOV3細胞周期于G0/G1期 (圖4)。

2.4Eag1在卵巢癌組織中的表達與臨床分期之間的關系在36例卵巢癌患者標本中，Eag1蛋白的陽性表達率為77.8%，其中在正常卵巢組織中陽性表達率為33.3% (3/10)，在Ⅰ期卵巢癌組織中為50% (3/6)，Ⅱ期中為66.7% (6/8)，Ⅲ期中為85% (17/20)，Ⅳ期中為100% (2/2)。在卵巢癌標本中，Eag1蛋白的陽性表達率在不同臨床分期的組織中 (P<0.05) 差異有統(tǒng)計學意義。圖5顯示典型的Eag1在卵巢癌組織中高表達的情況，表現(xiàn)為胞核周圍胞漿中分布的棕黃(褐)色顆粒。

與對照組相比，*P<0.05圖4　阿司咪唑對SKOV3細胞周期的影響

圖5　Eag1蛋白在人卵巢組織中的表達(SP ×200)

3討論

鉀離子通道是分布最廣、家族規(guī)模最龐大的離子通道，與細胞膜電位形成、激素分泌、興奮性、基因表達及細胞增殖和凋亡有著密切的關系。近年來的研究表明，鉀離子通道與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，它參與腫瘤細胞的生理過程。Eag1是EAG鉀離子通道家族的成員，研究表明，在哺乳動物中Eag1定位于染色體1q32.1-2上，是細胞膜上允許鉀離子通過的一種跨膜蛋白[12-13]。進一步研究發(fā)現(xiàn)在人類正常組織中，Eag1表達有限,主要表達于腦組織，少量表達于胎盤、子宮內膜上皮細胞中，短暫性表達于肌原細胞[12]。而在多種人類腫瘤細胞系和腫瘤組織中異常高表達[9-11,14-17],Eag1參與了腫瘤細胞增殖、細胞周期等過程。它可導致細胞骨架的重組及膜外結構的重排，從而影響細胞的粘附、增殖與轉移[18]，并有利于惡性腫瘤細胞的生長以及癌前病變的惡變轉化[19-21]。Eag1的表達水平與腫瘤大小、轉移、分期以及浸潤深度等有關，可提示惡性腫瘤患者的臨床預后[8-11]。近來的研究顯示,Eag1調節(jié)腫瘤的增殖與生長可能與增加IGF-1的活性有關，粘附蛋白S100B能抑制Eag1的功能，從而抑制腫瘤的生長[22-24]。

本研究結果顯示,Eag1高表達于卵巢癌組織中，Eag1陽性表達率和強度明顯高于正常卵巢組織。利用Eag1抑制劑阿司咪唑能有效地抑制卵巢癌細胞株SKOV3的細胞增殖，阻滯細胞周期于有絲分裂前期。在病理分期中較晚、臨床復發(fā)早、預后差的病例中，Eag1的高表達及強表達進一步證實了Eag1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后中的預示作用。說明卵巢癌組織中Eag1的表達水平與患者的臨床預后有明顯的相關性。能否將Eag1列為卵巢癌新的腫瘤標志物，如何將其作為監(jiān)測疾病進展和評估預后的指標，及將Eag1抑制劑應用于腫瘤的靶向治療有待進一步研究。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Expression and significance ofether à go-go 1 channels in human ovarian cancer

CHENHui1,ZHANGLan1,GUOYi-he2

,LINYue-li1,HONGLi-lin1.1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics, 2.DepartmentofPathology,theAffiliatedSoutheastHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression of Eag1 potassium channel in human ovarian cancer, the effects of Eag1 on human ovarian cancer cell line SKOV3 and the relationship between Eag1 expression and clinicopathological characteristics of ovarian cancer patients. MethodsThe expression of Eag1 in human ovarian cancer cell line SKOV3 was detected by quantificational reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The effects of astemizole (a inhibitor of Eag1) on SKOV3 cells proliferation and cycle were measured by MTT andow cytometry. Then the expressions of Eag1 at protein level were detected by Western blot and immunohistochemical staining in 36 cases of ovarian cancer. The relationship between the index and clinicopathological parameters was analyzed. ResultsEag1 was overexpressed in SKOV3 cells. Cell proliferation and cycle can be significantly inhibited by astemizole. Eag1 was expressed higher in the ovarian cancer specimens than in normal ovaries tissues and was associated with clinical stage (P<0.05). ConclusionThe expression of Eag1 potassium channel was aberrant in human ovarian cancer tissues and Eag1 potassium channel may represent a potential target for ovarian cancer diagnosis and treatment.

[Key words]human ether à go-go1; astemizole; proliferation; cell cycle; immunohistochemistry; ovarian cancer

(收稿日期：2015-06-24；修回日期：2015-08-07)

基金項目：福建省漳州市自然科學計劃項目(ZZ2012J25)

[中圖分類號]R737.31

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.005