• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力

    2016-03-02 07:59:15方波李曉倩張穎馬虹
    關(guān)鍵詞:勻漿培養(yǎng)液骨髓

    方波,李曉倩,張穎,馬虹

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,沈陽 110001)

    缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力

    方波*,李曉倩,張穎,馬虹

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,沈陽 110001)

    目的探討缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone narrow stromal cells,BMSCs)存活、增殖和遷移能力的影響。方法體外分離培養(yǎng)BMSCs,予以傳代。正常脊髓勻漿培養(yǎng)液組(Normal組):將BMSCs置于正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng);缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液組(IR組):將BMSCs置于缺血再灌注損傷大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng);缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液組(IPC組):將BMSCs置于缺血預(yù)處理后缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測各組BMSCs凋亡率,MTT法檢測BMSCs增殖,Transwell小室檢測BMSCs遷移能力。結(jié)果與Normal組比較,IR組的BMSCs凋亡率增高,增殖能力下降,遷移能力下降;與IR組比較,IPC組的BMSCs凋亡率降低,增殖能力和遷移能力增強(qiáng)。結(jié)論缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力。

    缺血預(yù)處理;骨髓基質(zhì)細(xì)胞;缺血再灌注損傷;脊髓;細(xì)胞存活;遷移

    脊髓缺血再灌注損傷是胸腹主動脈瘤手術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,可引起截癱,隨著大血管外科的不斷進(jìn)步,通過改進(jìn)手術(shù)以及相關(guān)輔助技術(shù)來提高脊髓保護(hù)效果的空間越來越小,即使是微創(chuàng)的胸主動脈腔內(nèi)修復(fù)術(shù),截癱率仍高達(dá)3.7%[1]。細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是目前國際研究的熱點(diǎn)。其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)具有容易獲得、體外增殖速度快、耐受免疫反應(yīng)、移植后不易形成腫瘤及可進(jìn)行基因修飾后移植等優(yōu)越性[2],是細(xì)胞和基因治療的理想種子,在脊髓損傷修復(fù)中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而在缺血再灌注損傷的情況下,無論是內(nèi)源性干細(xì)胞還是移植的外源性干細(xì)胞,都會面臨缺血缺氧的威脅,大部分干細(xì)胞在移植后死亡[3,4],嚴(yán)重地限制其修復(fù)作用。如何增強(qiáng)干細(xì)胞的生存率是關(guān)鍵問題。在過去的十年中,學(xué)者們進(jìn)行了大量的努力,探討各種體外預(yù)處理提高移植細(xì)胞存活的策略,包括藥物預(yù)處理、細(xì)胞因子預(yù)處理和低氧預(yù)處理[5-8]等。但是上述預(yù)處理骨髓基質(zhì)細(xì)胞的方法都是基于在移植前增強(qiáng)干細(xì)胞耐受缺氧的能力,這需要額外的體外干預(yù)過程,操作復(fù)雜,延誤治療時機(jī),而且干預(yù)的效果具有很大的不確定性,應(yīng)用于臨床將受到明顯的限制。缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)是指在缺血損傷前對器官組織實(shí)施短暫的缺血,非但不會加重?fù)p傷,反而增強(qiáng)器官組織對缺血的耐受性,改善受損器官的微環(huán)境,理論上可能會更有利于移植干細(xì)胞的存活。既往研究干細(xì)胞存活的體外實(shí)驗(yàn)是通過低氧或氧糖剝奪模擬移植后的缺血缺氧環(huán)境,存在局限性。本研究制備大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液,培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞,將更真實(shí)地模擬骨髓基質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注損傷和缺血預(yù)處理脊髓組織微環(huán)境下的生物學(xué)特性,進(jìn)而觀察缺血預(yù)處理對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力的影響。

    材料和方法

    1 材料

    健康SD大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),3周齡,雌雄不限。DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Sigma),倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS),CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)。

    2 大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)

    取3周齡雄性SD大鼠,頸椎脫臼脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡10min。無菌超凈臺內(nèi)完整分離股骨、脛骨,剔凈軟組織,剪去骨骺端,以無菌的DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,沖出骨髓并轉(zhuǎn)移至離心管中,反復(fù)吹打成全骨髓細(xì)胞懸液,離心棄去上清,DMEM/F12培養(yǎng)液重懸,接種至培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)基含DMEM/F12和20%胎牛血清,37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。根據(jù)貼壁生長的特點(diǎn)獲取BMSCs。72h后首次換液,用PBS清洗,除去未貼壁細(xì)胞,更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上融合后傳代,傳3代純化細(xì)胞。

    3 脊髓缺血再灌注損傷模型的建立

    大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉,經(jīng)氣管切開處行氣管內(nèi)插管機(jī)械通氣。直腸內(nèi)置入溫度傳感器,持續(xù)監(jiān)測體溫,應(yīng)用電熱毯維持核心溫度37.5±0.5℃。脊髓缺血再灌注損傷模型參照文獻(xiàn)[4]制作。左頸總動脈置管測量近端動脈血壓,尾動脈置管測量遠(yuǎn)端血壓。擺右側(cè)臥位,于左前肢和肩胛下角間行橫切口,逐層分離暴露肋骨,于第2、3肋之間暴露胸腔,分離并顯露主動脈弓。皮下注射肝素(200IU/kg),于左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間夾閉主動脈,阻斷14min后開放動脈夾,造成脊髓缺血再灌注損傷。關(guān)胸,逐層縫合。術(shù)后將動物放置28℃的保溫箱內(nèi),等待動物蘇醒后回籠飼養(yǎng)。

    4 脊髓缺血預(yù)處理

    在脊髓缺血再灌注損傷前先短暫阻斷主動脈3min,恢復(fù)灌注10min實(shí)施缺血預(yù)處理,之后阻斷主動脈造成脊髓缺血再灌注損傷。

    5 脊髓組織勻漿制備和細(xì)胞培養(yǎng)

    取大鼠正常脊髓組織、缺血再灌注損傷脊髓組織和缺血預(yù)處理脊髓組織,分別按脊髓濕質(zhì)量0.1g加1 mL DMEM/F12培養(yǎng)基的比例冰上研磨制備脊髓組織勻漿,模擬病理微環(huán)境,-20℃?zhèn)溆?。取傳代純化后的BMSCs分為3組:①正常脊髓勻漿培養(yǎng)液組(Normal組):BMSCs置于正常脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng);②缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液組(IR組):BMSCs置于缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng);③缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液組(IPC組):BMSCs置于缺血預(yù)處理后缺血再灌注損傷脊髓勻漿培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測。

    6 Annexin V-FITC-PI法流式細(xì)胞儀檢測BMSCs凋亡率

    收集BMSCs,用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,加入5μl Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻后于2~8℃避光條件下孵育15min,加入10μl propidium iodide(PI)染色液于2~8℃避光條件下孵育5min。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Annexin V(+)PI(-)判斷為凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取其均值。

    7 M TT法檢測BMSCs增殖

    收集BMSCs,接種于96孔板,每孔加入20μl MTT(5mg/ml)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液,再加入DMSO 150μl,于搖床上緩慢振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解后,酶標(biāo)儀檢測490nm波長處各孔吸光度(OD)值。

    8 Transwell小室檢測BMSCs遷移

    將具有8μm孔道的transwell小室用于檢測BMSCs的體外遷移。收集BMSCs,用含2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。在各上室分別加入200μl細(xì)胞懸液,保證每個小室內(nèi)細(xì)胞為2×104個細(xì)胞。預(yù)先在下室加入600μl含2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,其中分別含不同上清液,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,取出小室,將transwell膜上測未遷移的細(xì)胞用棉簽小心擦去,經(jīng)4%多聚甲醛固定15min,風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min,在倒置顯微鏡下觀察膜下遷移細(xì)胞。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,隨機(jī)計(jì)數(shù)每個小室5個高倍視野下(200倍)遷移細(xì)胞數(shù)。

    9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的存活能力

    Annexin V-FITC-PI法流式細(xì)胞儀檢測顯示,與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(Normal組)比較,應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IR組)凋亡率顯著增高,而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IPC組)凋亡率雖高于Normal組,但明顯低于IR組(圖1)

    圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs凋亡率的影響。A,Normal組;B,IR組;C,IPC組;D,凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;與Normal組比較,*,0.01<P<0.05,**,P<0.01;與IR組比較,#,0.01<P<0.05Fig.1 Flow cytometrymeasurementof the effectof IPC rat spinal cord homogenatemedium on the apoptosis of BMSCs.A,Normal group;B,IR group;C,IPC group;D,quantitative statistical analysis of the apoptotic rates.*,0.01<P<0.05,**,P<0.01,compared with Normal group;#,0.01<P<0.05,compared with IR group

    2 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的增殖能力

    MTT法檢測增殖能力結(jié)果顯示,與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(Normal組)比較,應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IR組)增殖能力顯著下降,而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IPC組)增殖能力雖低于Normal組,但明顯高于IR組(圖2)

    圖2 MTT法檢測缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs增殖的影響。與Normal組比較,*,0.01<P<0.05;與IR組比較,#,0.01<P<0.05Fig.2 MTT detection of the effect of IPC rat spinal cord homogenate medium on the proliferation of BMSCs.*,0.01<P<0.05,compared with Normal group;#,0.01<P<0.05,compared with IR group

    3 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液增強(qiáng)BMSCs的遷移能力

    Transwell小室檢測檢測遷移能力結(jié)果顯示,與應(yīng)用正常大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(Normal組)比較,應(yīng)用缺血大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IR組)遷移能力顯著下降,而應(yīng)用缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSCs(IPC組)遷移能力雖低于Normal組,但明顯高于IR組(圖3)

    圖3 缺血預(yù)處理大鼠脊髓勻漿培養(yǎng)液對BMSCs遷移影響的Transwell小室檢測。A,Normal組;B,IR組;C,IPC組;D,統(tǒng)計(jì)定量分析。與Normal組比較,*,0.01<P<0.05;與IR組比較,#,0.01<P<0.05;比例尺,100μmFig.3 Transwell detection of the effectof IPC rat spinal cord homogenatemedium on themigration of BMSCs.A,Normal group;B,IR group;C,IPC group;D,quantitative statistical analysis.*,0.01<P<0.05,compared with Normal group;#,0.01<P<0.05,compared with IR group;scale bar,100μm

    討 論

    干細(xì)胞移植后死亡一直是阻礙干細(xì)胞應(yīng)用的關(guān)鍵問題。既往提高移植細(xì)胞存活的策略多集中在體外預(yù)處理移植細(xì)胞,如低氧預(yù)處理增強(qiáng)干細(xì)胞的生存能力[9,10]。換個角度思考,直接預(yù)處理受損組織,改善干細(xì)胞移植的微環(huán)境,使之更有利于干細(xì)胞的存活等生物學(xué)特性,無疑更適合臨床應(yīng)用。缺血預(yù)處理可顯著減輕缺血灌注引起的組織損傷,增強(qiáng)組織對缺血的耐受性,具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。既往研究證實(shí)脊髓缺血預(yù)處理能夠有效保護(hù)缺血再灌注脊髓[11,12]。本研究制備大鼠缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液,培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞,觀察缺血預(yù)處理脊髓勻漿培養(yǎng)液對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活、增殖和遷移能力的影響,為缺血預(yù)處理增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療脊髓缺血再灌注損傷的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨髓基質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注損傷脊髓組織勻漿的病理微環(huán)境中培養(yǎng),凋亡增加,增殖能力和遷移能力降低,而置入缺血預(yù)處理的脊髓組織勻漿中培養(yǎng),存活、增殖和遷移能力得到明顯改善,證實(shí)缺血預(yù)處理的脊髓微環(huán)境更有利于骨髓基質(zhì)細(xì)胞生存,同時增強(qiáng)了增殖和遷移能力。

    胸腹主動脈瘤等大血管手術(shù)需要阻斷主動脈,引起耐受缺血缺氧能力差的脊髓發(fā)生缺血再灌注損傷。在真正持續(xù)阻斷主動脈前,先短暫夾閉主動脈幾分鐘后開放主動脈恢復(fù)灌注,就可簡單地完成脊髓缺血預(yù)處理,操作過程與胸腹主動脈瘤手術(shù)操作完全接軌,是一種非常有前途的脊髓保護(hù)手段。最近研究[13]表明在心肌缺血模型中缺血預(yù)處理能夠增加早期內(nèi)源性造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞特異性的動員和招募,向缺血心肌組織內(nèi)的移行;而且移行的細(xì)胞數(shù)量與保護(hù)效果成正比。

    綜上所述,骨髓基質(zhì)細(xì)胞在大鼠缺血再灌注損傷脊髓組織勻漿中凋亡增加,增殖和遷移能力降低,而缺血預(yù)處理的脊髓勻漿培養(yǎng)液能增強(qiáng)移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞的存活、增殖和遷移能力,這將為臨床應(yīng)用缺血預(yù)處理增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用提供依據(jù)。

    [1]Matsuda H,F(xiàn)ukuda T,Iritani O,et al.Spinal cord injury is not negligible after TEVAR for lower descending aorta. Eur JVasc Endovasc Surg,2010,39(2):179-186.

    [2]Meyerrose T,Olson S,Pontow S,et al.Mesenchymal stem cells for the sustained in vivo delivery of bioactive factors. Adv Drug Deliv Rev,2010,62(12):1167-1174.

    [3]Luo H,Zhang Y,Zhang Z,et al.The protection of MSCs from apoptosis in nerve regeneration by TGFβ1 through reducing inflammation and promoting VEGF-dependent angiogenesis.Biomaterials,2012,33(17):4277-4287.

    [4]Fan W,Cheng K,Qin X,et al.mTORC1 and mTORC2 Play Different Roles in the Functional Survival of Transplanted Adipose-derived Stromal Cells in Hindlimb Ischemic Mice via Regulating Inflammation in vivo.Stem Cells,2013,31(1):203-214.

    [5]Sheng Z,Yao Y,Li Y,et al.Bradykinin preconditioning improves therapeutic potential of human endothelial progenitor cells in infarcted myocardium.PLoS One,2013,8(12):e81505.

    [6]Peng Y,Huang S,Wu Y,et al.Platelet rich plasma clot releasate preconditioning induced PI3K/AKT/NFκB signaling enhances survival and regenerative function of rat bone marrow mesenchymal stem cells in hostile microenvironments.Stem Cells Dev,2013,22(24):3236-3251.

    [7]Wei L,F(xiàn)raser JL,Lu ZY,etal.Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rats.Neurobiol Dis,2012,46(3):635-645.

    [8]Kudo T,Hosoyama T,Samura M,et al.Hypoxic preconditioning reinforces cellular functions of autologous peripheral blood-derived cells in rabbit hindlimb ischemiamodel.Biochem Biophys Res Commun,2014,444(3):370-375.

    [9]Qin HH,F(xiàn)ilippi C,Sun S,et al.Hypoxic preconditioning potentiates the trophic effects ofmesenchymal stem cells on co-cultured human primary hepatocytes.Stem Cell Res T-her,2015,6:237.

    [10]徐巧巖,夏琳,王吉昌.低氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞耐受缺血缺氧的能力.中國組織工程研究,2013,17(49):8474-8480.

    [11]Fang B,Li XM,Sun XJ,et al.Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int JMol Sci,2013,14(5):10343-10354.

    [12]方波,趙曦,王赫,等.缺血預(yù)處理對兔脊髓缺血再灌注損傷水通道蛋白-4表達(dá)的影響.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2013,22(2):121-125.

    [13] Gy?ngy?siM,Posa A,Pavo N,et al.Differential effect of ischaemic preconditioning onmobilisation and recruitment of haematopoietic and mesenchymal stem cells in porcine myocardial ischaemia-reperfusion.Thromb Haemost,2010,104(2):376-384.

    Ischem ic preconditioning rat spinal cord homogenatemedium enhances the viability,proliferation and m igration of bonemarrow stromal cells

    Fang Bo*,Li Xiaoqian,Zhang Ying,Ma Hong
    (Department of Anesthesiology,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

    Ob jective To investigate the effect of ischemic preconditioning(IPC)rat spinal cord homogenatemedium on the viability,proliferation and migration of bonemarrow stromal cells(BMSCs).M ethodsBMSCs were isolated and subcultured in vitro. Three groups ofmedia were then prepared for the BMSC passage:normal rat spinal cord homogenatemedium(Normal group),ischemia-reperfusion injured rat spinal cord homogenatemedium(IR group),and ischemia-reperfusion injured rat spinal cord homogenatemedium(IPC group).The apoptotic rate of BMSCswas detected by flow cytometry,the proliferation by MTT and themigration by Transwell chamber assay.ResultsCompared with the Normal group,the apoptotic rate of BMSCs increased,while the proliferation andmigration decreased in the IR group.Compared with the IR group,the apoptotic rate decreased,while the proliferation andmigration increased in the IPC group.ConclusionIPC rat spinal cord homogenatemedium enhances the survival,proliferation and migration of BMSCs.

    Ischemic preconditioning,bonemarrow stromal cells,ischemia-reperfusion injury;spinal cord;cell viability;migration

    R744

    A

    10.16705/j.cnki.1004-1850.2016.06.006

    2016-10-09

    2016-12-14

    國家自然科學(xué)基金(81401000);遼寧省博士科研啟動基金項(xiàng)目(20141035);遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(LK201636)

    男(1979年),漢族,副教授

    *通訊作者(To whom correspondence should be addressed):drumk0630@126.com

    猜你喜歡
    勻漿培養(yǎng)液骨髓
    Ancient stone tools were found
    從一道試題再說血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用
    宮頸癌術(shù)后調(diào)強(qiáng)放療中骨髓抑制與骨髓照射劑量體積的關(guān)系
    調(diào)整蔗糖、硼酸和pH值可優(yōu)化甜櫻桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)液
    贊美骨髓
    文苑(2018年18期)2018-11-08 11:12:42
    不同培養(yǎng)液對大草履蟲生長與形態(tài)的影響研究
    勻漿法提取沙棗果總黃酮工藝研究
    植物研究(2018年4期)2018-07-24 00:52:26
    骨髓穿刺涂片聯(lián)合骨髓活檢切片在骨髓增生異常綜合征診斷中的應(yīng)用
    不同誘導(dǎo)方式制備的大鼠肝勻漿代謝酶活性及凍儲方式的比較
    超級培養(yǎng)液
    亚洲少妇的诱惑av| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 精品少妇内射三级| 男女之事视频高清在线观看| 91字幕亚洲| 精品少妇久久久久久888优播| a在线观看视频网站| 成年av动漫网址| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久精品人妻al黑| 国产精品免费视频内射| 亚洲avbb在线观看| 91av网站免费观看| av天堂在线播放| 99久久99久久久精品蜜桃| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品1区2区在线观看. | 免费在线观看完整版高清| av免费在线观看网站| av网站在线播放免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品久久久精品久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 十八禁高潮呻吟视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日本av免费视频播放| 久久中文看片网| 亚洲 国产 在线| 9热在线视频观看99| 久久久国产一区二区| 一区二区三区精品91| 国产免费av片在线观看野外av| 天堂俺去俺来也www色官网| 黄片播放在线免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 999久久久精品免费观看国产| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费在线观看完整版高清| 国产成+人综合+亚洲专区| 制服人妻中文乱码| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲人成77777在线视频| 999久久久国产精品视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄色视频不卡| 日本五十路高清| 岛国在线观看网站| 9热在线视频观看99| 欧美中文综合在线视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人免费无遮挡视频| 两人在一起打扑克的视频| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲第一av免费看| 中文字幕制服av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 麻豆国产av国片精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品久久久久成人av| 中国国产av一级| 久久九九热精品免费| 黑丝袜美女国产一区| 日韩电影二区| 高清欧美精品videossex| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品人人爽人人爽视色| 成年动漫av网址| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲国产欧美网| 老司机午夜十八禁免费视频| 两性夫妻黄色片| 精品福利永久在线观看| 亚洲中文av在线| 99久久人妻综合| 欧美日韩黄片免| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 日韩免费高清中文字幕av| 国产男人的电影天堂91| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品久久久av美女十八| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 91九色精品人成在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 桃花免费在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 大陆偷拍与自拍| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产看品久久| 久久久久久久国产电影| 97精品久久久久久久久久精品| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 91麻豆av在线| 男女边摸边吃奶| 日韩欧美免费精品| 深夜精品福利| avwww免费| 国产野战对白在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 看免费av毛片| 夫妻午夜视频| 国产男女内射视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久精品成人免费网站| 亚洲第一青青草原| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 手机成人av网站| 欧美大码av| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产黄色免费在线视频| 国产一区二区激情短视频 | 女人久久www免费人成看片| 国产成人系列免费观看| 蜜桃国产av成人99| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | www.999成人在线观看| 搡老岳熟女国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 热99国产精品久久久久久7| 我的亚洲天堂| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费日韩欧美在线观看| 丝袜美足系列| 在线av久久热| 欧美日韩成人在线一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 自线自在国产av| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲综合色网址| av福利片在线| 大陆偷拍与自拍| 黄色视频不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 不卡一级毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 精品亚洲乱码少妇综合久久| a级毛片黄视频| 丝袜美足系列| 国产片内射在线| 午夜激情久久久久久久| 成人国产av品久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 纯流量卡能插随身wifi吗| 秋霞在线观看毛片| 老司机影院成人| 国产免费一区二区三区四区乱码| 黄色毛片三级朝国网站| 国产成人av激情在线播放| 搡老乐熟女国产| av一本久久久久| 一本色道久久久久久精品综合| 69精品国产乱码久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇精品久久久久久久| 久久国产精品影院| 99国产精品99久久久久| 日本av手机在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色a级毛片大全视频| 欧美另类一区| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲久久久国产精品| 99久久人妻综合| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 乱人伦中国视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 99国产精品免费福利视频| 美女中出高潮动态图| 十八禁高潮呻吟视频| 成年动漫av网址| 欧美变态另类bdsm刘玥| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久狼人影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 老熟女久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩一区二区三区影片| 国产精品99久久99久久久不卡| 老司机深夜福利视频在线观看 | 他把我摸到了高潮在线观看 | 免费少妇av软件| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲少妇的诱惑av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 自线自在国产av| 高清av免费在线| 成人影院久久| 日日爽夜夜爽网站| 我的亚洲天堂| 国产高清videossex| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产a三级三级三级| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黄频高清免费视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲人成电影观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久久久久久精品精品| 精品福利观看| 老司机靠b影院| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 国产不卡av网站在线观看| 女人久久www免费人成看片| 女人久久www免费人成看片| 天天添夜夜摸| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 777米奇影视久久| 一区二区三区四区激情视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品福利观看| 亚洲全国av大片| 人妻 亚洲 视频| 久久久精品免费免费高清| 日韩三级视频一区二区三区| 久久中文字幕一级| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本av免费视频播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品免费大片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99九九在线精品视频| 曰老女人黄片| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久国产欧美日韩av| kizo精华| 亚洲国产日韩一区二区| 女人久久www免费人成看片| 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕人妻熟女乱码| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久精品94久久精品| 国产av国产精品国产| 美女国产高潮福利片在线看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩视频在线欧美| 成人免费观看视频高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 18在线观看网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99久久精品国产亚洲精品| 多毛熟女@视频| 日本av手机在线免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久狼人影院| 国产精品一区二区在线观看99| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲黑人精品在线| 99久久国产精品久久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品国产av成人精品| 热re99久久精品国产66热6| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 两个人免费观看高清视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 高清黄色对白视频在线免费看| tocl精华| 夫妻午夜视频| 在线观看舔阴道视频| 水蜜桃什么品种好| 另类精品久久| a级毛片黄视频| 老司机影院成人| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 精品国产乱子伦一区二区三区 | 欧美人与性动交α欧美软件| 五月天丁香电影| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产又爽黄色视频| 久久久欧美国产精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 大香蕉久久成人网| 国产精品亚洲av一区麻豆| 啦啦啦在线免费观看视频4| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 美女午夜性视频免费| 老司机影院毛片| 久久影院123| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 中文字幕制服av| av视频免费观看在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 三级毛片av免费| 欧美大码av| 久久久久网色| 丁香六月天网| 一个人免费在线观看的高清视频 | 性少妇av在线| 大片电影免费在线观看免费| 我的亚洲天堂| 一本大道久久a久久精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 宅男免费午夜| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品一区二区在线不卡| 曰老女人黄片| 亚洲成人免费av在线播放| 大香蕉久久网| 久久精品亚洲av国产电影网| 夫妻午夜视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品二区激情视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | av不卡在线播放| 韩国精品一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 男女边摸边吃奶| 国产男女内射视频| 超碰成人久久| 日本91视频免费播放| 国产免费现黄频在线看| 女警被强在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 韩国高清视频一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产男女内射视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 蜜桃国产av成人99| 精品乱码久久久久久99久播| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av超薄肉色丝袜交足视频| 夫妻午夜视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久九九热精品免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 热re99久久国产66热| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美人与性动交α欧美软件| 中文字幕制服av| 国产精品二区激情视频| 大香蕉久久成人网| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 不卡一级毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品一区二区免费欧美 | 90打野战视频偷拍视频| 免费观看a级毛片全部| av在线播放精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲,欧美精品.| 中文欧美无线码| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 成人国产av品久久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级毛片电影观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美精品av麻豆av| 欧美成人午夜精品| 国产成人系列免费观看| 国产免费福利视频在线观看| 久久久国产一区二区| 九色亚洲精品在线播放| 久久中文看片网| 波多野结衣一区麻豆| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久精品免费免费高清| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 婷婷色av中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 最黄视频免费看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产一级毛片在线| 国产在线免费精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 丰满少妇做爰视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99re6热这里在线精品视频| 成人黄色视频免费在线看| 丁香六月欧美| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 黄色毛片三级朝国网站| av线在线观看网站| av有码第一页| 日本av免费视频播放| av在线播放精品| www.自偷自拍.com| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲少妇的诱惑av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美国产精品一级二级三级| 999久久久精品免费观看国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 最新在线观看一区二区三区| av不卡在线播放| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 麻豆av在线久日| 亚洲色图综合在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产有黄有色有爽视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 啦啦啦 在线观看视频| 性少妇av在线| 亚洲一区中文字幕在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲专区国产一区二区| 十八禁网站免费在线| 亚洲国产av影院在线观看| 99国产精品一区二区三区| 丝袜喷水一区| 一级片免费观看大全| 亚洲精品久久午夜乱码| 新久久久久国产一级毛片| 男女下面插进去视频免费观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品一区二区三卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久久久精品精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品第二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 一区二区三区四区激情视频| 男女午夜视频在线观看| 精品福利永久在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产精品影院久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 69av精品久久久久久 | 欧美国产精品一级二级三级| 不卡一级毛片| 欧美xxⅹ黑人| 久久综合国产亚洲精品| 好男人电影高清在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产片内射在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜福利在线观看吧| 日日爽夜夜爽网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 伊人亚洲综合成人网| 在线观看免费高清a一片| 国产真人三级小视频在线观看| a在线观看视频网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 日本一区二区免费在线视频| 9热在线视频观看99| 国产欧美亚洲国产| 亚洲综合色网址| 黄色 视频免费看| 久久人妻熟女aⅴ| 青春草亚洲视频在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级毛片精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| av片东京热男人的天堂| 曰老女人黄片| 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲欧美精品永久| 啦啦啦啦在线视频资源| 狠狠狠狠99中文字幕| 91大片在线观看| av天堂在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线观看免费高清a一片| 亚洲视频免费观看视频| 操美女的视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑人猛操日本美女一级片| www.自偷自拍.com| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成人手机| 男女无遮挡免费网站观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日本中文国产一区发布| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男女免费视频国产| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久视频综合| 18禁观看日本| 人成视频在线观看免费观看| 热re99久久国产66热| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产精品成人久久小说| 女性生殖器流出的白浆| 国产高清videossex| 日本91视频免费播放| 一区在线观看完整版| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品在线电影| 男女高潮啪啪啪动态图| 999久久久国产精品视频| 亚洲精华国产精华精| 黄色毛片三级朝国网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产一级毛片在线| 美女大奶头黄色视频| 黑人操中国人逼视频| 欧美日本中文国产一区发布| 多毛熟女@视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品国产乱码久久久久久男人| 国产99久久九九免费精品| 午夜福利乱码中文字幕| av片东京热男人的天堂| 亚洲全国av大片| 青草久久国产| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲人成77777在线视频| av在线播放精品| 亚洲男人天堂网一区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产在线一区二区三区精| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 午夜免费鲁丝| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲成国产人片在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久99一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久青草综合色| 精品乱码久久久久久99久播| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 波多野结衣av一区二区av| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品国产三级国产专区5o| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一区二区三区乱码不卡18| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲成国产人片在线观看| 99久久人妻综合| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩亚洲高清精品| 大香蕉久久成人网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 永久免费av网站大全| 在线 av 中文字幕| 国产亚洲精品久久久久5区| 99九九在线精品视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 亚洲五月色婷婷综合| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品熟女久久久久浪| 美女脱内裤让男人舔精品视频| netflix在线观看网站| 成人免费观看视频高清| 脱女人内裤的视频| 国产欧美亚洲国产|