超氧化物歧化酶的研究進展

袁牧，王昌留，王一斐，徐貴華，韓瀟

（魯東大學生命科學學院，煙臺 264025）

超氧化物歧化酶的研究進展

袁牧，王昌留*，王一斐，徐貴華，韓瀟

（魯東大學生命科學學院，煙臺 264025）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是抗氧化酶類的重要成員，是生物體有效清除活性氧的主要酶類之一，是抗氧化系統的第一道防線，在需氧生物普遍存在，多位于生物體細胞的細胞質、線粒體以及葉綠體中。本文從SOD的發(fā)現、分類與分布、作用機理、分子結構與功能、起源與進化及應用等方面綜述SOD的研究進展，并對SOD的進一步研究進行展望。

超氧化物歧化酶；活性氧；抗氧化劑

有氧代謝是需氧生物體正常生命活動不可或缺的，它經常會伴有活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生?；钚匝踉跈C體中有雙重作用，生物體內活性氧的含量通常處于平衡狀態(tài)。但當生物機體處于逆境條件時，生物體內的活性氧如不能及時清除將會大量累積而對機體產生一定的傷害，如水生生物在受到環(huán)境脅迫時會產生過量的活性氧導致氧化應激加?。?］。需氧生物有著發(fā)達的氧化防御系統以抵御氧化應激［2］，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）便是該系統中的抗氧化物酶之一，它能夠清除生物氧化過程中的超氧陰離子自由基（superoxide anion，O-2），被認為是抗氧化系統的第一道防線，在需氧生物普遍存在。

1 SOD的起源、分類與分布

當生命第一次在地球上出現時，氧化還原礦物金屬幾乎完全以還原態(tài)存在，大氣層主要由CO2和水蒸氣及少量的N2、H2、CH4，O2含量極少，大約是現在的10-5［3］。20～24億年前，與藍藻光合作用密切相關的大氧化事件改變了大氣和地球的表面成分，O2的急劇增加使得大量的早期生命 （生物）滅絕，少量的靠隱藏在低氧環(huán)境或能產生抵御O2侵襲的生物得以幸存，從而產生了SOD。該酶廣泛存在于各種生物體內，根據其結合的金屬離子的種類不同，SOD可分為3種主要類型［4］，現多認為至少分為4類，即含Cu、Zn的Cu／Zn-SOD，僅含Mn的Mn-SOD和僅含Fe的Fe-SOD以及僅含Ni的Ni-SOD［5-7］，它們的分布與胞質定位 （表1），下面對這4類不同的SOD進行逐一介紹。

1.1 Cu／Zn-SOD

Cu／Zn-SOD因其重要的生理功能和巨大的治療潛能，被認為是超氧化物歧化酶家族最重要的一類酶［8，9］，也是清除自由基最重要的成員之一［10］。它有兩種基本類型，分別由兩個不同的基因編碼［11］成一個在N端含有外導向區(qū)域的胞外型Cu／Zn-SOD（ecCu／Zn-SOD，sod3基因編碼）和不含外導向的胞質型Cu／Zn-SOD（icCu／Zn-SOD，sod1基因編碼）［12］。Cu／Zn-SOD產生的初始階段進化異常緩慢，最近一億年進化較快［13］?；贑u／Zn-SOD基因序列比對和蛋白晶體結構解析，Bordo等［14］認為在真菌、植物和后生動物分化之前，ecCu／Zn-SOD就偏離了icCu／Zn-SOD進化方向。而哺乳動物ec-Cu／Zn-SOD的基因與真菌的Cu／Zn-SOD基因序列更接近，這表明ecCu／Zn-SOD可能比icCu／Zn-SOD更為古老［15］。

表1 SOD的分布及胞質定位Tab.1 Distribution and cytop lasm ic localization of SOD

icCu／Zn-SOD是發(fā)現最早、也是存在最廣泛的真核生物SOD，主要分布于真核生物的細胞質、植物的葉綠體基質和過氧化物酶體以及線粒體的膜間隙［16］；而ecCu／Zn-SOD則主要定位在細胞表面和細胞質基質及人的細胞核內，它是在動物血漿中被發(fā)現的，目前僅在部分哺乳動物體內確認有其存在［17］。

1.2 Mn-SOD

Mn-SOD是需氧生物生存必不可缺的一種SOD［18，19］?，F在很多物種的Mn-SOD氨基酸序列已被破譯，對Mn-SOD氨基酸序列進行聚類分析發(fā)現放線菌的Mn-SOD與真核生物線粒體及古細菌Mn-SOD親緣關系較近，而與其他細菌較遠［13］。編碼線粒體Mn-SOD的基因雖然位于核內，但可以通過其翻譯的N端轉運肽輸入到線粒體內，因此多數學者現在認為線粒體Mn-SOD的基因源于宿主細胞的古細菌，而不是演變?yōu)榫€粒體的細菌［6，20］。

1969年McCord和Fridovich發(fā)現紅細胞銅蛋白具有超氧化物歧化酶活性不久，Keele等在E.Coli中就獲得了Mn-SOD［21］，后來許多學者相繼在不同生物類群得到了Mn-SOD的二聚體和四聚體。原核生物的Mn-SOD位于細胞質，真核生物的Mn-SOD多位于線粒體，但在植物的過氧化物酶體及某些單細胞藻類的葉綠體也發(fā)現含有Mn-SOD［15，22］?，F在習慣上將Mn-SOD分為兩類：一類是胞質Mn-SOD（cytMn-SOD），另一類是線粒體Mn-SOD（mtMn-SOD，sod2基因編碼）位于線粒體內［23］。mtMn-SOD的存在比較廣泛［24］，但cytMn-SOD迄今為止只在甲殼類動物和真菌中發(fā)現［25，26］。

1.3 Fe-SOD

Fe-SOD由Yost等［27］1973年在大腸桿菌首次發(fā)現，后來證實該酶存在于多種不同生物類群。植物和藍藻有相似的Fe-SOD基因保守區(qū)，但非光合細菌缺乏這些基因保守區(qū)［28］，這表明Fe-SOD基因來自于藍藻經內共生演化轉移到核基因組，藍藻則成為葉綠體［29］。

Fe-SOD的分布非常廣泛，在古細菌、專性厭氧菌、兼性需氧菌、有氧固氮菌、藍藻、原生動物及藻類和高等植物的葉綠體內甚或部分生物的細胞核都發(fā)現了該酶［30，31］。

1.4 Ni-SOD

Ni-SOD的發(fā)現較晚，1996年Youn等［5，32］在灰色鏈霉菌中首次獲得該酶。Priya等［33］分析了60多種藍藻的SOD，發(fā)現Ni-SOD僅在低等種類出現，可見Ni-SOD的基因進化較為緩慢?，F認為該酶主要存在于藍藻、綠藻、鏈霉菌等的細胞質中［6］，是海洋生物較常見的一種SOD。

2 SOD的功能與作用機理

SOD是自然界最有效的防御氧化侵襲的抗氧化劑之一。對于植物，低溫環(huán)境是影響其生長的重要因素，有的學者認為，低溫會使植物體內的活性氧過度積累，甚至最后會導致細胞的衰老和死亡。而SOD就是植物為了減輕體內活性氧過度積累的第一道防線［34］，并且在干旱脅迫中扮演者重要的角色：已有研究表明，耐旱的植物擁有更高的SOD活性，因此，較高的SOD活性可以被視為一個抗旱的指標。不同物種對干旱脅迫的響應是不同，主要表現為SOD的活性變化趨勢，但SOD的表達很大程度上依賴于物種的基因型［35］。對于動物，SOD在消除活性氧的毒性中發(fā)揮了重要作用，并參與由病毒感染［36］和細菌引起的免疫反應［37］。對于人類，適當增加SOD可有助于防止疾病產生和延長壽命［38］，而SOD水平的降低會在人類身上出現大量的退化性疾病，其中包括纖維組織肌痛、糖尿病、癌癥、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥等［39，40］。

對于SOD而言，其催化反應的速度與底物的乘積成正比，是一種典型的二級反應，它通過降低氧化活性部位金屬離子的活性，以兩步快速的反應使O轉變?yōu)镠2O2和O

這里的M表示SOD的金屬離子，M3+是金屬離子被氧化以后的最高價位，這種逐步反應機制從反應動力學來說，有3個優(yōu)點［42］：首先，一個分子反應能避免兩個分子同時反應時金屬離子相互之間產生的靜電排斥作用；其次，位于活性位點上的金屬離子所攜帶的電荷可以被一個質子吸收保存，這樣就能使該歧化反應的產物為中性不帶電的，不會產生相互約束的靜電作用；第三，第一步反應所釋放的能量能被第二步反應利用使超氧陰離子 （O）還原，然后H2O2再被過氧化氫酶還原形成H2O。從反應式上來看，H2O2量太多的話，便能夠抑制超氧化物歧化酶的活性，而且H2O2能夠改變酶的構象，影響酶活力。另外，H2O2還能夠反應轉化為OH-，使酶蛋白變性以及其核酸發(fā)生突變，從而降低酶的活性。

2.1 Cu／Zn-SOD

Cu／Zn-SOD在生物體內含量最多，因此較其他3種SOD來說是生物體抗氧化作用的主要執(zhí)行者。自1995年Orrell等［43］發(fā)現Cu／ZnSOD（嚴格說現應稱之為icCu／Zn-SOD）的突變可導致肌萎縮性側索硬化癥（ALS）的產生以來，許多學者開始致力于Cu／Zn-SOD的基因編碼區(qū)突變及功能影響研究，現在超過70個突變位點的150多種sod1已被報道，且多數突變發(fā)生于sod1的第5外顯子區(qū)段。無論是野生型還是ALS突變的Cu／ZnSOD，如果缺鋅都會導致一氧化氮依賴的神經細胞凋亡，但通過補鋅可阻止該過程的發(fā)生［44］。有學者證實敲除sod1的小鼠患有生理障礙如雌性生育能力降低、黃斑變性甚或死于肝臟腫瘤［16，45］。1998年Ookawara等［46］發(fā)現ecCu／Zn-SOD在正常的肺組織、血管、呼吸道、腎臟、子宮、心臟的表達明顯高于其他SOD，因而提出ecCu／Zn-SOD不僅可作為一種抗氧化劑，而且還能作為信號傳播的一個控制器。另外，Mruk等［47］觀察到大鼠睪丸中ecCu／Zn-SOD的mRNA水平在不同發(fā)育時期呈現明顯不同，在20至60天時會大幅增加。后來Zelko在研究小鼠胎兒的ecCu／Zn-SOD時也發(fā)現直到妊娠后期，才能檢測到小鼠胎兒ecCu／Zn-SOD的mRNA表達［48］，Adachi等［49］發(fā)現在人類中，兒童的ecCu／Zn-SOD表達明顯高于成人并以每年2%遞減，到20歲時達到平臺期。這說明ecCu／Zn-SOD限于特定組織和器官的階段性特異性表達可能與啟動子甲基化和組蛋白乙?；谋碛^遺傳因子相關［50］。新近Kim［51］等發(fā)現ecCu／Zn-SOD的抗血管生成和抗炎作用是其通過抑制缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和蛋白激酶C（PKC）活性及下調NF-κB的表達；另外，Kwon等［52］也證明ecCu／Zn-SOD可通過阻止免疫細胞浸潤和抑制白細胞與血管內皮細胞粘著參與免疫應答，從而證實了Ookawara等提出的ecCu／Zn-SOD參與信號傳導的作用。現認為ecCu／Zn-SOD是一氧化氮（NO）在血管壁、心臟、肺、腎和胎盤等行使生理功能的主要調控者，且它的表達及其催化活性的改變還會涉及多種相關疾病如心血管、神經系統和肺部疾病等［53］，并且通過基因敲除和轉基因越來越多的研究結果還揭示ecCu／Zn-SOD與衰老、高血壓、糖尿病、細胞凋亡、細胞增生及抑癌等相關［54-57］。

2.2 Mn-SOD

盡管Mn-SOD在組織中的含量僅為Cu／Zn-SOD的一半，但它對需氧生物的生存和抵御活性氧產生的毒性卻至關重要，它是有氧環(huán)境下生物體生命活動SOD家族成員中唯一不可缺少的酶［58］，現在許多研究結果證實Mn-SOD在促進細胞分化和腫瘤發(fā)生及防止高氧誘導的肺損傷有重要的作用，Mn-SOD的生物學功能涉及能量代謝、細胞周期調控以及正常和增生組織細胞的增殖與凋亡。早在1931年Hopkins就發(fā)現錳是一種生物體正常生長所需的重要微量元素［59］，是一種許多酶（如Mn-SOD）必需的輔助因子。1989年Galeotti等［60］用荷瘤近交系大鼠的正常組織為材料進行肝癌細胞的分化研究發(fā)現肝癌的產生與Mn-SOD的表達有關，是由轉錄活性下降引起的。后來更多的學者用基因敲除和修飾的方法對Mn-SOD的生理功能進行了廣泛研究，如Mn-SOD基因缺失的小鼠因擴張型心肌病和神經退化出生后不久就很快死亡［61］，即使雜合的敲除Mn-SOD基因后的小鼠也能觀察到其嚴重缺陷和對有氧環(huán)境的敏感［62］。Sutton等［63］發(fā)現人類Mn-SOD基因線粒體靶向序列（MTS）中的纈氨酸（GTT）替換為丙氨酸（GCT）時，后者Mn-SOD酶的活性較前者高30%～40%，可有助于降低某些癌癥的發(fā)生和緩解神經退行性疾病和嚴重的酒精性肝病，這與Zhang等［64］觀察到的Mn-SOD的第58氨基酸突變?yōu)镮le酶活升高從而抑制人的乳腺癌細胞株MCF-7生長的結果相一致。上述結果表明，Mn-SOD能夠抑制腫瘤的產生并具有提高癌癥治療成功率的作用［35］。

2.3 Fe-SOD

由于在原核生物尤其是低等的原核生物少有Mn-SOD和Cu／Zn-SOD，因此Fe-SOD在原核生物的抗氧化系統中占有重要的地位，它是某些細菌生存所必需的，且還能通過減少O-2與NO的相互作用保護細菌免受過氧亞硝基陰離子（ONOO-）的毒性［65］；Priya等［66］發(fā)現藍藻（Synechococcu elongates PCC 7942）只含有Fe-SOD，由2個基因編碼，對藍藻的正常光合作用及干燥、冷卻、氮饑餓等環(huán)境脅迫都有一定的保護作用，敲除其中之一并不影響藍藻光合自養(yǎng)的增長，但如果這2個基因雙突變則是致死性的，后來Ke等［67］用藍藻（Synechocystissp.PCC 6803和Synechococcus sp.CC9311）也證實了該結果。對高等植物葉綠體內Fe-SOD的功能研究的報道較多：Zhang等［68］以煙草為材料借助RNA干擾技術降低葉綠素Fe-SOD的表達發(fā)現Fe-SOD在維持PSII復合體的穩(wěn)定性及O-2引起的PSII光損傷和D1降解有重要作用；Myouga等［69］則發(fā)現葉綠體Fe-SOD基因的突變或缺失會使擬南芥生長不佳，表型矮小蒼白，葉綠體發(fā)育異常；而增加Fe-SOD的表達可以保護甲基紫羅堿處理的擬南芥原生質膜和PSII對超氧化物自由基的抗性［70］，這一現象已在煙草、玉米等被證實。另外，許多學者還發(fā)現轉基因煙草、轉基因玉米葉綠體內Fe-SOD的過表達還能提升光照或黑暗狀態(tài)下對冷襲的耐受［71，72］。

2.4 Ni-SOD

含有Ni-SOD的生物種類不多，它們多生活在海洋里，有關Ni-SOD的報道大多是以研究基因序列、酶的催化活性為主［6］，除能夠專一清除O-2外，其他功能方面的研究遠較另外幾種SOD為少。Kim等［73］發(fā)現天藍色鏈霉菌的Ni-SOD表達與其生活環(huán)境如生長介質、金屬或螯合劑的濃度等相關，當環(huán)境沒有鎳時天藍色鏈霉菌不能表達Ni-SOD，但其Fe／Zn-SOD的表達增加可以彌補Ni-SOD的損失，這表明Fe／Zn-SOD能替代NiSOD的作用。后來Kim等［74］發(fā)現Ni能抑制漢城鏈霉菌Fe-SOD的表達，促進Ni-SOD的表達。近來Schmidt等［75］研究酸瘡痂鏈霉菌時發(fā)現Ni和其他一些重金屬都可促進Ni-SOD的表達，用以提高生物體對重金屬的耐受能力。這些報道說明對于鏈霉菌Ni-SOD和Fe-SOD的功能是一致的，其表達受環(huán)境影響較大。

3 SOD的應用

機體在正常情況下產生的超氧陰離子自由基是維持生命活動所必需的，正常健康機體內自由基的形成和清除處于一種動態(tài)平衡中，所以保持體內適量的SOD是維護健康和延緩衰老及緩解呼吸、代謝、心血管疾病的有效途徑［76］。在20世紀90年代，SOD制劑被引入市場，作為生物體內重要的抗氧化酶，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域應用也較為廣泛［77］。

3.1 在醫(yī)藥中的應用

SOD能很好地清除O-2自由基，在抗衰老和疾病治療中具有十分重要的作用，據報道口服SOD后，SOD能夠在腸道中降解為一些可以有助于治療疾病的小分子，并通過熒光標記試驗在血液中檢測出來［78］。另外，有學者認為，SOD被降解后形成的一些小的肽段能夠穿過細胞膜，并且這些小的肽段具有部分SOD的功能，并證實：胃酸的pH在～2.5左右，SOD經過胃部酸解和酶解的作用之后，大約會用50%的SOD以活性的形式保存下來［79］，這就為SOD的吸收利用提供了前提條件。Pastorini等［80］用SOD治療帕榮雷氏病 （陰莖海綿體硬結），發(fā)現服用了SOD的90名患者大部分性功能都有所恢復且疼痛感消失。Bernier等［81］在研究大鼠的心室纖維性顫動時發(fā)現口服SOD后顫動的發(fā)生率由對照組的87%下降到27%。Okada等［82］證實給荷瘤小鼠口服SOD能阻止腫瘤發(fā)展，Fe-SOD與Nut-lin-3（P53激動劑）聯合應用，可靶向治療癌細胞，并能減少對正常細胞的損傷［83］。另外SOD也是一種新型的抗炎癥藥物，SOD對骨關節(jié)炎、退行性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎以及顳頜關節(jié)機能障礙等均有良好的療效，用SOD漱口劑可以治療牙齦炎、牙周炎、口腔潰瘍等［84-86］。

3.2 在食品中的應用

SOD在食品工業(yè)的應用也十分普遍，目前已經開發(fā)出了很多富含SOD的食品，如綠茶飲料，具有預防齲齒、敏感癥、痛風、降壓等功效；番木瓜酒作為一種天然綠色的低度果露酒，可以促進消化，治療慢性胃炎，舒展血管等［87］。Carillon等［88］研究發(fā)現，添加SOD的濃縮甜瓜汁不僅具有良好的抗氧化活性，還表現出血管緊張素Ⅰ轉化酶抑制劑活性，對高血壓具有潛在的預防作用。它們營養(yǎng)豐富，可以增強人們抗衰老，抗疲勞等能力，具有保健的作用，市場效益不錯，發(fā)展前景良好。另外，SOD還可以作為水果、蔬菜等的保鮮劑，應用于罐頭食品、果汁、啤酒等的保藏。

3.3 在化妝品中的應用

SOD被國際生化委員會、美國聯邦食品管理局譽為 “抗衰因子”和 “美容嬌子”，是化妝品的重要添加劑，具有明顯的防曬、抗炎效果并能防止皮膚衰老、祛斑、抗皺及防治皮膚瘢痕形成等作用［89，90］?；瘖y品領域中的SOD應用研究遠比食品領域的研究成熟，且不像藥物那樣存在嚴格的安全性要求，是目前SOD市場最主要的需求，其需求量占全球需求量的50%以上［91］?，F在國內外不少高級化妝品中都添加有SOD，可制成面膜、乳液、霜劑等多種形式。

4 展望

自SOD發(fā)現以來，其相關的研究一直是生物化學界的熱門，多種生物的SOD基因序列、催化機制、酶活、功能及表達都有很多報道，但涉及SOD的轉錄控制、表觀遺傳調控和轉錄后修飾對SOD功能影響的研究還不夠深入，特別是miRNA對SOD的轉錄調控更是鮮有報道［53］。另外，每個不同類型的SOD除受普通轉錄因子影響外，都有其自己獨特的調控機制，而SOD家族成員之間是如何協調表達各自發(fā)揮其作用的現在了解的還很少。由于環(huán)境的污染，食品和飲用水等中的自由基含量都會大大增加，SOD作為生物體內重要的自由基清除劑，可避免機體內濃度過高引起的不良反應或損傷［92］。然而酶在治療應用中的表現并未達到人們的預期目標，它的非藥物應用包括化妝品、食品、農業(yè)、化工行業(yè)，藥物應用僅限于動物［7］。究其原因，一是SOD的產率和穩(wěn)定性，二是在胃腸道吸收較差和快速降解，三是靜脈注射壽命極短。令人欣慰的是隨著耐熱的適應pH范圍廣的SOD發(fā)現或其突變體的獲得，如土芽孢桿菌（Geobacillus sp.EPT3）Mn-SOD在90℃處理1h其酶活仍能保持57%，且該酶在pH5.0-11.0都很穩(wěn)定［93］；Li等［94］從嗜熱棲熱菌（Thermusthermophilus）獲得的2種Fe-SOD突變體，其中His171Ala突變體在70℃處理1h，其酶活仍能保持51%，且該酶在pH5.0-10.0酶活仍保持80%以上。為了解決SOD吸收差和口服及注射的降解問題，許多學者嘗試用脂質和蛋白質進行了SOD封裝研究，現在認為用小麥醇溶蛋白封裝SOD是比較有效的途徑［95］。也有許多學者進行了人工SOD模酶的合成，由于模擬比天然酶分子量低、更穩(wěn)定和更長的半衰期，且更容易滲透到細胞及不會引發(fā)免疫反應，現已成為SOD應用研究熱點并取得了很好的效果［30］。隨著現代生物技術的快速發(fā)展，用基因工程技術生產SOD，探索不同物種SOD差異性和遺傳信息，深入研究各種SOD在細胞發(fā)育不同階段發(fā)揮的作用，將為進一步加快SOD模擬酶的開發(fā)，為SOD的真正應用提供更加廣闊的前景。

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Progress in the research of superoxide dismutase

Yuan Mu1，Wang Changliu*，Wang Yifei，Xu Guihua，Han Xiao
（School of Life Sciences，Ludong University，Yantai264025，China）

Superoxide dismutase（SOD）is an importantmember of the biological antioxidant system and one of the key enzymes that are responsible for the efficient removal of reactive oxygen species.As the first line of defense in the antioxidant system，it is almost ubiquitous in all forms of aerobic lives and is commonly distributed in the cytoplasm，mitochondria and chloroplasts.This paper reviews the progress in SOD research from its discovery，classification and distribution to itsmechanism of action，molecular structure and function，origin and evolution as well as application.The outlook for SOD study is also discussed.

Superoxide dismutase；reactive oxygen species；antioxidant

Q554

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.015

2016-08-17

2016-10-11

山東省自然科學基金資助（ZR2010CM030）

袁牧，男（1991年），漢族，碩士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：changliuwang＠sina.com