高效液相色譜法同時(shí)測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量

陳群力，周淑琴，須　冰，吳　飛

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院，上?！?01318；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，

上海　200437；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上?！?01203)

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高效液相色譜法同時(shí)測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量

陳群力1，周淑琴1，須冰2，吳飛3

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院，上海201318；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，

上海200437；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海201203)

摘要：目的建立高效液相色譜法(HPLC)用于同時(shí)測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量。方法色譜柱為Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-1.7%磷酸溶液(23∶77)等度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長275 nm。結(jié)果丹酚酸B和淫羊藿苷分別在0.104 4～6.892 μg和0.079 1～2.966 μg 范圍內(nèi)線性良好，平均加樣回收率分別為102.7%和98.89%。結(jié)論 建立的方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于大黃靈脾顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法。

關(guān)鍵詞：大黃靈脾顆粒；丹酚酸B；淫羊藿苷；高效液相色譜法；測定

大黃靈脾顆粒是由丹參、大黃、淫羊藿等多味中藥組成的醫(yī)院制劑，具有溫陽活血、瀉濁解毒的作用，主要用于慢性腎功能衰竭的治療，在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的長期臨床應(yīng)用證實(shí)其療效顯著，能明顯延緩腎衰的發(fā)展[1-3]。方中淫羊藿和丹參均作為君藥使用，淫羊藿作為常用的中藥補(bǔ)陽藥，具有增強(qiáng)免疫、抑菌抗炎和保護(hù)心腦血管等廣泛的藥效作用；丹參所含的水溶性指標(biāo)性成分為丹酚酸B，具有抗氧化、抗纖維化和抑制血管上皮細(xì)胞壞死作用[4]，但是現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)該制劑進(jìn)行相應(yīng)的定性或定量控制[5]。因此，為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，確保其臨床療效，本研究建立了同時(shí)測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷含量的HPLC測定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供研究基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀，含四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器和Agilent ChemStation色譜工作站(美國安捷倫公司)；MS105DU分析天平(0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司)；FA2104N分析天平(0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SK5200超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q型超純水制備儀(密理博中國有限公司)。

丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201212，中國食品藥品檢定研究院)；淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)：110737-200415，中國食品藥品檢定研究院)；大黃靈脾顆粒3批(批號(hào)分別為140626、140712和140828，均為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供)；磷酸(優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司)；水(自制超純水)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈—1.7%磷酸溶液(23∶77)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫25℃，檢測波長275 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B 和淫羊藿苷對(duì)照品對(duì)照品適量，分別加75%甲醇溶液稀釋成1.044 g·L-1丹酚酸B的對(duì)照品溶液母液和0.494 4 g·L-1淫羊藿苷的對(duì)照品溶液母液；精密吸取0.5 mL丹酚酸B對(duì)照品溶液母液和0.8 mL淫羊藿苷對(duì)照品溶液母液至10 mL容量瓶內(nèi)，加75%甲醇稀釋，得到含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的對(duì)照品溶液；再精密移取3.3 mL丹酚酸B對(duì)照品母液和3.0 mL淫羊藿苷對(duì)照品母液于10 mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋制成含丹酚酸B 344.6 mg·L-1和淫羊藿苷148. 3 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL稀乙醇，稱重，密封，超聲30 min，冷卻后補(bǔ)足失重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品的制備按照工藝[5]實(shí)驗(yàn)室制備缺淫羊藿和丹參的陰性樣品。取陰性樣品適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制得大黃靈脾顆粒陰性樣品。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性分別精密移取含淫羊藿苷和丹酚酸B對(duì)照品溶液、大黃靈脾顆粒供試品和大黃靈脾顆粒陰性樣品10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示陰性樣品不干擾丹酚酸B(tR=18.0 min)和淫羊藿苷(tR=38.0 min)的測定，色譜圖見圖1。

圖1　丹酚酸B和淫羊藿苷含量測定色譜圖

注：A:丹酚酸B和淫羊藿苷對(duì)照品； B:大黃靈脾顆粒樣品；C:陰性樣品(缺淫羊藿和丹參)；1. 丹酚酸B；2. 淫羊藿苷。

2.3.2線性關(guān)系的考察精密稱取丹酚酸B和淫羊藿苷對(duì)照品適量，制成含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的對(duì)照品溶液a和含丹酚酸B 344.6 mg·L-1和淫羊藿苷148. 3 mg·L-1的對(duì)照品溶液b。精密吸取對(duì)照品溶液a 2.0、4.0、8.0、15.0、20.0 μL和對(duì)照品溶液b 10.0、15.0、20.0 μL，分別注入色譜儀，記錄峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸，分別得到丹酚酸B和淫羊藿苷對(duì)照品的回歸方程(見表1)。結(jié)果表明：丹酚酸B和淫羊藿苷在0.104 4～6.892 μg和0.079 1～2.966 μg 范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度試驗(yàn)精密吸取含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹酚酸B和淫羊藿苷峰面積RSD分別為0.3%和0.3%，表明進(jìn)樣精密度良好。

表1　線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)取大黃靈脾顆粒(批號(hào)140626)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定，重復(fù)測定6份，計(jì)算樣品中丹酚酸B和淫羊藿苷的平均含量分別為0.663 mg·g-1和0.493 mg·g-1，RSD分別為1.0%和1.1%，結(jié)果表明樣品測定重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取大黃靈脾顆粒(批號(hào)140626)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定，于0、2、4、6、8和12 h進(jìn)樣測定，丹酚酸B和淫羊藿苷的RSD分別為1.1%和0.3%，結(jié)果表明在12 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的供試品1.0 g(批號(hào)140626，丹酚酸B和淫羊藿苷的含量分別為0.663 mg·g-1和0.493 mg·g-1)9份，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入濃度為1.044 g·L-1的丹酚酸B對(duì)照品溶液0.5 mL(低濃度)、0.6 mL(中濃度)和0.7 mL(高濃度)，以及濃度為0.494 4 g·L-1的淫羊藿苷對(duì)照品溶液0.8 mL(低濃度)、1.0 mL(中濃度)和1.2 mL(高濃度)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定?；厥章式Y(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，此方法丹酚酸B和淫羊藿苷的的平均回收率為102.7%和98.89%，符合要求。

表2　丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3　淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品測定取大黃靈脾顆粒3批，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法測定丹酚酸B和淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表4。

3討論

本研究首次建立了中藥復(fù)方制劑大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷同時(shí)測定的HPLC方法，前處理簡單，分析時(shí)間短，方法學(xué)合格。所建立的定量測定方法與原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配合(對(duì)大黃素進(jìn)行定性鑒別)[5]，可以大幅度提升制劑的質(zhì)量控制水平，從而保證制劑的臨床療效。

表4　3批顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷含量(n=3)

中藥院內(nèi)制劑多源自于民間方、古方，是醫(yī)生經(jīng)過多年臨床應(yīng)用所形成的經(jīng)驗(yàn)方的制劑，應(yīng)用廣泛，療效顯著。由于院內(nèi)制劑的質(zhì)量控制水平較低，化學(xué)控制指標(biāo)不足，多缺少定量控制指標(biāo)[6-7]。丹參和淫羊藿均是方中君藥，選擇丹酚酸B和淫羊藿苷作為大黃靈脾顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)是合理的?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，不同植物來源、不同產(chǎn)地的丹參、淫羊藿中丹酚酸B和淫羊藿苷成分有較大的差異[8-9]。

樣品前處理中考察了提取溶劑和處理方法，顯示丹酚酸B和淫羊藿苷用稀乙醇提取較甲醇、乙醇和水提取效率高，加熱回流提取效果與超聲提取效果相當(dāng)。鑒于丹酚酸B熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)[10]，在加熱回流條件下其含量可能會(huì)有一定程度的下降。綜合考慮，采用以稀乙醇為溶媒，進(jìn)行超聲提取，同時(shí)通過對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，確定超聲提取30 min即可將樣品中丹酚酸B和淫羊藿苷提取完全。

中藥制劑中對(duì)丹酚酸B、淫羊藿苷的含量測定方法已有較多報(bào)道[11-20]，但是由于大黃靈脾顆粒的處方組成藥味較多，化學(xué)組分復(fù)雜，雜質(zhì)易干擾目標(biāo)成分的準(zhǔn)確定量測定。通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)丹酚酸B、淫羊藿苷的最大吸收波長分別為286 nm和270 nm，考察了這兩個(gè)組分在不同波長條件下的吸收值，最后選擇對(duì)這兩個(gè)組分均有較大吸收的275 nm作為檢測波長?？疾炝瞬煌壤鲃?dòng)相甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)、 乙腈-1.7%醋酸(23∶77)和乙腈-1.7%磷酸(23∶77)以及柱溫的影響，最后確定了實(shí)驗(yàn)色譜條件。采用乙腈-1.7%磷酸溶液(23∶77)為流動(dòng)相可以取得較好效果，在該色譜條件下，丹酚酸B和淫羊藿苷色譜分離度好，峰對(duì)稱性好，陰性無干擾，與藥典采用的甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)三元混合流動(dòng)相相比，本方法對(duì)儀器的要求較低，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

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◇藥物分析◇

Determination of Salvianolic acid B and Icariin in

Dahuanglingpi Granules by HPLC

CHEN Qun-li1, ZHOU Shu-qin1, XU Bin2,et al

( 1.ShanghaiUniversityofMedicineandHealthSciencesShanghai201318,China;

2.DepartmentofNephrology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedto

ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of salvianolic acid B and icariin in Dahuanglingpi granules. MethodsThe separation was carried on an Agilent Zorbax SB C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) and acetonitrile-1.7% phosphoric acid solution(23 ∶77) was employed as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1with UV detection wavelength at 275 nm and the column temperature was 25℃. ResultsThe linear range of salvianolic acid B and icariin were 0.104 4～6.892 μg and 0.079 1～2.966 μg, respectively. The average recoveries were 102.7% and 98.89%. Conclusion The method is simple and accurate with good specificity and reproducibility, and it can be used for the quality control and evaluation of Dahuanglingpi granules.

Key words：Dahuanglingpi granules；salvianolic acid B；icariin；HPLC；determination

收稿日期：(2015-09-11，修回日期：2015-11-02)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.013

通信作者：須冰，女，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療腎臟病，E-mail: x-u-bing@hotmail.com

基金項(xiàng)目：上海優(yōu)秀青年教師扶助基金項(xiàng)目(No B010310009)；上海市科委重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(No 11DZ1972003)