木蝴蝶不同極性組分體外抗氧化活性研究

王 銳， 師 睿， 熊汝琴， 張澤俊

(昭通學院 化學與生命科學學院， 云南 昭通 657000)

●化學與環(huán)境資源研究

木蝴蝶不同極性組分體外抗氧化活性研究

王 銳， 師 睿， 熊汝琴， 張澤俊

(昭通學院 化學與生命科學學院， 云南 昭通 657000)

木蝴蝶； 不同極性組分； 自由基； 多酚； 黃酮

自由基是生物體氧化過程中產生的正常中間代謝產物，具有強氧化性，若在體內過量堆積就會引發(fā)一系列自由基反應，引起脂質、蛋白質分子交聯(lián)沉積，損傷細胞膜，導致重要的酶失活，DNA突變，進而引起慢性疾病及衰老等各種效應[1-2].為了減輕自由基的危害，尋找高效、安全的天然抗氧化劑，篩選具有抗自由基的物質，意義重大.

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZKF035真空干燥箱 (上海實驗儀器廠有限公司)； XFB-200家用粉碎機(吉首巿中湘制藥機械廠)；AF1604型電子天平(上海天平儀器廠)；RE-5298旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SK5200LHC超聲波洗滌器(上海科導超聲儀器有限公司)；UV/VIS2802PCS紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；HH-S601超級恒溫水浴鍋(金壇市岸頭良友實驗儀器廠).

1.2 材料

生物木蝴蝶(云南省麗江市)；蘆丁對照品(中國藥品制品檢定所)；沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)；福林酚試劑(Sigma公司)；1,1-二苯-2-苦肼自由基(DPPH·,Sigma公司)；其余試劑均為分析純.

2 試驗方法

2.1 木蝴蝶不同極性組分的制備

木蝴蝶經干燥粉碎，過60目篩，加入20倍體積石油醚，超聲(30KHZ，250W)浸提0.5h，除去其中的脂類、色素等成分，抽濾、晾干回收粉末.按料液比1:40，在上述粉末中加入體積分數(shù)80%乙醇，超聲(53KHZ，250W)浸提1h ，過濾，濾渣同上重復浸提至溶液無色，合并濾液，減壓濃縮，得木蝴蝶醇提物(EO).將所得EO加入去離子水制成懸浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇和去離子水萃取，萃取所得各相經減壓濃縮蒸干后得到木蝴蝶不同極性組分：乙酸乙酯萃取組分(EAO)、正丁醇萃取組分(n-BO)和水萃取組分(WO).取適量上述萃取組分按實驗要求配制成不同質量濃度的供試溶液.

2.2 木蝴蝶不同極性組分的體外抗氧化試驗

2.2.1 ·OH清除試驗

先在試管中加入不同質量濃度供試溶液2mL，然后加入9mmol·L-1FeSO4溶液2mL和9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液2mL，搖勻，最后加入8.8mmol·L-1H2O2溶液2mL，混勻，置于37℃水浴反應30min后取出，冷卻至室溫，在510nm波長處吸光度值[7].以乙醇代替不同樣品溶液為空白對照，維生素C(Vc)為陽性對照，每種樣品重復測定3次，求平均值，依據(jù)下列公式計算清除率(以下均同).

Ao為空白對照溶液的吸光度值，Ax為加入供試溶液后的吸光度值，Axo為供試溶液的本底吸光度值.

取0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)5mL于試管中，加入4mL供試溶液，置于25 ℃水浴中預熱20min，再加3mmol·L-1鄰苯三酚溶液1mL，混勻，于25℃水浴中準確反應4min后迅速加入10mmol·L-1HCl溶液1 mL終止反應，在波長320nm處測吸光度值[8]，并計算清除率.

2.2.3 DPPH·清除試驗

參照文獻[9-10]，用無水乙醇精確配制1×10-4mol·L-1的DPPH·溶液.取此溶液2mL加入供試樣品溶液2mL，均勻混合，于黑暗中放置30min，在517nm波長處測定其吸光度值，計算清除率.

2.3 不同極性組分中生物活性成分含量測定

2.3.1 不同極性組分中多酚含量測定

對照文獻[11]配制沒食子酸標準液，于765nm 波長處測定吸光值，繪制吸光度值與沒食子酸標準液的工作曲線.精確量取0.5mL質量濃度均為1mg·mL-1的EAO、n-BO和WO的供試液于25mL比色管中，補充5mL去離子水，加入1.5mL，1mol·L-1福林酚試劑，搖勻，放置2min；然后，加入3mL質量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液，最后加入去離子水定容至25mL，搖勻，放入30℃水浴中，反應30min后取出，冷至室溫，于765nm波長處測吸光度值.對照沒食子酸標準曲線，通過線性方程計算出樣品中多酚含量.

2.3.2 不同極性組分中黃酮含量測定

在參照文獻[12]的基礎上有所改變.配制蘆丁標準液，采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法，在510nm波長處測定吸光度值，得到吸光度值與蘆丁標準液的關系曲線.精確量取1.5mL質量濃度均為5mg·mL-1的EAO、n-BO和WO的供試液于25mL比色管中，加入質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min；再加入質量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，放置6min；最后加入質量分數(shù)為2%的NaOH溶液10mL，用體積分數(shù)為50%乙醇定容至刻度，搖勻，放入40℃水浴中，反應30min，冷至室溫，于510nm波長處測吸光度值.通過蘆丁標準曲線方程計算出樣品中黃酮含量.

3 結果與分析

3.1 對·OH的清除作用

木蝴蝶不同極性萃取組分EAO、n-BO、WO和Vc對·OH的清除作用如圖1所示.

木蝴蝶各極性組分對·OH 都有較強的清除作用.在試驗濃度范圍內，均表現(xiàn)出劑量依賴性清除.

圖1 木蝴蝶不同極性組分對·OH的清除作用Fig. 1 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on ·OH

圖1經計算機線性擬合計算出Vc、EAO、n-BO和WO對·OH的IC50值(表1)，說明各極性組分中，EAO對·OH的清除效果略低于Vc，而顯著高于另外兩個極性組分，其清除·OH的能力約是n-BO的7倍，WO的14倍.

圖2 木蝴蝶不同極性組分對的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on

3.3 對DPPH·的清除作用

測定木蝴蝶不同極性組分對DPPH·的清除作用，如圖3所示.

圖3 木蝴蝶不同極性組分對DPPH·的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on DPPH·

木蝴蝶不同極性組分對DPPH·均具有較強的清除能力.試驗濃度范圍內，存在的良好的劑量依賴性，但不同極性組分清除DPPH·能力不同.由表1可見，EAO對DPPH·的清除能力弱于Vc，而明顯強于n-BO、WO.

表1 木蝴蝶不同極性組分對自由基的IC50值Table 1 IC50 value of different polar fractions of ofOroxylum indicumVent. to free radical

3.4 不同極性組分中活性成分含量

蘆丁質量濃度在0～38.88ug·mL-1，以蘆丁標準品溶液質量濃度X(ug·mL-1)為橫坐標，510 nm處吸光度值Y為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，所得線性回歸方程為Y=0.009 1X-0.005 2(R=0.999 3).沒食子酸質量濃度在0～11.456ug·mL-1，以沒食子酸標準品質量濃度C(ug·mL-1)為橫坐標，765 nm處吸光度值A為縱坐標繪制標準曲線，所得線性回歸方程為A=0.048 9C-0.004 7(R=0.999 6).

表2 不同極性組分的活性成分含量Table 2 Active ingredient contents of different polarities (x±s, n=3)

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復平均值±標準差(x為平均值；s為標準差；n為重復次數(shù)).

分別按“2.3.1”和“2.3.2”法測定木蝴蝶醇提物中EAO、n-BO和WO的吸光度值，通過線性回歸方程計算各極性中多酚和黃酮含量，結果見表2.

由表2 中的數(shù)據(jù)可見，EAO中多酚和黃酮的含量均高于n-BO及WO.黃酮、多酚兩種活性成分總含量在EAO中最高，依次是n-BO、WO.兩種活性成分在各組分中的含量有較大差異，且每一種活性成分在各組分中的比例也不一致.可見木蝴蝶醇提物經乙酸乙酯、正丁醇和去離子水分步萃取后，多酚和黃酮主要分布在乙酸乙酯相中.

3.5 活性成分含量與抗氧化活性相關分析

表3 活性成分含量與抗氧化活性相關性Table 3 Correlation between content of active ingredients and antioxidant activity

4 結論與討論

目前認為植物中具有抗氧化活性的化合物主要是黃酮類化合物、酚類化合物、多糖類化合物等.其中，黃酮和多酚結構中具有的還原性羥基，能有效清除自由基，從而抑制氧化進程.通過木蝴蝶醇提物體外抗氧活性研究發(fā)現(xiàn)，相對于n-BO和WO，EAO清除自由基的效果最好，抗氧化活性最強，這與其黃酮、多酚含量相對較高密切相關，可以進一步提取、分離其功能性成分，測定其化學結構，研究其理化性質與生理藥理作用，為木蝴蝶作為天然抗氧化劑的開發(fā)應用奠定基礎.

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Study on the Antioxidant Activity in Vitro of Different Polar Fractions ofOroxylumindicumVent.

WANG Rui, SHI Rui, XIONG Ru-qin, ZHANG Zhe-jun

(School of Chemistry and Life Science, Zhaotong University, Zhaotong 657000, China)

OroxylumindicumVent.; different polar fractions; free radical; polyphenols; flavonoids

2016-06-14

王銳(1976— )，女，云南昭通人，副教授，碩士，主要從事天然產物研究.

R284.2

A

2095-7408(2016)05-0038-05