河南漢族CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷藥物代謝動力學的影響

申明惠，王曉飛，劉　敏，楊衛(wèi)紅，黃晨征，張勝軍，張莉蓉#

1)鄭州大學附屬中心醫(yī)院科教科 鄭州 450007　2)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心 鄭州 450007　3)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室 鄭州 450001　4)鄭州大學第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究中心 鄭州 450052

?

河南漢族CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷藥物代謝動力學的影響

申明惠1)，王曉飛2)，劉敏1)，楊衛(wèi)紅3)，黃晨征3)，張勝軍4)，張莉蓉3)#

1)鄭州大學附屬中心醫(yī)院科教科 鄭州 4500072)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心 鄭州 4500073)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室 鄭州 4500014)鄭州大學第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究中心 鄭州 450052

關(guān)鍵詞CYP2C19；基因多態(tài)性；氯吡格雷；藥物代謝動力學；河南??；漢族

摘要目的：探討CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷人體藥物代謝動力學的影響。方法：43名健康受試者在單次服用75 mg氯吡格雷片后，定時采血，用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)分析受試者氯吡格雷血藥濃度，采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法檢測CYP2C19*2、*3基因突變。結(jié)果：CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2和CYP2C19*2/*2(*3)3種基因型分別為13、24和6例。藥時曲線下面積(AUC)0-24和AUC0-∞在三種基因型間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：口服氯吡格雷后，CYP2C19不同基因型AUC不同。

AbstractAim: To determine the effect of CYP2C19 genetic polymorphism on the pharmacokinetics of clopidogrel in healthy Chinese subjects.Methods: A total of 43 unrelated healthy Han subjects were enrolled, and each of them received a single dose of 75 mg clopidogrel tablet. Multiple blood samples were collected and the plasma concentrations of clopidogrel were determined by a validated liquid chromatography/tandem mass spectrometry. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis was performed to detect the CYP2C19*2 and *3 gene mutations.Results: The number of the inviduals carrying CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2 and CYP2C19*2/*2 (*3) were 13, 24 and 6, respectively. There were significant differences in the various genotype groups of AUC0-24and AUC0-∞(P<0.05).Conclusion: CYP2C19 polymorphisms affect the AUC of clopidogrel.

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類血小板聚集抑制劑，目前在臨床上常與阿司匹林聯(lián)合，作為急性冠脈綜合征(ACS)、急性心肌梗死和經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治療后的常規(guī)用藥。氯吡格雷本身無活性，需要在肝臟中經(jīng)細胞色素P450(CYP)酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，作用于血小板表面P2Y12受體，從而不可逆地抑制ADP與該受體的結(jié)合，起到抗血小板活化和聚集的效應(yīng)。以上轉(zhuǎn)化是個多相過程，需要一系列CYP同工酶的參與，包括CYP2C19、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4/5和CYP2C9[1]，其中CYP2C19為此過程的關(guān)鍵酶[2]。CYP2C19是一種具有遺傳多態(tài)性的重要藥物代謝酶，主要含有3個單核苷酸多態(tài)位點：CYP2C19*2 (G681A)、CYP2C19*3 (G636A)和CYP2C19*17 (C806T)。CYP2C19*2和*3等位基因為CYP2C19慢代謝型，這類人群氯吡格雷體內(nèi)活化速率降低、活性代謝產(chǎn)物減少、抗血小板活性降低[3]，發(fā)生支架內(nèi)血栓的風險增加[4]。Lee等[5]發(fā)現(xiàn)，CYP2C19中間代謝型和弱代謝型與腦血管疾病患者體內(nèi)氯吡格雷的抗血小板聚集活性降低有關(guān)；而*17可能會增加血小板應(yīng)答伴隨增加出血的風險[6]，但效力不高[7]。目前關(guān)于CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷療效關(guān)系的藥物代謝動力學(簡稱藥動學)的研究相對較少。該研究觀察河南漢族健康受試人群CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷藥動學的影響，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1對象與方法

1.1研究對象中國漢族健康受試者43名，其中男26例，女17例，年齡18～25(22.7±1.6)歲，體重48～72(61.1±4.3) kg，身高154～181(170.8±5.9) cm。血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查均正常。所有受試者均無藥物過敏史，在參與試驗前2周內(nèi)未服用任何藥物，試驗期間禁煙、酒及咖啡等飲料。該研究得到鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，受試者均自愿參加試驗并于試驗前由本人簽署知情同意書。

1.2主要試劑LC-MS/MS(美國Waters公司)，氯吡格雷片(批號：9W38738，杭州賽諾菲制藥公司)，氯吡格雷標準品、氯吡格雷-d4內(nèi)標(TLC醫(yī)藥化工)，2×Taq PCR Master Mix(上海萊楓生物科技有限公司)，DNA Marker、蛋白酶K、瓊脂糖、SmaⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶(大連寶生物工程有限公司)，甲醇、乙腈、乙酸乙酯(天津科密歐化學試劑有限公司)，飽和酚、三氯甲烷、無水乙醇(北京鼎國生物科技有限公司)。

1.3給藥方式及血樣采集受試者前1天晚上禁食10 h，次日晨空腹口服75 mg氯吡格雷片。4 h后進統(tǒng)一標準餐。分別在服藥前和服藥后0.25、0.50、0.75、l.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00、8.00、12.00和24.00 h采集5 mL外周靜脈血，肝素抗凝。采血后1 h內(nèi)3 000 r/min離心, 分離血漿，-80 ℃保存。

1.4樣品預處理 取200 μL血漿加入檢測管，再加入20 μL稀釋液(體積分數(shù)50%乙腈)。向標準液、空白、質(zhì)控樣品及檢測樣品中各加入20 μL內(nèi)標溶液(氯吡格雷-d4，2 500 ng /L)，雙空白中加入20 μL稀釋液，2 000 r/min渦旋30 s。各管中分別加入2 mL正己烷，2 000 r/min渦旋5 min， 3 500 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移有機層至空管中，22 ℃氮氣吹干。加入200 μL復溶相(V乙腈V水=2575)復溶。然后渦旋1 min；6 000g離心5 min。取上清液10 μL進行LC-MS/MS分析。

1.5分析條件色譜柱為Xterra MS C18柱(2.1 mm×50 mm，5 μm)，流動相為V乙腈V水=955，流速為0.5 mL/s，柱溫為常溫25 ℃。離子源為ESI源，源電壓4800 V；加熱毛細管溫度320 ℃；氮氣(N2)流速40 mL/s；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，用于定量的離子分別為氯吡格雷m/z：322.1/212.1；內(nèi)標(氯吡格雷-d4)m/z：326.1/216.1。

1.6方法專屬性 空白血漿，空白血漿加內(nèi)標，空白血漿加氯吡格雷不同濃度質(zhì)控樣品，按1.4的方法處理后進樣，分析得到色譜圖。氯吡格雷保留時間為1.2 min，血漿中雜質(zhì)對氯吡格雷標準品及內(nèi)標的測定無干擾。

1.7線性范圍和最小檢出濃度用空白血漿將標準溶液稀釋成相當于氯吡格雷血漿濃度為5、10、50、250、500、1 250、1 600、2 000 ng /L的標準系列，按1.4的方法處理并測定，記錄色譜圖。以待測物氯吡格雷的峰面積與內(nèi)標氯吡格雷-d4峰面積的比值作為縱坐標，以氯吡格雷濃度為橫坐標，用加權(quán)(1/X2)最小二乘法進行線性回歸運算，得出直線回歸方程為Y=0.007 57X+0.000 505，回歸系數(shù)R2=0.999 8，線性范圍5～2 000 ng /L，最低檢測限為5 ng /L 。

1.8精密度和回收率試驗按照標準曲線制備氯吡格雷低、中、高三個濃度的樣品，濃度分別為15 、100 和 1 500 ng /L，及隨行的標準曲線，每批各6個樣品，連續(xù)測定3 d，求得方法的準確度、日內(nèi)、日間變異均小于15%，回收率為96.5%～99.0%，符合生物樣本的測定要求。

1.9穩(wěn)定性的考察取空白血漿，配制上述氯吡格雷低、中、高三個濃度，分別考察血漿樣品室溫放置6 h、-20 ℃冰箱中反復凍融三次的穩(wěn)定性。氯吡格雷血漿樣本室溫放置6 h的相對標準偏差(RSD)為3.0%、1.0%、1.0%；血漿樣品在-20 ℃冰箱中反復凍融三次的RSD分別為1.8%、1.6%、0.6%。

1.10CYP2C19基因型檢測取600 μL EDTA抗凝全血，用酚-氯仿法提取基因DNA，溶解后的DNA經(jīng)PCR后，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)進行基因分型。CYP2C19*2(G681A)基因分型：上游引物5’-AATTACAACCA GAGCTTGGC-3’，下游引物：5’-TATCACTTTCCATA AAAGCAAG-3’。內(nèi)切酶為SmaⅠ酶，反應(yīng)體系20μL：7 μL PCR產(chǎn)物，8 μL滅菌超純水，2 μL 10×T buffer，2 μL BSA，1 μLSmaⅠ(10 U/μL)，30 ℃反應(yīng)6 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)40 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴乙淀染色后紫外燈下觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物大小為169 bp。若僅顯示169 bp一條帶，則為CYP2C19*2/*2突變純合子；若顯示120和49 bp兩條帶，則為CYP2C19*1/*1野生純合子；若顯示169、120和49 bp三條帶，則為CYP2C19*1/*2突變雜合子。CYP2C19*3 (G636A)基因分型：上游引物5’-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3’，下游引物5’-ACTTCAG-GGCTTGGTCAATA-3’。內(nèi)切酶為BamHⅠ酶，反應(yīng)體系20 μL：10 μL PCR產(chǎn)物，7 μL滅菌超純水，2 μL 10×K buffer， 1 μLBamHⅠ酶(10 U/μL)，30 ℃反應(yīng)2.5 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴乙淀染色后紫外燈下觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物大小271 bp。若僅顯示271 bp一條帶，則為CYP2C19*3/*3突變純合子；若顯示175和96 bp兩條帶，則為CYP2C19*1/*1野生純合子；若顯示271、175和96 bp三條帶，則為CYP2C19*1/*3突變雜合子。

1.11統(tǒng)計學處理峰濃度(Cmax)和達峰時間(Tmax)可以從藥時曲線直接讀出，藥時曲線下面積(AUC)用梯形法計算，血漿半衰期T1/2用Winnonlin軟件計算。用SPSS 13.0進行分析，不同基因型之間藥動學參數(shù)的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1CYP2C19基因型分析CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2和CYP2C19*2/*2 (*3) 3種基因型分別為13、24和6例。未發(fā)現(xiàn)CYP2C19*3/*3突變純合子。結(jié)果見圖1、2。

M： Marker；1、5、7：CYP2C19*1/*1；2、3、6：CYP2C19*1/*2；8：CYP2C19*2/*2。圖1　CYP2C19*2 突變位點的酶切產(chǎn)物電泳圖

M： Marker；1、3、4、6、7、8、9：CYP2C19*1/*1；2：CYP2C19*1/*3。圖2　CYP2C19*3 突變位點的酶切產(chǎn)物電泳圖

2.2CYP2C19多態(tài)性對氯吡格雷藥動學參數(shù)的影響藥時曲線見圖3，藥動學參數(shù)的比較見表1。

圖3　氯吡格雷在CYP2C19不同基因型受試者體內(nèi)的藥時曲線

基因型nρ(Cmax)/(ng·L-1)Tmax/hT1/2/hAUC0-24/(ng·h-1·L-1)AUC0-∞/(ng·h-1·L-1)CYP2C19*1/*1132263.70±840.980.94±0.256.89±0.662263.88±564.862388.91±449.87CYP2C19*1/*2241325.66±226.650.83±0.116.44±0.741893.55±204.322023.12±246.43CYP2C19*2/*2(*3)62948.32±994.351.35±0.445.23±1.076983.57±2012.24#7116.81±3521.77#F1.9671.4310.6285.1345.679P0.1180.2230.8360.0410.036

#：與其他兩種基因型比較，P<0.05。

3討論

CYP2C19*2(rs4244285)突變產(chǎn)生了一個異常的拼接位點，并改變了閱讀框架，提前產(chǎn)生終止密碼子，表達成缺乏血紅素結(jié)合位點的截短蛋白，使酶的活性完全喪失；CYP2C19*3(rs4986893)突變使酶活性部分喪失，最終導致藥物代謝速度減慢[8]。氯吡格雷效應(yīng)的個體間差異與CYP2C19中間代謝型和弱代謝型等位基因的功能降低有關(guān)，從而導致嚴重的心血管疾病及支架置入術(shù)后血栓形成的風險增加[9-11]，但具體機制尚不清楚。

CYP2C19基因多態(tài)性具有顯著的種族差異。該研究河南漢族人群CYP2C19弱代謝型的分布頻率為14.0%，與報道數(shù)據(jù)一致[12]。由試驗結(jié)果的藥時數(shù)據(jù)可以看出，CYP2C19基因型對個體氯吡格雷血藥濃度影響明顯，突變純合子在給藥后各個時間點的血藥濃度均值均大于野生純合子和突變雜合子；且藥動學研究表明，CYP2C19不同基因型之間氯吡格雷的AUC0-24和AUC0-∞比較，差異有統(tǒng)計學意義，突變純合子與野生純合子和突變雜合子相比，AUC0-24和AUC0-∞均增大。這可能是由突變純合子的CYP2C19酶活性降低、代謝能力下降所致。此結(jié)果與以往研究[13-14]結(jié)果一致。

Cmax、Tmax和T1/2在三種基因型之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。這可能是因為作者的樣本數(shù)較少；也可能與氯吡格雷自身代謝特點有關(guān)，氯吡格雷為前體藥物，口服后經(jīng)十二指腸吸收進入體循環(huán)后，大部分藥物被肝羧酸酯酶1(CES1)代謝為無活性的產(chǎn)物，剩余藥物可經(jīng)血液循環(huán)進入肝臟，經(jīng)過CYP450酶系兩步代謝，最終生成活性代謝產(chǎn)物[2]。因此，要準確做到氯吡格雷個體化用藥尚需進行下一步大規(guī)模、多層次的研究。

參考文獻

[1]陳昕朦,金晶,黃民,等.CYP2C19、P2Y12基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究[J].中國藥師,2014,17(6):885

[2]丁肖梁,謬麗燕.氯吡格雷個體差異的遺傳藥理學研究進展[J].中國臨床藥理學雜志,2010(9):701

[3]賴勝榮,劉俊.藥物基因組學與抗血小板藥物抵抗研究進展[J].藥學與臨床研究,2014,22(2):155

[4]劉俊,朱艷虹,欒家杰,等.基因型檢測在氯吡格雷個體化抗血小板治療中的應(yīng)用價值[J].中國藥房,2014,25(12):1097

[5]LEE JB,LEE KA,LEE KY.Cytochrome P450 2C19 polymorphism is associated with reduced clopidogrel response in cerebrovascular disease[J].Yonsei Med J,2011,52(5):734

[6]KUBICA A,KOZINSKI M,GRZESK G,et al.Genetic determinants of platelet response to clopidogrel[J].J Thromb Thrombolysis,2011,32(4):459

[7]SIBBING D,KOCH W,GEBHARD D,et al.Cytochrome 2C19*17 allelic variant, platelet aggregation, bleeding events, and stent thrombosis in clopidogrel-treated patients with coronary stent placement[J].Circulation,2010,121(4):512

[8]羅薇,王鶴堯,劉麗宏,等.CYP2C19多態(tài)性對奧美拉唑藥代動力學的影響[J].臨床藥物治療雜志,2013,11(2):22

[9]SOFI F,GIUSTI B,MARCUCCI R,et al.Cytochrome P450 2C19*2 polymorphism and cardiovascular recurrences in patients taking clopidogrel:a meta-analysis[J].Pharmacogenomics J,2011,11(3):199

[10]GIUSTI B, GORI AM, MARCUCCI R, et al. Drug and medical device interactions:stent thrombosis and personalizing clopidogrel therapy [J]. Curr Pharmacogenomics Pers Med, 2010, 8(2): 124

[11]SIMON T,VERSTUYFT C,MARY-KRAUSE M,et al.Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events[J].N Engl J Med,2009,360(4):363

[12]張林.CYP2C19基因多態(tài)性分析及其與奧美拉唑療效關(guān)系的臨床研究[D].長春:吉林大學,2004.

[13]馬晶晶,李金恒,曹曉梅,等.CYP2C19基因多態(tài)性對奧美拉唑藥動學與相對生物利用度的影響[J].中國藥理學通報,2010,26(2):258

[14]胡祥鵬,許建明,胡詠梅,等.CYP2C19基因多態(tài)性對奧美拉唑在中國人體內(nèi)的藥物動力學和藥效學的影響[J].中國藥理學通報,2005,21(10):67

Effect of CYP2C19 genetic polymorphism on pharmacokinetics of clopidogrel

SHENMinghui1),WANGXiaofei2),LIUMin1),YANGWeihong3),HUANGChenzheng3),ZHANGShengjun4),ZHANGLirong3)

1)DepartmentofScienceandEducation,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500072)TranslationalMedicineCenter,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500073)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)ClinicalPharmacologyResearchCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCYP2C19;gene polymorphisms;clopidogrel;pharmacokinetics;Henan;Han population

中圖分類號R558

通信作者#，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：藥物基因組學，E-mail：zhanglirongzzu@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.024