TRAPPC9基因?qū)δ膛＝鹌暇榉垦卓剐孕誀畹倪z傳效應(yīng)

馮　文，董易春，王　曉，劉　超，王　新，王雅春，俞　英*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

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TRAPPC9基因?qū)δ膛＝鹌暇榉垦卓剐孕誀畹倪z傳效應(yīng)

馮文1，董易春1，王曉1，劉超1，王新2，王雅春1，俞英1*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

摘要：旨在分析奶牛金黃色葡萄球菌(金葡菌)抗性候選基因TRAPPC9 的遺傳效應(yīng)。本研究利用中國北方地區(qū)6個牛場517頭具有完整DHI、年齡及胎次記錄的中國荷斯坦牛的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，使用Multiplex SnaPshot微測序技術(shù)分析TRAPPC9基因4個SNPs的基因型，利用特異性PCR技術(shù)檢測牛只感染金葡菌情況，同時測定血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17、NF-κB等細(xì)胞因子的含量。在此基礎(chǔ)上，利用GLM模型最小二乘法分析TRAPPC9基因4個SNPs對奶牛金葡菌乳房炎抗性的遺傳效應(yīng)。結(jié)果表明：IL-17、TNF-α和IFN-γ可作為有效的乳房炎參考指標(biāo)。對于金葡菌陰性牛，TRAPPC9基因SNP4(C2477531T)對SCS有極顯著影響(P<0.01)；對于金葡菌陽性牛，該SNP對IL-17有極顯著效應(yīng)(P<0.01)。TRAPPC9基因可作為中國荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性分子標(biāo)記之一。

關(guān)鍵詞：奶牛；金黃色葡萄球菌；乳房炎抗性；TRAPPC9；細(xì)胞因子

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus，簡稱金葡菌)是感染奶牛乳腺最常見的病原菌之一[1]。金葡菌產(chǎn)生的毒素破壞宿主細(xì)胞膜，當(dāng)毒素轉(zhuǎn)移到乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)，則毀壞泌乳細(xì)胞及乳房組織。此外，金葡菌可在宿主體內(nèi)形成生物膜且多具有耐藥基因，極易對抗生素產(chǎn)生耐藥性[2-3]。金葡菌通常引起隱性乳房炎，難以發(fā)現(xiàn)、不易根治，對奶牛群乳房健康有嚴(yán)重影響，不僅導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)顯著降低[4]，而且還影響奶牛正常生理功能并延長產(chǎn)后發(fā)情時間，嚴(yán)重時會造成奶牛過早淘汰，增加牛群更替成本。任改仙等在2008-2009年調(diào)查了北京地區(qū)奶牛場的乳房炎發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)金葡菌引起的隱性乳房炎和臨床乳房炎發(fā)病比例分別為37.8%和33.3%[5]。可見金葡菌對奶牛乳房炎的發(fā)生具有不容忽視的影響。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9基因(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)位于奶牛第14號染色體，全長387 232 bp。TRAPPC9基因編碼的蛋白也叫NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，在胸腺、脾和外周血白細(xì)胞等免疫組織中表達(dá)，具有激活NF-κB信號過程的作用[6]。NF-κB在這些組織中起到非常重要的免疫調(diào)控作用[7]，其首先由R.Sen 和D.Baltimore 于1986 年發(fā)現(xiàn)并提出，后來的研究發(fā)現(xiàn)它在機(jī)體細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[8]。

本課題組前期基于北京地區(qū)中國荷斯坦牛乳房炎易感性及抗性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在TRAPPC9基因上存在顯著影響乳房炎抗性的SNP[9]，且在乳肉兼用型三河牛群體中得到驗(yàn)證[10]。從DNA、mRNA和DNA甲基化3個水平以及蛋白質(zhì)水平也發(fā)現(xiàn)，TRAPPC9基因可能通過DNA甲基化來影響中國荷斯坦牛乳房炎抗性[11]。

鑒于TRAPPC9基因?qū)鹌暇榉垦卓剐缘男?yīng)尚未見相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)將其作為奶牛金葡菌乳房炎抗性的潛在候選基因，擬研究并分析TRAPPC9的4個SNPs對奶牛金葡菌乳房炎抗性的遺傳效應(yīng)，探討TRAPPC9作為奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因的可能性，為金葡菌乳房炎抗性相關(guān)基因的分子遺傳機(jī)制研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

本研究以517頭中國荷斯坦牛為試驗(yàn)動物。試驗(yàn)牛分別來自于飼養(yǎng)管理水平相對一致的北方6個規(guī)?；?，所用數(shù)據(jù)包括DHI(乳成分及體細(xì)胞數(shù)，測定采用的儀器是乳成分體細(xì)胞測定儀(YQ1-35))、年齡及胎次等生產(chǎn)數(shù)據(jù)。A、B、C、D、E、F 6個牛場的荷斯坦牛采樣數(shù)目分別為131、29、143、91、59和64頭。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1奶牛金葡菌感染情況的分子鑒定挑取Baired-Parker培養(yǎng)基上檢測出的奶牛乳汁中的金葡菌陽性菌，提取DNA作為擴(kuò)增模板，用Nuc(Thermostable nuclease，熱穩(wěn)定核酸酶)基因的特異性引物進(jìn)行特異性PCR分子檢測，排除假陽性菌株。將2次PCR均是陽性結(jié)果的擴(kuò)增產(chǎn)物分別取20～30 μL進(jìn)行測序驗(yàn)證。517頭中國荷斯坦牛中，有44頭牛乳汁中純化鑒定出金葡菌，金葡菌感染牛比例為8.5%。每個牛場的金葡菌鑒定結(jié)果如表1所示。

表1采樣牛群金葡菌感染情況

Table 1The status ofS.aureusinfection in each cattle population

1.2.2血樣采集及血清指標(biāo)測定方法從奶牛尾部靜脈采集非抗凝血和抗凝血樣各9 mL，非抗凝血用于血清分離和DNA提取，抗凝血用于RNA提取。新鮮抗凝血立即以1∶3的比例與裂解液(TRpure LS Reagent)劇烈震蕩混合，然后分裝到無RNA酶離心管中，-80 ℃保存。非抗凝血在常溫下靜置2～3 h后，3 000 r·min-1離心10 min，上層清亮黃色的液體為血清。分離的血清立即送往北京華英生物技術(shù)研究所進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，下層暗紅色血凝塊用于DNA提取。

采用放免試劑盒檢測血清中的細(xì)胞因子，包括白介素17(IL17)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)。

1.2.3SNP分型采用ABI 公司的Multiplex SnaPshot微測序技術(shù)對牛TRAPPC9基因(BTA14)進(jìn)行SNP分型。引物設(shè)計(jì)、合成及分型均由上海捷瑞生物工程有限公司完成。本研究所用到的TRAPPC9的4個SNPs信息如表2所示。

表2牛TRAPPC9基因SNPs信息

Table 2The information of SNPs of bovineTRAPPC9

1.2.4 荷斯坦牛TRAPPC9基因表達(dá)量的測定本研究利用百泰克血液總RNA提取試劑盒提取血樣中的RNA，用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript?Reverse Transcription試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，利用SYBR Green染料實(shí)時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法來檢驗(yàn)候選基因TRAPPC9的表達(dá)量。

利用相對定量分析法[12]對候選基因TRAPPC9表達(dá)量進(jìn)行分析，計(jì)算公式：ΔΔCt=[(Ct_target-Ct_control)]Sample A-[(Ct_target-Ct_control)]Sample B。Ct_target為目的基因的表達(dá)量，Ct_control為參考基因的表達(dá)量。Sample A為待測樣本，Sample B為參照樣本。本研究中用于分析候選基因表達(dá)量的參考基因是GAPDH。

1.3數(shù)據(jù)分析

1.3.1性狀的描述性統(tǒng)計(jì)及相關(guān)分析使用Excel2010對中國荷斯坦牛SCC、SCS以及血清細(xì)胞因子進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，包括有效記錄數(shù)、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值和最小值。并利用SAS9.1對以上性狀進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3.2基因表達(dá)量分析選取E和F牛場部分荷斯坦牛，分析其不同乳房健康狀態(tài)和有無金葡菌狀況下TRAPPC9基因mRNA的表達(dá)差異。采用Excel2010進(jìn)行t-test分析。首先，按照體細(xì)胞數(shù)及臨床癥狀將奶牛乳房健康狀態(tài)分為3個組，健康牛：SCC≤20萬個·mL-1(n=19)；隱性乳房炎牛：20萬

其中，y為測定日SCS或血清細(xì)胞因子性狀的觀察值(SCS由SCC轉(zhuǎn)化而得，依據(jù)公式SCS=log2(SCC/100 000)+3)；μ為測定日SCS或血清細(xì)胞因子性狀的總體平均值；g為基因效應(yīng)；S為是否被金葡菌感染(Y感染，N未感染)；h為場效應(yīng)，共有1、2、3、4、5、6個場；p為胎次效應(yīng)，將1胎次劃為一個胎次，2胎次及以上劃為另一個胎次(奶業(yè)年鑒平均為2.5胎次)。g*S表示不同基因型與有無金葡菌感染的互作；e為隨機(jī)殘差。

考慮到金葡菌對體細(xì)胞數(shù)影響的不確定性，因此將金葡菌陰性牛和陽性牛分成兩類，進(jìn)一步研究SNPs對SCS及各類血清細(xì)胞因子的效應(yīng)。

模型：y=μ+g+h+p+e

參數(shù)描述同上。

2結(jié)果

2.1 奶牛性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

對中國荷斯坦牛試驗(yàn)群體的乳汁體細(xì)胞數(shù)(SCC)、體細(xì)胞評分(SCS)和血清細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和NF-κB數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的統(tǒng)計(jì)分析，基本統(tǒng)計(jì)量見表3。

表3性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

Table 3Descriptive statistics of traits in this study

2.2奶牛性狀間的相關(guān)分析

對所有采樣牛的SCS和血清IFN-γ、TNF-α、IL-17、 NF-κB含量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表4。SCS與細(xì)胞因子IL-17之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與TNF-α之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與IFN-γ呈極顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.01)；IL-17與NF-κB呈極顯著正相關(guān)(P< 0.01)；細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ、NF-κB分別呈極顯著負(fù)相關(guān)和極顯著正相關(guān)(P<0.01)；IFN-γ與NF-κB呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表4性狀間的相關(guān)性

Table 4Correlations among traits

*.P<0.05；**.P<0.01。下同

*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below

針對金葡菌陽性牛，IL-17 與NF-κB呈極顯著的正相關(guān)(r=0.567，P< 0.01)，與其他性狀無顯著相關(guān)。

2.3金葡菌對SCS和細(xì)胞因子的效應(yīng)分析

為分析金葡球菌對SCS和細(xì)胞因子的效應(yīng)，表5對金葡菌感染陽性牛和陰性牛中體細(xì)胞評分和細(xì)胞因子進(jìn)行了單因素方差分析，可以看出金葡菌陰性牛的細(xì)胞因子的含量大于陽性牛的含量，且檢驗(yàn)出金葡菌對SCS、IL-17和IFN-γ的水平有顯著影響，陰性牛比陽性牛分別高1.30、2.02 pg·μL-1和4.43 pg·μL-1(P< 0.05)。

2.4奶牛不同乳房健康狀態(tài)下TRAPPC9基因mRNA的表達(dá)水平

圖1A為不同乳房健康狀態(tài)下荷斯坦牛TRAPPC9基因的表達(dá)量，健康牛該基因的表達(dá)量極顯著地高于臨床乳房炎牛的表達(dá)量(P<0.01)；圖1B為金葡菌陽性牛和陰性牛TRAPPC9基因的表達(dá)量，可以看出，陽性牛該基因表達(dá)量極顯著地低于陰性牛(P<0.01)。

表5金葡菌陽性牛和陰性牛的SCS和血清細(xì)胞因子的比較

Table 5The comparison of SCS and serum cytokines betweenS.aureuspositive and negative cows

2.5TRAPPC9的SNPs對SCS和細(xì)胞因子的遺傳效應(yīng)

通過計(jì)算得知，金葡菌與TRAPPC9基因SNPs的互作對各個性狀無顯著影響，為了排除金葡菌的干擾，將金葡菌感染陰性牛和陽性牛分成兩組，分別研究TRAPPC9的SNPs對SCS和血清中細(xì)胞因子的效應(yīng)(表6)。

從表6可以看出，在未分離出金葡菌的荷斯坦牛中(金葡菌陰性牛)，SNP4對SCS影響顯著(P<0.01)，TT基因型個體SCS顯著高于CC和CT基因型個體；在分離出金葡菌的荷斯坦牛中(金葡菌陽性牛)，SNP4對細(xì)胞因子IL-17有極顯著的影響(P<0.01)，TT基因型個體的IL-17含量分別比CC和CT基因型個體高5.17 pg·μL-1和4.79 pg·μL-1。

結(jié)果表明，在未感染金葡菌牛群中，SNP4的TT基因型可作為高SCS的分子標(biāo)記；但是當(dāng)奶牛感染金葡菌以后，SCS效果不顯著，建議參考血清細(xì)胞因子IL-17的含量對金葡菌乳房炎奶牛進(jìn)行初步判斷。

3討論

3.1金葡菌乳房炎牛與SCS及細(xì)胞因子的關(guān)系

奶牛乳汁中的體細(xì)胞數(shù)(SCC)及其對數(shù)轉(zhuǎn)換值SCS一直被作為衡量奶牛乳房炎最重要的指標(biāo)。但是實(shí)際生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)SCC變化較大，且金葡菌感染牛的體細(xì)胞數(shù)不一定增多，只有約60%的金葡菌感染牛的SCC較高，而其余40%的金葡菌感染牛每毫升SCC低于200 000 個，因此不能準(zhǔn)確地?cái)喽ǜ叩蚐CC與金葡菌感染之間的關(guān)系[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奶牛有無感染金葡菌對SCS有顯著影響，且陰性牛的SCS高于陽性牛。因此當(dāng)奶牛乳腺感染了金葡菌后，只能說明SCC會產(chǎn)生變化，但不能確定是升高還是降低，即只通過SCC很難準(zhǔn)確判斷奶牛是否患有金葡菌型乳房炎。X.Wang等在2014年發(fā)現(xiàn)，不同奶牛場的金葡菌菌株有不同的凝膠電泳圖譜[14]，說明不同牛場之間金葡菌的變化大，引起產(chǎn)奶性狀變化也不同。由于SCS與細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系(表4)，且血清細(xì)胞因子能夠比較準(zhǔn)確地判斷奶牛乳房炎的炎癥狀況，因此建議通過一個或者多個指標(biāo)綜合判斷奶牛的乳房炎狀況，及時發(fā)現(xiàn)乳房炎患病個體。

3.2金葡菌感染陽性牛及陰性牛TRAPPC9基因SNPs對血清細(xì)胞因子的效應(yīng)

因金葡菌對奶牛SCS有顯著影響但又具有不確定性，為了排除金葡菌干擾，本研究將金葡菌陰性牛和陽性牛分成兩類，用來研究TRAPPC9基因SNPs對SCS和血清細(xì)胞因子的效應(yīng)。當(dāng)奶牛未感染金葡菌時，SCS對乳房炎有很好的指示作用；但是當(dāng)奶牛感染金葡菌以后，SNP4對SCS的效應(yīng)不顯著，而對IL-17有極顯著性效應(yīng)。因此應(yīng)綜合TRAPPC9基因SNP4的TT基因型對SCS和IL-17的效應(yīng)來判斷奶牛是否患有金葡菌乳房炎(表6)。

金葡菌感染奶牛乳腺后，會刺激炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，促使免疫細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞)從血液轉(zhuǎn)移到乳腺[15]。白介素17(IL-17)是一種促炎細(xì)胞因子，主要由CD4+T細(xì)胞亞群接受抗原刺激活化后分泌。IL-17A和IL-17F是Th-17細(xì)胞分泌的IL-17細(xì)胞因子家族中負(fù)責(zé)致炎作用的成員[16]，主要作用于造血細(xì)胞、成纖維等細(xì)胞，并誘導(dǎo)TNF-α等炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而清除病原微生物[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金葡菌陽性牛和陰性牛間的IL-17和IFN-γ含量有顯著差異，陽性牛的兩個細(xì)胞因子含量均低于陰性牛(表5)，這與馮士彬等人的報(bào)道相反[18]。出現(xiàn)金葡菌陽性牛細(xì)胞因子含量低于陰性牛的原因可能有兩方面，一是當(dāng)奶牛的乳房感染金葡菌以后發(fā)生局部炎癥，血清中的細(xì)胞因子透過血管進(jìn)入乳腺[19]，二是金葡菌可以逃脫中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并感染和抑制非專職吞噬細(xì)胞[20]，導(dǎo)致血清中的細(xì)胞因子含量降低。

表6中國荷斯坦牛TRAPPC9 的SNPs與SCS和細(xì)胞因子的關(guān)聯(lián)分析(最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Table 6Association analysis of SCS and serum cytokines with SNPs ofTRAPPC9 in Chinese Holsteins (LSM±SE)

3.3TRAPPC9基因與奶牛金葡菌乳房炎抗性

當(dāng)奶牛乳房被金葡菌等病原微生物感染后，乳腺中的粒性白細(xì)胞會增多，粒性白細(xì)胞的聚集和激活需要大量的炎癥因子[21]，炎癥因子的增加會激活NF-κB通路，增加NF-κB的表達(dá)量。NF-κB在奶牛乳房炎中發(fā)揮重要作用，而TRAPPC9又對NF-κB信號通路起一定的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染了金葡菌的荷斯坦牛中，TRAPPC9(C2477531T)位點(diǎn)對IL-17的效應(yīng)極顯著(P<0.01)。IL-17與NF-κB存在極顯著相關(guān)，這說明TRAPPC9可能通過影響IL-17，進(jìn)而有效的增強(qiáng)NF-κB的活化能力，并最終影響奶牛對金葡菌乳房炎的抗性。

4結(jié)論

綜上，本研究對荷斯坦金葡菌感染陽性牛和陰性牛的SCS和細(xì)胞因子水平進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)金葡菌陰性牛的SCS和細(xì)胞因子的含量均高于陽性牛，說明感染金葡菌會引起細(xì)胞因子含量和SCS水平的變化。對荷斯坦牛金葡菌陰性牛和陽性牛TRAPPC9基因的SNPs與SCS及血清細(xì)胞因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得了效應(yīng)顯著的SNP4，驗(yàn)證了TRAPPC9基因作為中國荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性分子標(biāo)記的可能性。

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(編輯郭云雁)

The Genetic Effect ofTRAPPC9 on Mastitis Resistance toS.aureusin Dairy Cows

FENG Wen1，DONG Yi-chun1，WANG Xiao1，LIU Chao1，WANG Xin2，WANG Ya-chun1，YU Ying1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.CollegeofFoodSciencesandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Key words:dairy cattle；Staphylococcusaureus；mastitis resistance；TRAPPC9；cytokine

Abstract:The present study was designed to investigate the genetic effect ofTRAPPC9 gene on resistance toStaphylococcusaureus(S.aureus) in Chinese Holstein cattle.A total of 517 Chinese Holstein cows with intact data of DHI，age and parity were collected from 6 farms of North China.Multiplex SnaPshot was used to analyze the genotype of 4 SNPs ofTRAPPC9 gene，the specific PCR was used to detectS.aureusinfecting cattle.Meanwhile，the contents of IFN-γ，IL-17，NF-κB and TNF-α in serum for each cattle were measured.Based on this，the genetic effects of the 4 SNPs inTRAPPC9 on mastitis resistance toS.aureuswere analyzed by the least squares method of GLM model.The results indicated that IL-17，TNF-α and IFN-γ could be used as effective indicators for mastitis.With regard to theS.aureusnegative Chinese Holstein cows，SNP4 (C2477531T) ofTRAPPC9 had highly significant effect on SCS (P<0.01)，while the SNP showed a highly significant effect on IL-17 inS.aureuspositive cows (P<0.01).These data imply that bovineTRAPPC9 gene could be a powerful molecular marker of mastitis resistance toS.aureusin Chinese Holsteins.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.009

收稿日期：2015-03-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31272420)；農(nóng)業(yè)部奶業(yè)體系項(xiàng)目(CARS-37-04B)；十二五國家科技支撐項(xiàng)目(2011BAD28B02)；教育部基本科研項(xiàng)目(2011JS006)；長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1191)

作者簡介：馮文(1992-)，女，陜西人，碩士生，主要從事動物分子數(shù)量遺傳學(xué)研究，E-mail：wfeng@cau.edu.cn *通信作者：俞英，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物健康性狀遺傳改良及表觀遺傳調(diào)控研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

中圖分類號：S823；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0276-08