基因敲除技術(shù)在維生素D受體研究中的應(yīng)用進(jìn)展

肖碩　文九芳

·綜述·

基因敲除技術(shù)在維生素D受體研究中的應(yīng)用進(jìn)展

肖碩文九芳

434020 荊州，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院藥劑科(肖碩)；434000 荊州，荊州市第一人民醫(yī)院藥劑科(文九芳)

【摘要】基因敲除技術(shù)是一種新的生物遺傳工程技術(shù)，在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。維生素D通過維生素D受體的介導(dǎo)發(fā)揮多種生理作用，借助維生素D受體的基因敲除技術(shù)可更清楚地研究維生素D的多種生理功能，為以后的生物研究提供新的方向與方法。該文就基因敲除技術(shù)應(yīng)用于維生素D受體后對機(jī)體腸道功能、抗腫瘤功能、心血管功能方面影響的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】基因敲除技術(shù)；維生素D；維生素D受體

基因敲除技術(shù)是一種新型分子生物學(xué)遺傳技術(shù)，它針對某個功能未知或者未明確的基因序列來改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失，屏蔽這部分功能，并進(jìn)一步研究其對生物體造成的影響，從而推測出該基因的生物學(xué)功能[1]。維生素D與維生素D受體(VDR)是近年來兒科、心血管科、消化科研究的熱門因子，維生素D在機(jī)體骨代謝之外的多種生物學(xué)功能已日益引起人們的重視，其功能的實(shí)現(xiàn)離不開VDR的介導(dǎo)。VDR是一種細(xì)胞內(nèi)類固醇/甲狀腺激素受體，維生素D的多種生理功能均通過其活性成分1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2-D3]與VDR結(jié)合介導(dǎo)調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。因此，深入研究VDR對明確維生素D的各種生理功能及其在生物醫(yī)學(xué)上的作用有重要價值。傳統(tǒng)的VDR研究基點(diǎn)在于VDR基因存在單個堿基突變，即單核苷酸多態(tài)性(SNP)，通過多聚酶鏈-限制性內(nèi)切酶特異性酶切進(jìn)行功能識別，研究其基因多態(tài)性。近年來，基因敲除技術(shù)發(fā)展逐漸成熟，對生物體內(nèi)的VDR進(jìn)行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，對臨床有重要意義。

一、基因敲除技術(shù)的原理與特點(diǎn)

基因敲除和基因嵌入技術(shù)是上世紀(jì)80年代末出現(xiàn)的最新外源DNA導(dǎo)入技術(shù)[2]。基因敲除技術(shù)類似于基因的同源重組，將外源DNA與受體細(xì)胞基因中序列相同或類似的基因發(fā)生同源重組，代替受體細(xì)胞基因組中該序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中，屬于外源基因在體內(nèi)的定點(diǎn)整合,是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)[3]。除了同源重組外，基因的插入突變和RNA干擾(RNAi)技術(shù)同樣可以達(dá)到基因屏蔽的目的?；蚯贸夹g(shù)克服了基因隨機(jī)整合的盲目性與隨機(jī)性，是一種理想的改造生物遺傳物質(zhì)的方法，為我們提供了全新的研究手段。目前，基因敲除技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要在于動物模型的建立，其中小白鼠的模型研究較為成熟，大型哺乳動物的基因敲除模型尚處于探索階段[4]。

二、維生素D與VDR簡介

維生素D為一類固醇激素，通過作用于細(xì)胞核內(nèi)的特異性受體，與受體形成激素-受體復(fù)合物，激活或抑制含有維生素D反應(yīng)元件的基因，影響DNA的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮多種生物學(xué)作用。人體缺乏維生素D不僅可表現(xiàn)為佝僂病和骨軟化癥，還可能引發(fā)癌癥、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及結(jié)核[5]。而研究維生素D 的功能，離不開對VDR的研究。VDR為親核蛋白，能在多個器官與組織中表達(dá)，是介導(dǎo)維生素D的活性成分1,25-(OH)2-D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子超家族成員，維生素D的多種生理功能均通過VDR來實(shí)現(xiàn)[6]。1,25-(OH)2-D3激素信號分子在靶細(xì)胞上與VDR結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物，作用于靶基因上的特定DNA序列，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[7]。VDR基因是1,25-(OH)-D3發(fā)揮生理效應(yīng)的候選基因之一，采用新型的基因敲除技術(shù)研究VDR的基因表達(dá)，檢測機(jī)體內(nèi)該受體的表達(dá)對各種生理功能的影響，可以開辟新的研究維生素D及VDR的方向[8]。

三、基因敲除VDR后機(jī)體功能研究

1. 基因敲除VDR后機(jī)體的腸道功能

Cordin等[9]基因敲除小白鼠的VDR，以同窩繁殖未接受基因敲除的小鼠作為對照組，對2組小鼠腸道上皮細(xì)胞的裂解物用Ab099進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)對照組的VDR分析帶明顯，而基因敲除組的分析帶幾乎不可見，用共聚焦顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)基因敲除組腸道細(xì)胞表面無1,25-(OH)2-D3。他們進(jìn)一步對從2組分離出的腸道細(xì)胞進(jìn)行類固醇激素刺激的鈣攝取試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)基因敲除組腸道細(xì)胞反應(yīng)鈍化或完全無反應(yīng)，而對照組腸道細(xì)胞于5 min內(nèi)鈣攝取增強(qiáng)。因此他們得出結(jié)論，VDR的存在介導(dǎo)1,25-(OH)2-D3發(fā)揮生物活性，明顯增強(qiáng)機(jī)體對鈣的吸收能力。康紅等[10]制備VDR和CaBP-D28k雙基因敲除小鼠，他們用普通食物和高鈣食物喂養(yǎng)野生型與雙基因敲除后的小鼠，檢測兩者體內(nèi)瞬時感受器電位V5(TRPV5)蛋白和 TRPV6蛋白的mRNA水平。結(jié)果顯示，普通飲食下，雙基因敲除小鼠尿鈣的分泌和血清甲狀旁腺激素水平高于野生型小鼠，但兩者TRPV5和 TRPV6的表達(dá)無明顯差異；高鈣飲食下，基因敲除小鼠的血鈣水平正常，但TRPV5和 TRPV6的表達(dá)降低。研究表明，上皮鈣通道基因受鈣和維生素D的調(diào)節(jié),CaBP-D28k的缺失對兩者無影響。腎鈣的重吸收減少與TRPV5和TRPV6基因表達(dá)無關(guān)。

2. 基因敲除VDR后機(jī)體的抗腫瘤功能

Keith等[11]進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)，包括提取基因敲除VDR小鼠的細(xì)胞誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)野生型或基因突變型VDR，以便研究VDR結(jié)合1,25-(OH)2-D3的功能、VDR配體的功能及VDR對生物功能的調(diào)控作用。PDGFB, VEGFA和NFKBI均為基因研究的靶點(diǎn)[12]。基因敲除VDR的細(xì)胞產(chǎn)生的點(diǎn)突變(W286R, R274L)導(dǎo)致小鼠對生理劑量下的1,25-(OH)2-D3耐受不明顯，而對大劑量的1,25-(OH)2-D3反應(yīng)明顯，蛋白免疫印跡分析顯示VDR產(chǎn)生的表達(dá)帶明顯減弱?；蚯贸齎DR的細(xì)胞的G46D點(diǎn)突變直接消除VDR上與1,25-(OH)2-D3的連接配基，從而產(chǎn)生生長抑制。因此，即使生物體在VDR蛋白、輔酶因子、靶點(diǎn)基因等方面存在差異與變化，人類和小鼠引起抗癌反應(yīng)的VDR信號軸均是高度保守的[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，基因敲除VDR的雌性小鼠更容易患生殖系統(tǒng)腫瘤[13]。有研究顯示，基因敲除VDR后3種乳腺癌標(biāo)志物——雌激素受體、孕激素受體和原癌基因人類表皮生長因子受體2(HER2)會出現(xiàn)減少或缺失，提示VDR在介導(dǎo)機(jī)體吸收維生素D和減少女性乳腺癌風(fēng)險方面有重要作用[14]。

3.基因敲除VDR后機(jī)體的心血管功能

有研究顯示，野生型小鼠和基因敲除VDR小鼠主動脈中內(nèi)皮型一氧化氮合酶、內(nèi)皮素-1基因表達(dá)產(chǎn)物均有表達(dá)，但與野生型小鼠比較，前者在基因敲除VDR的小鼠中的表達(dá)明顯少,后者的表達(dá)則明顯高，且基因敲除VDR小鼠的收縮壓、舒張壓明顯高于野生型小鼠(P均<0.05)[16-17]。Bae等[18]對野生型和基因敲除VDR小鼠分別進(jìn)行了假性心肌梗死手術(shù)，術(shù)后4周觀察兩者的手術(shù)情況，結(jié)果顯示，基因敲除VDR小鼠的生存率和心臟功能等情況較野生型小鼠差，且細(xì)胞凋亡、炎癥和纖維化更嚴(yán)重，因此他們得出結(jié)論，VDR對心肌梗死后細(xì)胞有間接保護(hù)作用。

四、小結(jié)與展望

作為一種新型的生物技術(shù)，基因敲除技術(shù)有助于建立生物模型、研究疾病的分子機(jī)制及進(jìn)行基因治療。在傳統(tǒng)意義上，維生素D的主要功能為調(diào)節(jié)鈣磷代謝與骨代謝平衡，但近年來，我們發(fā)現(xiàn)其尚有其它多種的生物功能，例如介導(dǎo)抗炎反應(yīng)、抗腫瘤反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、心血管調(diào)控等。如上文所述，對生物體內(nèi)的VDR進(jìn)行基因敲除有助于更清楚地研究維生素D的生理功能。但基因敲除技術(shù)仍存在某些不足，一方面，基因敲除技術(shù)不易準(zhǔn)確使用，基因重組的隨機(jī)性依然很大，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響；另一方面，維生素D作用范圍廣，較多相關(guān)的機(jī)制尚未明確，仍有待進(jìn)行更大量的臨床研究，因此，基因敲除技術(shù)在VDR研究中的應(yīng)用仍需深入。

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Application progress in gene knock-out of vitamin D receptor

XiaoShuo,WenJiufang.

DepartmentofPharmacy,JingzhouHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology，Jingzhou434020，China

【Abstract】Gene knock-out, as a novel type of genetic engineering technology, has been more and more widely applied in the field of biomedicine. Vitamin D plays a variety of physiological roles through the mediation by vitamin D receptor. Application of gene knock-out of vitamin D receptor can explicitly investigate multiple physiological functions of vitamin D, providing orientation and method for the biological research in the future. In this paper, the effects of gene knock-out of vitamin D receptor upon intestinal function, anti-tumor function and cardiovascular function were reviewed.

【Key words】Gene knock-out technology; Vitamin D; Vitamin D receptor

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.002

(收稿日期：2016-05-04)(本文編輯：洪悅民)