Lnc RNA FER1L4對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖侵襲和凋亡能力的影響

夏 亮 孫才興 馮 方 吳 斌?

·基礎(chǔ)研究·

Lnc RNA FER1L4對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖侵襲和凋亡能力的影響

夏 亮 孫才興 馮 方 吳 斌?

目的 研究Lnc RNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，侵襲及凋亡能力的影響。方法 采用RT-PCR檢測Lnc RNA FER1L4在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18和對照星形膠質(zhì)細(xì)胞1800中的的表達(dá)，SiRNA技術(shù)沉默F(xiàn)ER1L4表達(dá)后，采用CCK-8，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值、侵襲、凋亡的變化。結(jié)果 Lnc RNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于正常對照星形膠質(zhì)細(xì)胞。SiRNA下調(diào)Lnc RNA表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲能力明顯下降，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。結(jié)論 Lnc RNA FER1L4可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

長鏈非編碼RNA FER1L4 生物學(xué)功能

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，盡管采取積極的手術(shù)治療，但目前絕大部分患者預(yù)后仍較差，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其平均生存期≤2年［1］。研究證實(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展與各種癌基因或抑癌基因異常表達(dá)密切相關(guān)［2］。長鏈非編碼 RNA（LncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)并且轉(zhuǎn)錄本長度＞200 個(gè)核苷酸的RNA。目前研究已證實(shí)LncRNA 與不同人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，一些 LncRNA 在腫瘤與正常組織中存在差異表達(dá)，而這些差異表達(dá)的 LncRNA 可能參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程［3］。FER1L4作為長鏈非編碼RNA的重要成員之一，其與腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，近年來多個(gè)研究已證實(shí)FER1L4表達(dá)與結(jié)腸癌和胃癌發(fā)生密切相關(guān)［4］。本研究旨在探討FER1L4與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲的關(guān)系，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，U87-MG，SHG-44，S373-MG，LN-18，以及對照正常星形膠質(zhì)細(xì)胞1800均購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、Trizol及Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑均為Invitrogen公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)耗材為BD公司產(chǎn)品；FER1L4引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成；SiRNA干擾序列由Life技術(shù)公司提供，siRNA干擾序列正義鏈5'-UUAACUCGAAGCUGUCCUGTT-3'，反義鏈：5'-CAGGACAGCUUCGAGUUAATT-3'，對照組正義鏈：5'- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'反義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒購于日本同仁化學(xué)公司；Transwell小室購自Millipore公司，Matrigel由BD公司生產(chǎn)；AnnexinVFITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司；引物合成及測序在上海Invitrogen 公司完成。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及正常星形膠質(zhì)細(xì)胞1800均培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37℃，5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)傳代及進(jìn)行相關(guān)操作。轉(zhuǎn)染前24h，細(xì)胞接種于六孔板，約4×105個(gè)細(xì)胞/孔，加入含10%血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞約70%～80%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入質(zhì)粒4μg/孔和轉(zhuǎn)染試劑10μl，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對照，同時(shí)將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基。（2）PCR：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR擴(kuò)增。FER1L4引物正義鏈：5'CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3'；反義鏈：5'GGCAAGTCCACTGTCAGATG3'。內(nèi)參GAPDH正義鏈：5'：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' 反義鏈：5'AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。PCR反應(yīng)條件為95℃2min預(yù)變性，95℃30s，55.4℃30s，74℃30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃10min延伸。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，以FER1L/GAPDH灰度值比值作為FER1L的相對表達(dá)量。（3）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1d，將細(xì)胞接種于六孔板，4×105個(gè)細(xì)胞/孔，加入2ml含10%血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞匯合度在70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入質(zhì)粒4μg/孔和轉(zhuǎn)染試劑10μl，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對照，同時(shí)將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6h后更換培養(yǎng)基。（4）CCK-8細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，約5000個(gè)細(xì)胞份額分別接種于96孔板中培養(yǎng)，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h后分別加入CCK-8溶液10μl/孔，再次放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，酶聯(lián)免疫檢測儀于450nm處測定每孔吸光值，比較各組細(xì)胞的生長情況。（5）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室中鋪Matrigal goal，放入培養(yǎng)箱，待基底膜干燥后，滴入單細(xì)胞懸液培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察各組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)量，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值。（6）Annexin V/PI凋亡實(shí)驗(yàn)：當(dāng)各組細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，洗凈培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，懸浮細(xì)胞。懸浮液中加入5μl Annexin V-FITC，緩慢混勻后孵育15min。加入10μl PI后緩慢混勻于（2～8）℃避光條件下孵育5min。在30mins內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。判定標(biāo)準(zhǔn)：左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；左上象限是晚期凋亡細(xì)胞，為（FITC+/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外證實(shí)長鏈非編碼RNA FER1L4高表 達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞 PCR檢測不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18，以及對照星形膠質(zhì)細(xì)胞1800中FER1L4的表達(dá)情況，分別為（1.563±0.250），（1.887±0.285），（1.260±0.178），（1.358±0.301），（0.583±0.210），（0.263±0.080）。結(jié)果顯示FER1L4在所有膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)均高于對照正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，且其在膠質(zhì)瘤 細(xì)胞S373-MG和U251表達(dá)最高。

2.2 SiRNA干擾LncRNA FER1L4的表達(dá) 為進(jìn)一步研究LncRNA FER1L4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞 中的生物學(xué)功能，選取高表達(dá)FER1L4細(xì)胞株S373-MG和U251，通過SiRNA處理兩株細(xì)胞48h后，S373-M G和U251細(xì)胞中FER1L4表達(dá)均明顯下調(diào)［（1.919±0.185）vs（0.694±0.131），P=0.005；（1.583±0.1145）vs（0.630±0.104），P=0.004）］。

2.3 LncRNA FER1L4對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值，凋亡和侵襲能力的影響 采用 SiRNA干擾FER1L4表達(dá)后，采用CCK-8、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞凋亡技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增值侵襲 凋亡的變化。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖的結(jié)果顯示，S373-MG和U251細(xì)胞Si-FER1L4組（干擾組）細(xì)胞的存活率均明顯低于Control組（對照組）（P=0.003，P=0.001）（見圖1）。AnnexinV PITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，Si-FER 1L4組發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例均高于Control組［S373-MG：（23.00±1.732）vs（10.220±1.283），P=0.004；U251：（29.00±1.732）vs（19.330±1.856），P=0.019）］。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，Si-FER1L4組細(xì)胞每個(gè)視野的穿膜數(shù)量均低于Control組［S373-MG：（17.00±2.082）vs（62.67±2.963），P=0.0002；U251：（24.67±1.764）vs（72.33±2.603），P=0.0001］（見圖2）。

圖1 FER1L4下調(diào)表達(dá)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251（A）及U373-MG（B）增殖的影響

圖2 FER1L4下調(diào)表達(dá)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及U373-MG侵襲能力的影響

3 討論

進(jìn)一步研究和揭示神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療途徑和基因治療靶點(diǎn)，一直以來是神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［2］。LncRNA作為RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，開始被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“垃圾”，并不具備生物學(xué)功能。然而，近年的相關(guān)研究證實(shí)，LncRNA具有諸多生物學(xué)功能，包括參與染色質(zhì)修飾、染色體沉默、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過程；以多種形式影響蛋白功能；影響miRNA含量［4］。

目前研究證明，膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與LncRNA異常表達(dá) 關(guān)系密切［5］。目前 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中相對研究較多的LncRNA有MEG3和H19等。MEG3作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的LncRNA，相對于正常組織，其在對應(yīng)的腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。在82%的膠質(zhì)瘤中，MEG的表達(dá)呈現(xiàn)缺失或大幅下調(diào)，MEG3的表達(dá)下調(diào)進(jìn)而調(diào)節(jié)p53的活性，有利于膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外的生長。因此，MEG3 可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)因子，也可能成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)［6］。H19 為最早發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一，屬于母源性印跡基因，其高表達(dá)于胚胎發(fā)育期的內(nèi)胚層及中胚層來源的組織［4］。研究證實(shí)，H19 同時(shí)具有致瘤和腫瘤抑制的雙重功能。Yan等對神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中H19的表達(dá)及生物學(xué)功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)H19 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的WHO分級及惡性程度密切有關(guān)，H19可通過下調(diào)下游靶基因miR-675及CDH13從而發(fā)揮促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長與增殖的作用［4］。另有研究證實(shí)，H19還可調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞 瘤形成的關(guān)鍵信號蛋白CLI1的表達(dá)活性，從而發(fā)揮相應(yīng)的腫瘤生物學(xué)功能［4］。

FER1L4作為一種新發(fā)現(xiàn) 的長鏈非編碼RNA，目前研究主要集中在胃癌和結(jié)腸癌。Liu等［7］的研究中，首先證實(shí)相對應(yīng)癌旁組織，F(xiàn)ER1L4在91.80%的胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，且FER1L4的低表達(dá)與胃癌的腫瘤體積、惡性程度、淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期、血管神經(jīng)浸潤和血清CA72-4表達(dá)均明顯相關(guān)，因此，結(jié)果證實(shí)FER1L4的表達(dá)高低可作為胃癌早期診斷的較為優(yōu)良的重要指標(biāo)。隨后研究表明FER1L4能夠作為一種重要的內(nèi)源性競爭RNA，且在結(jié)腸癌中扮演了抑癌基因的作用，其表達(dá)與miR-106a-5p表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)，兩者的表達(dá) 均與結(jié)腸癌腫瘤浸潤深度、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)［8］。通過外源性增加FER1L4的表達(dá)能夠明顯下調(diào)miR-106a-5p表達(dá)，從而影響結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲。上述研究均證實(shí)，F(xiàn)ER1L4在胃癌和結(jié)腸癌中可能扮演了抑癌基因的作用，且其表達(dá)高低可作為胃癌及結(jié)腸癌早期診斷和預(yù)后評價(jià)較為優(yōu)良的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞及正常對照星形膠質(zhì)細(xì)胞中FER1L4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FER1L4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中明顯高于對照星形膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，下調(diào)FER1L4可顯著抑制膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示LncRNA FER1L4基因可能具有抑癌的功能，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，有望為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷和基因治療提供更有效的作用靶點(diǎn)。然而，LncRNA FER1L4影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的途徑及具體分子機(jī)制仍然未知，需進(jìn)一步的深入研究。

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Objective To determine the expression of LncRNA FER1L4 and evaluate its clinical value in glioma. Methods The expression of LncRNA FER1L4 in glioma cell lines S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44 and normal astrocyte 1800 was determined by RT-PCR. SiRNA targeting FER1L4 was transfected into S373-MG and U251 glioma cell lines，and cell proliferation，invasion，and apoptosis were examined by CCK-8 assays，transwell chamber assays，and Annexin V/PI analysis，respectively. Results The expression of FER1L4 in glioma cell lines was obviously higher than that in the normal astrocyte. Furthermore，by down-regulating FER1L4 using siRNA，the invasiveness and proliferation of the astrocyte decreased considerably，while the apoptosis increased. Conclusions FER1L4 plays an important role in the occurrence and progression of glioma.

LncRNA FER1L4 Biological function

國家自然科學(xué)基金（812713681）；浙江省腫瘤醫(yī)院青年科研基金（QN201402）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院

*通信作者