缺氧抑制RABEP1基因表達對腎癌細胞786-O凋亡及增殖的影響

郭 勇 彭龍開?

缺氧抑制RABEP1基因表達對腎癌細胞786-O凋亡及增殖的影響

郭 勇 彭龍開?

目的 探討缺氧對RABEP1表達水平的影響及其表達情況對腎癌細胞786-O增殖及凋亡能力的影響。方法 常氧及缺氧條件下培養(yǎng)人腎癌細胞786-O，熒光定量RT-PCR及蛋白印跡法檢測RABEP1的表達情況；在缺氧條件下過表達RABEP1基因，MTT實驗及Hoechst實驗檢測786-O細胞的增殖及凋亡情況。結果 相對常氧培養(yǎng)的786-O細胞，缺氧可抑制細胞內RABEP1 mRNA及蛋白的表達水平，p值分別為0.0015及0.008；在第3、4及5天，相對786-OMOCK細胞，缺氧條件下786-OpcDNA-RABEP1細胞的增殖能力明顯減弱，P值均＜0.001；同樣，相對786-OMOCK細胞，缺氧條件下786-OpcDNA-RABEP1細胞的凋亡明顯增加。結論 缺氧可抑制Rabaptin-5的表達，缺氧環(huán)境下過表達Rabaptin-5可抑制腎癌細胞的增殖并促進細胞凋亡。

腎細胞癌 增殖 凋亡 缺氧 RABEP1

腎癌的發(fā)病率在我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占第二位，僅次于膀胱腫瘤。腎腺癌（renal cell carcinoma，RCC）占腎癌的80%～90%，為起源于腎實質泌尿小管上皮細胞的惡性腫瘤［1］。隨著以手術為首選治療的綜合治理方案在臨床中廣泛應用，腎癌的預后得以明顯改善。腫瘤的侵犯及轉移情況是影響5年生存率的關鍵因素，腫瘤局限在腎內可達92%，合并周圍淋巴轉移則下降至65%，一旦出現遠處轉移則為12%［2］。研究證明，缺氧是RCC生長微環(huán)境的重要特點，缺氧誘導的HIF可調控下游基因的轉錄，進而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移、血管生成及能量代謝等［3］。故研究缺氧調節(jié)的基因能為防治腎細胞癌提供理論依據，為臨床治療提供可能的靶標。研究報道，缺氧可抑制RABEP1表達，進而降低Rab5介導的內體融合，通過調節(jié)細胞凋亡、增殖及侵襲轉移的信號通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-5］。但是，目前尚未見缺氧調節(jié)RABEP1基因表達對腎癌細胞增殖與凋亡影響的相關報道。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及缺氧處理 人腎腺癌細胞786-O培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100U/ml）及鏈霉素（100U/ ml）的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，常氧培養(yǎng)條件： 37℃、20% 氧氣、5%二氧化碳、75% 氮氣。缺氧培養(yǎng)條件：37℃、1% 氧氣、5%二氧化碳、94%氮氣（乏氧培養(yǎng)箱提供缺氧細胞培養(yǎng)的條件）。

1.2 熒光定量RT-PCR 將對數生長期的786-O細胞按照上述的缺氧誘導條件處理，使用omega公司一步法RNA抽提試劑盒提取總RNA，具體參照說明書；酶標儀法測定RNA的純度，反轉錄后按SYBR Green法進行RT-PCR，參照TAKARA說明書。β-actin 做為定量計算RABEP1 表達水平的內參基因，用2-△△CT法進行相對定量計算。引物序列為： RABEP1（human），sense，5'- TCGTGACTATGAGCACCAGTT-3'，5'-ATCACAACGGACCGAAGTTTC-3'；β-actin（human），sense，5'-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，antisense 5'- GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。

1.3 蛋白印跡法（Western blot） 采用強裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，總上樣量為50μg，采用流程為：電泳（恒壓100V，90min）、轉膜（濕轉，恒壓120V，90min）、封閉（5%脫脂奶粉的TBST，常溫2h）、孵育一抗（4℃，過夜）、洗膜（5min×3次）、孵育二抗（常溫，2h）、洗膜（10min×3次）、ECL顯色。（RABEP1，1：500；β-actin，1：1000，英國Abcam公司）。

1.4 過表達RABEP1基因 6孔中接種細胞懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待目的細胞融合度達約30%，加入空載體及慢病毒pcDNA-RABEP1進行轉染，具體參照制造商的協(xié)議。利用蛋白印跡法檢測轉染的情況。過表達慢病毒pcDNA-RABEP1購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.5 MTT檢測細胞增殖活力 接種上述細胞至96孔板，放進37℃ 5%CO2乏氧細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從鋪板的第2天開始，培養(yǎng)終止前4h每孔加MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。每孔加100μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm，在酶標儀上測定各孔光吸收值。計算方法：以day1～day5相對day1的OD490比值定義為OD490/fold（表示各天的增殖倍數），并繪制細胞相對活力曲線。

1.6 Hoechst檢測細胞的凋亡 利用玻璃片制作單層細胞爬片，以1%鹽酸-70%乙醇溶液浸泡固定5min，PBS漂洗5min，Hoechst 33258工作液對細胞進行染色，室溫15min，漂洗3次，5min/次，用甘油與PBS比例為1：9的混合液封片，室溫下晾干，在熒光顯微鏡下觀察，并隨機拍照熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧抑制RABEP1的表達 熒光定量RT-PCR 及Western blot結果顯示，在786-O細胞缺氧48h培養(yǎng)后，RABEP1mRNA及蛋白的表達水平均明顯下降，P值分別為0.0015及0.0080，見圖1。

圖1 缺氧對RABEP1 mRNA及蛋白表達的影響

2.2 檢測pcDNA-RABEP1感染786-O細胞的情況 Western blot檢測缺氧條件下pcDNA-RABEP1感染786-O細胞36h后RABEP1蛋白的表達情況，發(fā)現pcDNA-RABEP1能明顯提高目標蛋白分子的表達量，與空載組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 過表達RABEP1后細胞增殖活力 786-O 、 786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情況下進行培養(yǎng)，連續(xù)5d利用MTT法檢測細胞的增殖活力。結果顯示：786-OpcDNA-RABEP1的增殖能力明顯受限，尤其在轉染pcDNA-RABEP1后第3、4、5天細胞增殖能力減弱明顯，P值均＜0.001，見圖3-A。

2.4 過表達RABEP1后細胞的凋亡情況 786-O 、786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情況下進行培養(yǎng)，786-O組及786-OMOCK組細胞的核呈均勻的藍色熒光，786-OpcDNA-RABEP1的細胞核呈凋亡狀態(tài)，即染色質固縮及核碎裂，細胞質則濃縮，呈明亮的藍色?？梢娺^表達RABEP1后呈凋亡狀態(tài)的細胞數增加，可判斷缺氧狀態(tài)下過表達RABEP1基因使786-O細胞的凋亡增加，見圖3-B。

圖2 pcDNA-RABEP1感染786-O細胞后RABEP1蛋白的表達量

圖3 缺氧情況下分別培養(yǎng)786-O、786-OMOCK及786-OpcDNA-

3 討論

RABEP1，又名Rabaptin-5及Neurocrescin，作為蛋白編碼基因，位于17p13.2，其蛋白分子量約99kD。RABEP1蛋白主要分布在胞漿、細胞膜和內體上，其C端存在兩個連續(xù)結構域CC1及CC2，作為Rab的功能蛋白，可通過連接γ-adaptin，RAB4A 及RAB5A，促進膜融合而介導囊泡轉運、早期內體融合及膜內吞的作用。研究證明，RABEP1受 Caspase-3信號通路的特異性調控［5］，在機體細胞內保存適當的表達水平，進而調節(jié)EGFR等生長及凋亡相關因子的表達及活性水平，進一步影響下游信號通路活性，對維持組織內環(huán)境穩(wěn)定及細胞的生物學功能起重要作用。反之，當機體細胞受體外內環(huán)境因素刺激，調控Rabaptin-5表達的機制失平衡，則可導致惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。有研究者利用qRT-PCR芯片對乳腺癌mRNA進行高通量分析，發(fā)現RABEP1在癌組織中高表達且是患者復發(fā)的危險因素［6］。研究發(fā)現，HDAC6基因在胃癌細胞內通過抑制Rabaptin-5介導的初級內體融合而延長EGFR活性，最終可增強惡性細胞的致瘤性［7］。也有研究發(fā)現，PKD可促進Rabaptin-5的磷酸化，導致后者與Rab4結合，進而減慢PDGF驅動的Integrin循環(huán)再生，最終抑制乳腺癌細胞的侵襲轉移［8］。總之，Rabaptin-5作為腫瘤發(fā)生及進展的關鍵負性調節(jié)因子，故進一步研究調節(jié)Rabaptin-5表達的相關因素對防治腎癌有重要科學意義。

缺氧不僅是所有實體惡性腫瘤的重要微環(huán)境特征之一，亦是腫瘤生物學行為進化的誘發(fā)因素。臨床上常采用栓塞腫瘤滋養(yǎng)血管的方法來治療實體瘤，如肝細胞癌及腎癌等。已有基礎及臨床研究均證明，腫瘤組織的缺氧狀態(tài)是患者預后的危險因素。缺氧致腫瘤細胞生物學行為進化的主要機制是通過誘導惡性細胞的遺傳不穩(wěn)定性、篩選缺乏凋亡能力的細胞及調控多類參與腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的基因和蛋白表達有關。缺氧可誘導HIF-1α基因的表達，而HIF-1α作為唯一在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉錄因子，不僅能夠上調多種基因的轉錄活性，同時亦可抑制基因的轉錄活性，參與調控惡性細胞增殖、凋亡、侵襲轉移、能量代謝及免疫等生物學行為。

研究發(fā)現，細胞在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可抑制Rabaptin-5的表達，而抑制細胞的膜內吞作用［4］。Wang Y等［9］研究顯示，在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)腎細胞癌，Rabaptin-5的表達水平明顯受抑制，與本資料結果基本一致。與此同時，為進一步分析Rabaptin-5對缺氧環(huán)境下腎癌細增殖及凋亡的影響，作者選擇腎癌細胞在缺氧環(huán)境進行培養(yǎng)，通過在腎癌細胞內表達Rabaptin-5基因，觀察細胞的增殖活性及凋亡情況。本資料結果顯示，在缺氧環(huán)境中過表達Rabaptin-5，可以顯著抑制786-O細胞的增殖、并促進786-O細胞的凋亡，此結果亦是對Michael Ohh等研究結果的進一步補充。結合既往文獻報道，推測缺氧環(huán)境下Rabaptin-5可調節(jié)腎癌細胞增殖及凋亡的可能機制如下：缺氧誘導HIF-1α的表達，進而抑制Rabaptin-5基因的轉錄及蛋白的合成，使Rab4或Rab5驅動的膜內吞行為減弱，進一步導致細胞膜上調節(jié)細胞生長、凋亡、遷徙及侵襲轉移相關受體的內吞減少而受體下游信號通路持續(xù)激活，這些受體包括EGFR、FGFR及VEGFR等。

綜上所述，本研究再次明確了缺氧可抑制腎癌細胞內Rabaptin-5的表達，同時探明缺氧環(huán)境下過表達Rabaptin-5可抑制腎癌細胞的增殖并促進細胞凋亡。但是，為進一步探明Rabaptin-5對腎癌細胞更多生物學行為的影響，需進一步實驗。同時，需納入臨床病例，探明Rabaptin-5表達水平的臨床病理意義，為實現針對腎癌以Rabaptin-5為防治靶標提供理論依據。

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Objective To explore the expression of RABEP1 in human renal cancer cell 786-O and investigate the influence of RABEP1 expression on proliferation and apoptosis under hypoxia. Methods The human renal cancer cell 786-O was cultured in normoxic and hypoxic condition. The mRNA and protein levels of RABEP1were detected by qRT-PCR and Western blot.The 786-O cell with ectopic expression of RABEP1 was cultured under hypoxia，and MTT and Hoechst tests were applied to investigate proliferation and apoptosis ability of 786-O cell. Results Compared to 786-O cell under normoxia，RABEP1 mRNA and protein expression level were down-regulated under hypoxia，P=0.0015 and 0.008，respectively. Compared to 786-OMOCK under hypoxia from day 3 to day 5，proliferation ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was inhibited under hypoxia，all the p values were less than 0.001. Then，Compared to 786-OMOCK under hypoxia，apoptosis ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was enhanced under hypoxia. Conclusions Hypoxia could inhibit RABEP1 expression，and ectopic expression of RABEP1 could suppress proliferation and enhance apoptosis of human renal cancer 786-O under hypoxia.

Human renal cancer cell Proliferation Apoptosis Hypoxia RABEP1

410011 中南大學湘雅二醫(yī)院泌外器官移植科

*通信作者