風(fēng)濕性心臟病二尖瓣組織Th17細(xì)胞軸相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

文　韻　桂　春　黃偉強(qiáng)　文　宏　韋　恒　鄭慧蕾　曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，廣西　南寧　530021)

?

風(fēng)濕性心臟病二尖瓣組織Th17細(xì)胞軸相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

文韻桂春1黃偉強(qiáng)文宏韋恒鄭慧蕾曾志羽

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討慢性風(fēng)濕性心臟病(RHD)患者心臟二尖瓣瓣膜上Th17細(xì)胞軸相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-21、IL-6、IL-23表達(dá)水平的改變。方法選擇 20例 RHD患者及12例非RHD對(duì)照組二尖瓣瓣膜組織(NRHD組)，應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化法對(duì)IL-17、IL-21、IL-6、IL-23表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果RHD組HE染色可見(jiàn)瓣膜組織部分出現(xiàn)纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主。免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)慢性炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)且定位于細(xì)胞質(zhì)中，炎性細(xì)胞主要位于血管旁。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例及其乘積評(píng)分均明顯高于NRHD組(P<0.05)。結(jié)論RHD患者瓣膜中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增高，高Th17表達(dá)可能是引起RHD持續(xù)瓣膜損害的一個(gè)潛在機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕風(fēng)濕性心臟??；Th17細(xì)胞；細(xì)胞因子

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院心內(nèi)科

第一作者：文韻(1990-)，女，在讀碩士，主要從事風(fēng)濕性心臟病、冠心病方面的研究。

風(fēng)濕性心臟病(RHD)是A組β溶血性鏈球菌感染引起的風(fēng)濕熱(RF)的后遺癥，是一種自身免疫性疾病〔1〕，并與細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)〔2,3〕。Th17細(xì)胞作為最新被確認(rèn)的效應(yīng)細(xì)胞系，在防御細(xì)胞外細(xì)菌感染、介導(dǎo)慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究證明，Th17細(xì)胞參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等〔4～6〕多種自身免疫性疾病的病理過(guò)程。但是Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子在RHD中的表達(dá)目前尚未完全明確。本文擬初步探討Th17細(xì)胞在慢性RHD中的作用，為進(jìn)一步闡明和完善RHD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料來(lái)源隨機(jī)選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年10月至2014年3月行二尖瓣置換術(shù)的RHD患者20例為RHD組，男8例，女12例，年齡(50.30±1.786)歲。另外選取12例非RHD行二尖瓣置換術(shù)(退行性二尖瓣后瓣脫垂)患者二尖瓣前瓣瓣葉作對(duì)照(NRHD組)，男6例，女6例，年齡(58.58±2.204)歲。兩組選取病例均通過(guò)心臟超聲確診。本實(shí)驗(yàn)所選取人體標(biāo)本均通過(guò)病人及其家屬知情同意。兔抗人白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-6、IL-23單克隆抗體采用Abcam公司產(chǎn)品，兔抗人IL-21單克隆抗體采用Novus公司產(chǎn)品，S-P免疫組化試劑盒采用北京中杉金橋公司產(chǎn)品，DAB顯色試劑盒采用福州邁新公司產(chǎn)品。

1.2標(biāo)本制備兩組均在術(shù)中建立體外循環(huán),心臟停跳后30 min內(nèi)取材，立即放入4%多聚甲醛固定16 h后，移入脫鈣液中，浸泡至組織脫鈣軟化，常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片厚4 μm,作蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.3HE染色和免疫組化將石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織學(xué)形態(tài)。同時(shí)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)后再加入3%H2O2去離子水去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，置于正常山羊血清工作液中，室溫下封閉15 min，加入上述各單克隆抗體，4℃過(guò)夜后加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體。上述每級(jí)抗體孵育后，使用PBS充分洗滌。DAB室溫下顯色5～10 min后，蘇木素染核、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.4結(jié)果判定IL-17、IL-21、IL-6、IL-23均以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不同程度的棕黃色判定為陽(yáng)性反應(yīng)。以PBS取代一抗作為空白對(duì)照。采用許良中等〔7〕的半定量公式判斷染色結(jié)果。隨機(jī)選取5個(gè)典型高倍鏡視野(400倍)計(jì)數(shù)每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。首先就染色強(qiáng)度打分，以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺的判定需要與背景著色深淺相比較)計(jì)分：棕褐色判為3分，棕黃色判為2分，淺黃色判為1分，無(wú)著色判為0分；再將陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分，陽(yáng)性細(xì)胞比例的計(jì)算方法：陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞≥75%。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比與染色強(qiáng)度的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1HE染色RHD組HE染色結(jié)果可見(jiàn)瓣膜組織部分出現(xiàn)纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主，見(jiàn)圖1。

2.2免疫組化染色慢性炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)且定位于細(xì)胞質(zhì)中，炎性細(xì)胞主要位于血管旁，見(jiàn)圖2、圖3。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例及其乘積評(píng)分均明顯高于NRHD組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖1　兩組患者二尖瓣膜病理HE染色(×400)

圖2　兩組患者心瓣膜IL-17、IL-21免疫組化表達(dá)(DAB，×400)

圖3　兩組患者心瓣膜IL-6、IL-23免疫組化表達(dá)(DAB，×400)

與NRHD組比較：1)P<0.05圖4　兩組IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達(dá)

3討論

本文發(fā)現(xiàn)， Th17細(xì)胞自分泌的細(xì)胞因子IL-17和IL-21在人類(lèi)慢性RHD瓣膜中的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加，同時(shí)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子IL-6和IL-23與對(duì)照組也存在差異。本研究證實(shí)所有患者風(fēng)濕活動(dòng)屬于慢性穩(wěn)定期，表明該Th17細(xì)胞的表達(dá)不是由鏈球菌急性感染引起的，在慢性RHD疾病穩(wěn)定期，Th17細(xì)胞造成的自身免疫損害占主要優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，在慢性RHD瓣膜中，Th17相關(guān)細(xì)胞因子在炎癥細(xì)胞上的表達(dá)為局灶性的分布，這與Guilherme等〔3〕的研究結(jié)果風(fēng)濕性病變瓣膜組織有慢性炎癥和炎性細(xì)胞局灶浸潤(rùn)相一致。

Wang等〔8〕的研究顯示，β鏈球菌感染誘導(dǎo)的組織生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和IL-6，有助于CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞系的發(fā)育。在他們的研究中，Th17細(xì)胞的免疫是被動(dòng)轉(zhuǎn)移到裸鼠中去的，并且顯示對(duì)抗鏈球菌的保護(hù)性免疫依賴于Th17細(xì)胞系。我們的研究結(jié)果也證實(shí)，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子IL-6、IL-23在瓣膜中表達(dá)明顯增加，可以認(rèn)為 IL-6和IL-23表達(dá)升高可能促進(jìn)了Th17細(xì)胞的分化。Th17細(xì)胞在對(duì)抗鏈球菌和導(dǎo)致自身免疫是必需的。最近，Bas等〔9〕報(bào)道，風(fēng)濕性心臟病患者外周Th17細(xì)胞的百分比和血清中Th17/Treg的比例顯著升高。Guilherme等〔10〕通過(guò)分析來(lái)源于慢性RHD患者外周T細(xì)胞中的IL-17A基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于RHD患者的外周T細(xì)胞表現(xiàn)出IL-17A過(guò)表達(dá)，他們還闡述發(fā)現(xiàn)大量的IL-17和IL-23存在于心瓣膜細(xì)胞中〔11〕。根據(jù)以上研究推測(cè)，在風(fēng)濕性心臟病早期，易感個(gè)體中反復(fù)的鏈球菌暴露連同長(zhǎng)期和過(guò)度的Th17反應(yīng)可能引發(fā)心瓣膜炎，而在風(fēng)濕性心臟病的晚期，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫作用持續(xù)加重了心臟瓣膜的損害。但這一假設(shè)還需要進(jìn)一步的評(píng)估。

由于RHD病因復(fù)雜、影響因素較多以及動(dòng)物模型建立困難等，目前并沒(méi)有特別的治療能夠有效防止RHD的進(jìn)展。在全球范圍內(nèi)，每3～4 w肌內(nèi)注射芐星青霉素G(BPG)的二級(jí)預(yù)防仍被推薦〔12〕。然而，二級(jí)預(yù)防的效果是有限的，因?yàn)槿駼PG的供應(yīng)量和質(zhì)量存在差異，且患者每3～4 w注射BPG的依從率較低〔13〕。因此，需要新的策略防止急性RF的復(fù)發(fā)以及RHD的進(jìn)展。本研究也存在一定的局限性，僅僅使用免疫組化的方法檢測(cè)Th17部分相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，且只是研究了在RHD慢性期瓣膜的改變，未研究急性期瓣膜的改變，這也是我們將來(lái)研究的內(nèi)容。

參考文獻(xiàn)4

1Hernandez-Pacheco G,Flores-Dominguez C,Rodriguez-Perez JM,etal.Tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphisms in Mexican patients with rheumatic heart disease〔J〕.J Autoimmun,2003;21(1):59-63.

2王萍.細(xì)胞因子在風(fēng)濕性心臟病發(fā)生發(fā)展中的作用〔J〕.國(guó)際免疫學(xué)雜志,2006;29(1):40-3.

3Guilherme L,Cury P,Demarchi LM,etal.Rheumatic heart disease:proinflammatory cytokines play a role in the progression and maintenance of valvular lesions〔J〕.Am J Pathol,2004；165(5):1583-91.

4Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,etal.Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,tocilizumab,in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate〔J〕.Arthritis Rheum,2006;54(9):2817-29.

5Wong CK,Ho CY,Li EK,etal.Elevation of proinflammatory cytokine(IL-18,IL-17,IL-12)and Th2 cytokine(IL-4)concentrations in patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Lupus,2000;9(8):589-93.

6Lambrecht BN,Hammad H.The immunology of asthma〔J〕.Nat Immunol,2014;16(1):45-56.

7許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)〔J〕.中國(guó)癌癥雜志,1996;6(4):229-31.

8Wang B,Dileepan T,Briscoe S,etal.Induction of TGF-beta1 and TGF-beta1-dependent predominant Th17 differentiation by group A streptococcal infection〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(13):5937-42.

9Bas HD,Baser K,Yavuz E,etal.A shift in the balance of regulatory T and T helper 17 cells in rheumatic heart disease〔J〕.J Investig Med,2014;62(1):78-83.

10Guilherme L,Kalil J.Rheumatic fever and rheumatic heart disease:cellular mechanisms leading autoimmune reactivity and disease〔J〕.J Clin Immunol,2010;30(1):17-23.

11Guilherme L,Kalil J.Rheumatic heart disease:molecules involved in valve tissue inflammation leading to the autoimmune process and anti-S.pyogenes vaccine〔J〕.Front Immunol,2013;4:352.

12王健,全瑛,吉健華,等.TGF-β1通過(guò)抑制HIF-1α減少風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞膠原合成〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014；14(34):6634-6,6617.

13Remenyi B,Carapetis J,Wyber R,etal.Position statement of the World Heart Federation on the prevention and control of rheumatic heart disease〔J〕.Nat Rev Cardiol，2013;10(5):284-92.

〔2014-12-27修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：曾志羽(1965-)，男，教授，主要從事風(fēng)濕性心臟病、冠心病方面的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260067)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂攻科1355005-4-4)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R593.21〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.026