鹽酸法舒地爾對慢性心力衰竭大鼠心肌組織Toll樣受體/MyD88信號通路的影響

陳　華　陳淑霞　袁　靜　王立立　呂妍琨　杜榮品　谷　劍　李　燕

(河北省人民醫(yī)院心臟中心，河北　石家莊　050051)

?

鹽酸法舒地爾對慢性心力衰竭大鼠心肌組織Toll樣受體/MyD88信號通路的影響

陳華陳淑霞袁靜王立立呂妍琨杜榮品谷劍李燕1

(河北省人民醫(yī)院心臟中心，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的探討鹽酸法舒地爾對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌組織Toll樣受體(TLR)/MyD88信號通路的調(diào)節(jié)作用。方法采用冠狀動脈前降支結扎法建立CHF大鼠模型，分為健康對照組、模型組、治療(鹽酸法舒地爾)組和地高辛組，給予相應藥物干預4 w后，觀察大鼠心臟功能指標，采用實時聚合酶鏈反應(PCR)和Western印跡法分別檢測各組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA和蛋白表達水平。結果模型組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA及蛋白表達水平較對照組明顯增高(P<0.01)。同時，模型組心功能指標左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室重量指數(shù)(LVMI)與對照組相比明顯增高(P<0.01)，而左心室內(nèi)壓最大上升、下降速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)則顯著降低(P<0.01)。治療組干預后，無論是在mRNA還是在蛋白表達水平，心肌組織TLR2、TLR4和MyD88表達水平均顯著下調(diào)(P<0.01)，同時可明顯改善心臟功能指標(P<0.01)。結論鹽酸法舒地爾可能通過下調(diào)CHF大鼠心肌組織TLR2、TLR4和MyD88表達水平，抑制TLR/MyD88信號通路來改善CHF癥狀。

關鍵詞〔〕慢性心力衰竭；鹽酸法舒地爾；TLR/MyD88信號通路

1河北省人民醫(yī)院血液科

第一作者：陳華(1980-),女,碩士，主治醫(yī)師,主要從事心血管病研究。

慢性心力衰竭(CHF)是大部分心血管疾病終末階段所表現(xiàn)出的一種常見的復雜臨床癥狀群，以肺循環(huán)和體循環(huán)淤血為主要特征。其發(fā)病率、致殘率和致死率均較高，病情復雜，總體預后差，并且需較高的醫(yī)療支出，嚴重威脅患者的健康〔1〕。CHF患者的神經(jīng)激素系統(tǒng)活性、炎性細胞因子水平及氧化應激作用明顯增強，同時剪切力降低導致機體內(nèi)皮舒縮功能障礙〔2〕。血管內(nèi)皮功能障礙反過來增加冠狀動脈阻力，降低血流量和血管順應性，外周血管過度擴張易增加心臟后負荷，導致心肌缺血加重，形成惡性循環(huán)從而加重心力衰竭，提示內(nèi)皮功能是CHF防治的潛在靶點〔3〕。鹽酸法舒地爾是一種新型的小分子G蛋白(Rho)激酶抑制物，研究證實了鹽酸法舒地爾可防止缺血再灌注損傷，改善腦組織微循環(huán)，減少心肌細胞凋亡，擴張血管，同時可降低內(nèi)皮細胞的張力、降低血液黏滯性和血栓形成及拮抗炎性因子〔4〕。本研究觀察鹽酸法舒地爾對CHF大鼠心肌組織Toll樣受體(TLR)/MyD88信號通路的影響，并初步探討其作用機制。

1材料與方法

1.1材料6～8 w齡健康雄性SD大鼠60只，平均體質(zhì)量(200±20)g，清潔級，購自北京實驗動物研究中心，飼養(yǎng)1 w后開始實驗。鹽酸法舒地爾(2 ml：30 mg)購自山西普德藥業(yè)股份有限公司，地高辛片(0.25 mg/片)購自賽諾菲(杭州)制藥有限公司，抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗體購自Santa Cruz公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)購自碧云天生物技術研究所產(chǎn)品，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)均購自寶生物工程(大連)有限公司，電化學發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDA-PAGE)電泳槽、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司)。

1.2引物設計根據(jù)NCBI Genbank上已公布的大鼠TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH基因的mRNA序列及相關參考文獻合成TLR2、TLR4、MyD88和GAPDH的定量PCR引物〔5〕，序列見表1，所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　RT-PCR引物序列

1.3模型建立及動物分組采用冠狀動脈前降支結扎法建立CHF大鼠模型。1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射大鼠，麻醉后于胸骨左側(cè)4～5肋間找到心尖搏動最明顯處作橫向切口，剪開皮膚鈍性分離肌層后找到心臟，用眼科鑷和直剪剪開心包膜，然后將心臟底面翻轉(zhuǎn)，在離左冠狀動脈前降支2 mm處用6/0號手術縫合線將冠狀動脈前降支結扎，利用生理記錄儀觀察心電圖，心肌梗死模型建立的標準為心電圖顯示ST段弓背向上抬高，術后青霉素預防傷口感染。4 w后行心臟超聲檢查及血流動力學監(jiān)測，以射血分數(shù)(EF)值降至60%以下大鼠為標準入選心力衰竭組。60只大鼠隨機挑出10只作為對照組，剩余50只大鼠用于造模，將造模成功的大鼠按數(shù)字隨機分為3組：模型組、治療組(鹽酸法舒地爾5 mg/kg)和地高辛組(0.25 mg/kg)，對照組和模型組每日經(jīng)胃管喂養(yǎng)相同劑量生理鹽水作為安慰劑，每日兩次用藥，連續(xù)飼養(yǎng)4 w，記錄造模大鼠死亡情況，所有大鼠均統(tǒng)一飼養(yǎng)，觀察所有大鼠情況，在整個實驗期間自由飲水進食。

1.4心功能指標測定藥物干預4 w后3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在大鼠頸前正中作切口，于右頸總動脈逆行插管至左心室，然后將多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)連接至另一端以檢測大鼠心功能。檢測指標為包括左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。同時，取出左心室稱重，計算左心室重量指數(shù)(LVMI)，即LVMI=大鼠左心室重量/大鼠體重。

1.5RNA提取與實時定量PCR將心肌組織50 mg剪碎置于組織研磨缽中，加入2 ml Trizol和適量液氮后反復充分研磨，室溫靜置5 min。將液體轉(zhuǎn)移至1.5 ml無RNA酶的EP管中，加入0.2 ml氯仿后劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min。14 000 r/min 4℃離心10 min，離心后分上中下三層，上層水相為RNA。小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 ml無RNA酶的新EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒數(shù)次充分混勻，室溫靜置10 min。14 000 r/min 4℃離心10 min，小心棄去上清液，加入1 ml 焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制的75%乙醇輕微洗滌沉淀，不宜振蕩，14 000 r/min 4℃離心10 min。小心棄去上清液，將EP管放于超凈臺，風干沉淀，用20 μl無RNA酶的ddH2O溶解即得到總RNA。利用DNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提及異丙醇沉淀純化RNA。按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得mRNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明書配制熒光定量PCR反應體系，于熒光定量PCR儀進行樣本的PCR擴增，各基因mRNA表達水平通過2-ΔCt表示。

1.6蛋白提取與Western印跡測定用含有0.1% PMSF的預冷生理鹽水沖洗心肌組織，取100 mg組織加入400 μl RIPA裂解液后于組織研磨器上研磨，然后冰上靜置30 min，10 000 r/min 4℃離心30 min，去上清液，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。配置12%下層分離膠和5%上層濃縮膠，取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE上樣緩沖液沸水中孵育10 min，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后切下目的蛋白凝膠于轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后的膜用含有5%脫脂奶粉的吐溫-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)封閉液封閉，一抗兔抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88和β-actin抗體孵育過夜，TBST液洗膜后加入二抗結合1 h，沖洗后利用ECL發(fā)光試劑盒顯影，于化學發(fā)光成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結果

2.1一般情況采用冠狀動脈前降支結扎法共造模50只，未出現(xiàn)麻醉過量而引起大鼠死亡，但術中有13只出現(xiàn)失血過多、心臟穿孔和心肌梗死等引起的死亡，術中死亡率為26%。術后4 w內(nèi)有5只大鼠由于心肌梗死過重失代償陸續(xù)死亡，且全部發(fā)生在術后2 w內(nèi)，術后死亡率為13.52%。術后4 w后尚成活32只，手術成活率為64%，按數(shù)字隨機分成3組：模型組(n=11)、治療組(n=11)和地高辛組(n=10)，在隨后的實驗干預中并未見有大鼠出現(xiàn)死亡。CHF造模后大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差及張口呼吸、乏力等心力衰竭癥狀，并且術后體重與對照組相比明顯下降(P<0.01)，術后4 w內(nèi)雖有所回升，但差異無統(tǒng)計學意義。治療組和地高辛組干預后體重逐漸恢復，明顯高于模型組(P<0.01)，但治療組和地高辛組差異無統(tǒng)計學意義。

2.2各組心功能比較與對照組相比，其他3組LVSP、LVEDP和LVMI明顯增高(P<0.01)，而+dp/dtmax和-dp/dtmax則顯著降低(P<0.01)。治療組和地高辛組治療后各項心功能與模型組均有明顯改善(P<0.01)，但治療組和地高辛組差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3各組心肌TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達的影響與對照組相比，其他3組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達明顯增高(P<0.01)。藥物干預后，治療組和地高辛組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)，但表達量仍明顯高于對照組(P<0.01)，同時治療組和地高辛組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達量差異不顯著。見表2。

2.4各組心肌TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達的影響對照組中TLR2、TLR4和MyD88蛋白均有所表達，TLR4表達量最弱，模型組心肌組織TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達水平與對照組相比明顯上調(diào)，而治療組治療后蛋白表達水平有所降低，這與地高辛組一樣。見圖1。

表2　各組大鼠心功能情況及TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達比較

與對照組相比:1)P<0.01；與模型組相比:2)P<0.01

圖1　各組TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達比較

3討論

有學者提出通過膳食調(diào)理改善營養(yǎng)水平有助于預防CHF的發(fā)生，并且一度被認為是最有吸引力的策略之一。但CHF是一種神經(jīng)-體液和炎癥性綜合征，CHF的發(fā)生和發(fā)展涉及多種分子和細胞復雜機制的參與。簡單地改善飲食結構并不能達到理想結果。傳統(tǒng)藥物治療如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑等雖然可減輕CHF癥狀，增加運動耐力，可適當提高患者生存率，但患者預后和生活質(zhì)量往往較差，仍需進一步改善〔6〕。血管內(nèi)皮舒縮功能障礙和心臟收縮的生理調(diào)節(jié)異常在CHF發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用〔7〕。RhoA位于Gq下游，是一種低分子量的GTP酶，該蛋白具有參與心肌重塑的功能〔8〕。因此，改善心肌收縮功能是CHF防治的潛在靶標。

目前已研究的Rho激酶抑制劑藥物較多，且更新?lián)Q代較快，鹽酸法舒地爾作為新型神經(jīng)保護劑已在臨床應用中取得顯著效果。鹽酸法舒地爾是5-異喹啉磺酰胺衍生物，具有廣泛的藥理學作用，早期主要應用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣，而隨后研究證實了它能有效擴張血管、保護缺血腦組織〔9〕。鹽酸法舒地爾通過進入肌細胞與ATP競爭Rho激酶催化區(qū)的ATP結合位點而阻斷Rho激酶的活性，通過調(diào)控肌球蛋白結合亞基磷酸化水平途徑參與心肌細胞收縮調(diào)節(jié)。同時，鹽酸法舒地爾還具有降低心室肥厚指數(shù)和心室壁張力及提高心室肌彈性和順應性、改善血流動力學的功能。劉克強〔10〕指出，冠心病心力衰竭患者在給予利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑和硝酸酯治療的基礎上靜脈滴注含有法舒地爾注射液的葡萄糖，每月1個療程，連用3個月，治療后未發(fā)現(xiàn)患者有明顯不良反應，且治療前后各項生化指標無明顯變化，同時可明顯提高左心室EF及降低左心室收縮末容量和舒張末容量。臨床效果分析顯示，鹽酸法舒地爾可顯著改善冠心病心力衰竭臨床癥狀，總有效率達到89.3%。

近來的動物實驗研究顯示，TLR2基因缺陷小鼠經(jīng)冠狀動脈結扎造模后死亡率和左心室功能不良發(fā)生率明顯低于正常的小鼠〔11〕，而TLR4基因缺陷的小鼠對燒傷后引起的心力衰竭發(fā)生率明顯降低〔12〕。同時臨床研究也發(fā)現(xiàn)老年CHF患者外周血單核細胞表面的TLR2/4表達水平顯著上調(diào)〔13〕。這些研究表明TLR2/4的表達顯著上調(diào)可能是促進CHF的發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。

綜上，可以推斷抑制TLR/MyD88信號通路可能是鹽酸法舒地爾防治CHF的作用機制之一。

參考文獻4

1柯元南.慢性心力衰竭診治新進展〔J〕.中國全科醫(yī)學，2007;10(6)：433-4.

2衣紹蕊，孫經(jīng)武，張明哲，等.曲美他嗪對慢性心力衰竭患者血管內(nèi)皮功能的影響研究〔J〕.中國全科醫(yī)學，2014;17(20)：2321-4.

3郭美珠，嚴世蕓，黃國毅，等.中藥治療慢性心力衰竭機制的研究進展〔J〕.中國全科醫(yī)學，2013;16(10C)：3617-20.

4Jiang ZH,Zhang TT,Zhang JF.Protective effects of fasudil hydrochloride post-conditioning on acute myocardial ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Cardiol J,2013;20(2)：197-202.

5章超群.白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織TLR/MyD88信號通路調(diào)節(jié)的研究〔D〕.合肥：安徽醫(yī)科大學，2014.

6花冠杰，韋利元，韋穎.鹽酸法舒地爾對冠心病心力衰竭的臨床療效觀察〔J〕.檢驗醫(yī)學與臨床，2011；8(10)：1223-5.

7Takishima I,Nakamura T,Hirano M,etal.Predictive value of serial assessment of endothelial function in chronic heart failure〔J〕.Int J Cardiol,2012；158(3)：417-22.

8Pitt B,Zannad F,Remme WJ,etal.The effect of spironolactone on morbidity and mortality in patients with severe heart failure〔J〕.N Engl J Med,1999;341(10)：709-17.

9Cui Q,Zhang Y,Chen H,etal.Rho kinase：a new target for treatment of cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.Neural Regen Res,2013;8(13)：1180-9.

10劉克強.鹽酸法舒地爾治療冠心病心力衰竭臨床療效〔J〕.藥物與臨床，2012;24(50)：56-7.

11Thomas JA,Tsen MF,White DJ,etal.TLR4 inactivation and rBPI(21)block burn-induced myocardial contractile dysfunction〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002;283(4)：H1645-55.

12Shishido T,Nozaki N,Yamaguchi S,etal.Toll-like receptor-2 modulates ventricular remodeling after myocardial infarction〔J〕.Circulation,2003;108(23)：2905-10.

13胡有東，李俠，程蘊琳，等.TLR2和TLR4與老年慢性左心力衰竭關系的研究〔J〕.實用老年醫(yī)學，2009;23(6)：426-8.

〔2015-01-19修回〕

(編輯苑云杰)

《中國老年學雜志》鄭重聲明

中國老年學雜志從未設任何網(wǎng)站，唯一投稿方式為郵箱投稿，投稿郵箱為：okgood911@126.com 。唯一咨詢電話：0431-88923384 。唯一匯款方式為郵局匯款，匯款地址：長春市建政路971號《中國老年學雜志》編輯部收，郵編：130061。

中圖分類號〔〕R541〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0055-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.024