麝香草酚《中國藥典》2015年版微生物限度檢查法方法學研究

劉緒平 張文婷#

（1江西省藥品檢驗檢測研究院南昌 330029；2江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程研究技術中心南昌 330029）

●中西藥苑●

麝香草酚《中國藥典》2015年版微生物限度檢查法方法學研究

劉緒平1，2張文婷1，2#

（1江西省藥品檢驗檢測研究院南昌 330029；2江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程研究技術中心南昌 330029）

目的：建立麝香草酚《中國藥典》2015年版微生物限度檢查方法。方法：需氧菌總數檢查為薄膜過濾法，沖洗量為800 ml；霉菌和酵母菌總數檢查為薄膜過濾法，沖洗液為pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗量為800 ml；大腸埃希菌檢查、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查均為薄膜過濾法，沖洗液為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗量為800 ml。結果：在三次獨立平行的試驗中，5株試驗菌的回收比值0.5～2.0。結論：該方法消除了樣品的抑菌性，可用于該品種的微生物限度檢查。

麝香草酚；微生物限度檢查；方法驗證

麝香草酚即5-甲基-2異丙基苯酚，為《中國藥典》2015年版四部收錄藥用輔料，為一種抑菌劑[1]。其殺菌作用比苯酚強，且毒性低，對口腔咽喉黏膜有殺菌、殺真菌作用，對齲齒腔有防腐、局麻作用，用于口腔、咽喉的消毒殺菌、皮膚癬菌病、放射菌病及耳炎。能促進氣管纖毛運動，有利于氣管黏液的分泌，易起祛痰作用，再加有殺菌作用，故可用于治療氣管炎、百日咳等?！吨袊幍洹?015年版的微生物限度檢查法結合國情參考美國藥典進行修訂[2]，在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和檢驗方法及結果判斷上與2010年版相比做了重大的改變。本文對3批麝香草酚輔料微生物限度檢查的方法學進行研究，需氧菌總數檢查和霉菌和酵母菌總數檢查均為薄膜過濾法；大腸埃希菌檢查、金黃色葡萄球菌檢查和銅綠假單胞菌檢查均為薄膜過濾法。并對方法進行驗證，結果表明該方法有效可行，較之2010年版方法在許多方面更加能有效科學地控制該品種微生物質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器YXQ-LS-50SⅡ高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)醫(yī)療器械有限公司）；D8523CTL-2W格蘭仕微波爐（順德格蘭仕微波爐電器有限公司）；Sartorius T601-L電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SW-CJ-2D凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；PYX-DHS細菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；MJ-160B霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥試驗菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基均由北京路橋技術有限責任公司提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備取經35℃培養(yǎng)18～24 h金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-3～10-7，做活菌計數備用。取經25℃培養(yǎng)18～24 h白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-4，做活菌計數備用。取經25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，加入5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 ml，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-2～10-4，做活菌計數備用。

2.2 供試液的制備取供試品10 g置三角燒瓶中，加吐溫80和司盤80各3 ml，再加45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，搖勻，作為1∶10供試液。

2.3 需氧菌總數計數法的驗證回收測定：薄膜過濾法。（1）試驗組：取供試液1 ml，采用薄膜過濾法，每筒用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液800 ml分8次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu試驗菌，濾干，立即貼膜于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h逐日觀察結果。（2）供試品對照組：取上述制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作，測定供試品本底菌數。（3）菌液對照組：取相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。（4）回收比值的計算：按如下公式計算試驗組的加菌回收比值：試驗組的加菌回收比值=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液對照組的平均菌落數。參照《中國藥典》2015年版四部通則1105選取枯草芽孢桿菌進行預試驗，取1∶10供試液1 ml，采用薄膜過濾法，每筒沖洗量分別為300、500、800 ml，回收比值分別為0、0.2、0.7，所以其他菌株試驗沖洗量都取800 ml。見表1。

表1 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證結果

2.4 霉菌和酵母菌總數計數法的驗證回收測定：薄膜過濾法。（1）試驗組：取供試液1 ml，采用薄膜過濾法，每筒用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液800 ml分8次沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu試驗菌，濾干，立即貼膜于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置20～25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～120 h逐日觀察結果。（2）供試品對照組：取上述制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗組操作，測定供試品本底菌數。（3）菌液對照組：取相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。（4）回收比值的計算：按如下公式計算試驗組的加菌回收比值：試驗組的加菌回收比值=（試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數）/菌液對照組的平均菌落數。見表1。

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1 大腸埃希菌檢查法供試液的制備同“2.2”項下1∶10供試液的制備。試驗組：取上述供試液10 ml，薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液800 ml分8次沖洗，加入不大于100 cfu大腸埃希菌試驗菌（將試驗菌加入最后一次沖洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18～72 h，取麥康凱瓊脂平板上菌落經純化后的培養(yǎng)物，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液，觀察。陰性對照組：取稀釋液10 ml照大腸埃希菌檢查法操作。見表2。

表2 大腸埃希菌檢查法方法學驗證試驗結果

2.5.2 金黃色葡萄球菌檢查法供試液的制備同“2.2”項下1∶10供試液的制備。試驗組：取上述供試液10 ml，薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液800 ml分8次沖洗，加入不大于100 cfu金黃色葡萄球菌試驗菌（將試驗菌加入最后一次沖洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，置35℃培養(yǎng)18～72 h，觀察結果。陰性對照組：取稀釋液10 ml照金黃色葡萄球菌檢查法操作。見表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢查法方法學驗證試驗結果

2.5.3 銅綠假單胞菌檢查法供試液的制備同“2.2”項下1∶10供試液的制備。試驗組：取上述供試液10 ml，薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液800 ml分8次沖洗，加入不大于100 cfu銅綠假單胞菌試驗菌（將試驗菌加入最后一次沖洗液中），取膜加入100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置35℃培養(yǎng)18～72 h，觀察結果。陰性對照組：取稀釋液10 ml照銅綠假單胞菌檢查法操作。見表4。

表4 銅綠假單胞菌檢查法方法學驗證試驗結果

3 討論

《中國藥典》2015年版將檢查項目細菌總數計數改為需氧菌總數計數，包括《中國藥典》2010年版規(guī)定的細菌數、霉菌及酵母菌總數。因為在日常檢查中經常能夠碰到在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上出現酵母菌或霉菌，有的酵母菌生長較小，特征不明顯，難以判斷是否為細菌[3]?！吨袊幍洹?015年版需氧菌總數檢查所用的培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，《中國藥典》2010版細菌中細菌總數檢查所用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，同等時間和同等條件下培養(yǎng)，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基較營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌落大，易計數[4]。

《中國藥典》2010年版細菌總數計數法三株驗證用陽性細菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌。將其中大腸埃希菌改為銅綠假單胞菌，根據王慧玲等在2013年常見分離菌分布及耐藥變遷文獻中報道，2013年全年病人送診的32566份細菌培養(yǎng)標本，檢出的3684株分離菌株中大腸埃希菌排名第一[5～6]。說明大腸埃希菌臨床耐藥性高。而根據我單位自2006年至今10年對近2 000個品種進行的微生物限度檢查方法學研究結果表明，細菌計數法敏感菌株95%以上為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，通常大腸埃希菌驗證只需要1∶10供試液平皿法便可達到70%以上的回收率，故新版藥典改用同為革蘭氏陰性無芽孢桿菌的銅綠假單胞菌來作為這類菌的代表菌株用于驗證，更加科學。

本品種為新版藥典四部新收錄的藥用輔料品種。其在水中微溶，故要制備成均一的1∶10溶液，需要加入一定比例的分散劑或者乳化劑，根據試驗摸索，選擇了100 ml供試液中加吐溫80和司盤80各3 ml，分散效果較好。又由于其具有較強的抑菌性，所以直接選擇了薄膜過濾法，并選取枯草芽孢桿菌做預實驗考察了不同沖洗量的回收比值，確定了800 ml/筒沖洗量，并通過其他幾株試驗菌的驗證了方法的可行性。結合新版藥典更加科學合理的方法體系，通過完善細致的實驗過程，找到了該品種較佳的微生物限度檢查方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2015年版一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.979

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2015年版四部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.附錄1105-1106

[3]金莞爾,俞年生.菌落計數時常見的幾個難題[J].浙江預防醫(yī)學, 2000,12(4):63

[4]由亞寧,陳雪芹,周志云,等.2005年版《中國藥典》和《歐洲藥典》菌落計數培養(yǎng)基比較[J].中國藥事,2010,24(6):587-589

[5]王慧玲,盧先雷.2013年常見分離菌分布及耐藥變遷[J].華西醫(yī)學, 2016,31(2):287-292

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2010年版一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.附錄79

Verification and Evaluation of Methodology on the Microbial Limit Test for Thymol by ChP 2015

LIU Xu-ping1,2,ZHANG Wen-ting1,2#
(1Jiangxi Institute for Drug Control,Nanchang330029; 2Jiangxi Provicial Engineering Research Center for Drug and Medical Device,Nanchang330029)

Objective:To provide a method of microbial limit test for thymol and carry out the verification of the mothed.Mothed: Membrane filtration method was used in total aerobic microbial count and total yeast and mould count with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer 800 ml as flush fluid.Membrane filtration method was used for the detection of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer 800 ml as flush fluid.Results:In 3 parallel independent experiments,the recovery rate of 5 positive bacterium were 0.5～2.0.Conclusion:It can eliminate the antimicrobial properties,and it can be used for the microbial limit test for thymol.

Thymol;Microbial limit test;Method validation

R927.1

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.12.045

2016-10-17）

#通訊作者：張文婷，E-mail：2819176959@qq.com