歐前胡素肝微粒體代謝動力學和細胞色素P450代謝表型分析

蹇 陽，陳 琳，原 梅，莊笑梅，李 樺

（軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

歐前胡素肝微粒體代謝動力學和細胞色素P450代謝表型分析

蹇 陽，陳 琳，原 梅，莊笑梅，李 樺

（軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

目的 研究呋喃香豆素活性成分歐前胡素在人和大鼠肝微粒體的代謝穩(wěn)定性和酶促動力學，并分析細胞色素P450（CYP）酶的代謝表型。方法 將歐前胡素分別與人和大鼠肝微粒體在37℃與不同輔酶因子孵育，應用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定孵育液中剩余的歐前胡素含量，分析其代謝穩(wěn)定性及代謝消除反應類型，并計算酶促動力學參數(shù)——米氏常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax）。應用重組人源CYP同工酶（CYP1A2，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4）及其特異性抑制劑，確定歐前胡素的CYP酶代謝表型。結(jié)果 在人和大鼠肝微粒體中，歐前胡素主要依賴于還原性輔酶Ⅱ（NADPH）的Ⅰ相代謝消除，30 min代謝轉(zhuǎn)化率分別為69.7%和94.5%，代謝消除半衰期t1/2分別為18.9±0.6和（2.8± 0.4）min，經(jīng)外推得到的肝清除率（Clh）分別是16.9±0.1和（51.9±0.4）mL·min-1·kg-1，Km分別為13.60±0.16和（14.00±0.24）μmol·L-1，Vmax分別為2928±96和（8434±27）nmol·min-1·g-1。歐前胡素在大鼠肝微粒體的消除顯著快于人肝微粒體（P<0.01）。歐前胡素在肝微粒體的Ⅰ相代謝是由多個CYP同工酶介導的，經(jīng)整體歸一化法評價得到CYP1A2，CYP2B6，CYP2C19和CYP3A4的代謝貢獻率分別為20.4%，7.3%，10.5%和61.8%。結(jié)論 歐前胡素在肝微粒體中主要發(fā)生多個CYP酶介導的Ⅰ相代謝，其中CYP3A4和CYP1A2的貢獻率>20%。

歐前胡素；肝微粒體；細胞色素P450酶；代謝

歐前胡素是呋喃香豆素類的活性成分，屬于6，7-呋喃香豆素類，天然存在于傘形科常用中藥白芷、獨活和北沙參中，是其主要藥效成分，也是臨床上廣泛使用的藿香正氣水、龍葵銀消片和元胡止痛片等多種中藥制劑的重要活性成分［1-2］，具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、舒張血管、抗炎和抗菌的功效［3-4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素是中藥白芷中含量最高的呋喃香豆素成分，也是大鼠經(jīng)胃白芷提取液后血漿中的主要成分［5］。歐前胡素的動物藥代動力學已有較多的研究［6-7］。應用液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在口服歐前胡素的大鼠尿樣中可檢測到數(shù)十個代謝產(chǎn)物，其中以氧化產(chǎn)物為主［8］，表明歐前胡素在大鼠體內(nèi)能發(fā)生廣泛的代謝。但歐前胡素在人體內(nèi)外的代謝性質(zhì)以及所參與的代謝酶未見報道。

呋喃香豆素是一類重要的中藥活性成分。近年來，這類成分與細胞色素P450同工酶（cyto?chrome P450 enzyme，CYP）之間的相互作用引起關(guān)注［9］，其對 CYP3A4，CYP2D6，CYP1A2和CYP2C19等多種CYP酶均有不同程度的抑制作用［10-14］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)灌胃白芷提取物（4.5 g·kg-1）后，歐前胡素是血漿中的主要呋喃香豆素活性成分，血藥濃度可達2.5 mg·L-1水平，口服生物利用度約為42%［5］。歐前胡素對CYP酶各亞型有廣泛的抑制作用，是CYP1A2和CYP2B6的強抑制劑，CYP2C19，CYP3A4，CYP2C9和CYP2D6的中等或弱抑制劑［15］，提示歐前胡素在臨床上與其他中藥和西藥合用時，具有基于CYP酶抑制相互作用的風險。因此，研究歐前胡素的肝代謝性質(zhì)并了解介導其代謝消除的主要代謝酶，對于指導臨床合理用藥、減少因代謝性相互作用引起的毒性作用具有重要意義。

本研究應用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/ MS）法及肝微粒體和重組人源CYP，比較歐前胡素在人肝微粒體（human liver microsomes，HLM）和大鼠肝微粒體（rat liver microsomes，RLM）的代謝穩(wěn)定性和酶促動力學，確定參與其代謝的Ⅰ相反應酶表型，為深入認識歐前胡素的代謝消除機制以及為指導臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

歐前胡素（批號：110816-201224）、咪達唑侖（CYP3A4）、奎尼丁（CYP2D6）和酮康唑（CYP3A4）均購自中國藥品生物制品檢定院；各CYP同工酶的特異性底物（CYP1A2：非那西??；CYP2B6：安非他酮；CYP2C8：吉非貝齊；CYP2C9：甲苯磺丁脲；CYP2C19：S-美芬妥因和CYP2D6：右美沙芬）。CYP同工酶特異性抑制劑（CYP1A2：α-萘黃酮；CYP2B6：噻氯吡啶；CYP2C8：諾卡酮；CYP2C9：磺胺苯吡唑和CYP2C19：槲皮素），以及7-羥基香豆素、尿苷二磷酸葡糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid，UDPGA）、聚二乙醇十六烷基醚58（Brij 58）和D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯均購自美國Sigma公司；甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）為美國Fisher公司產(chǎn)品。還原性輔酶Ⅱ（nicotinamide ad?enine dinucleotide phosphate，NADPH）為瑞士Roche公司產(chǎn)品?；旌螲LM（蛋白含量20 g·L-1，批號34689）、重組人源CYP同工酶（CYP1A2，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4）購自美國BD Gentest公司。RLM為實驗室自制，使用軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供的清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200 ～240 g，動物許可證號SCXK（軍）2015-004；制得的RLM經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測得蛋白質(zhì)含量為20 g·L-1。

美國Agilent 6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，配備Agilent 1290超高壓液相色譜和CAPCELL PAK MGⅡC18（2.0 mm×100 mm，3 μm）色譜柱。

1.2 LC-MS/MS定量檢測歐前胡素

色譜條件：以流動相A（含0.1%甲酸和5mmol·L-1甲酸銨的純水）和B（含0.1%甲酸的乙腈）按如下梯度洗脫：30%B（0-1.0 min），30%→50%B（1.0-4.3 min），58%→90%B（4.3-4.7 min），90%→75%B（4.7-5.0 min），75%→30%B（5.0-5.5 min），流速0.3 mL·min-1，運行時間6.8 min，柱溫25℃，進樣5 μL，內(nèi)標為茴芹內(nèi)酯（100 μg·L-1）。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源，正離子模式下采用多反應監(jiān)測方式檢測，毛細管溫度為350℃，干燥氣流速為10 L·min-1，毛細管電壓為4000 V，霧化電壓為172 kPa，歐前胡素和內(nèi)標的的檢測離子對分別為271→203和247→232，碰撞能量分別為36 V和30 V。

1.3 歐前胡素的肝微粒體孵育和代謝穩(wěn)定性

孵育體系為200 μL K2HPO4緩沖液（5 mmol·L-1，pH 7.4）、內(nèi)含RLM或HLM（蛋白質(zhì)含量0.5 g·L-1）、歐前胡素1 μmol·L-1、輔酶NADPH 1 mmol·L-1和UDPGA 5 mmol·L-1。實驗分為以下4組：NADPH組、UDPGA組、NADPH+UDPGA組和NADPH加熱組（50℃水浴90 s）。按參考文獻［16］的代謝穩(wěn)定性方法，在加或不加NADPH的HLM孵育體系中，觀察CYP介導的歐前胡素Ⅰ相代謝消除；微粒體中還含有尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucurono?syltransferase，UGT），是否加入UDPGA觀察UGT介導的歐前胡素Ⅱ相代謝消除；NADPH加熱組50℃通過水浴90 s，使肝微粒體中的黃素單加氧酶（flavin-containing monooxygenase，F(xiàn)MO）失活，排除其對實驗結(jié)果的影響。UDPGA組和NADPH+UD?PGA組還需加入聚氧乙烯20（HLM或RLM蛋白0.5 mg·g-1）和葡糖醛酸結(jié)合物水解抑制劑D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯5 mmol·L-1。上述各組將歐前胡素與RLM或HLM在37℃預孵育5 min后，加入同法預孵育的輔酶溶液啟動反應，繼續(xù)在37℃孵育，分別于0，2，5，15，30和60 min時，立即加入600 μL預冷的含茴芹內(nèi)酯100 μg·L-1（內(nèi)標）的乙腈溶液終止反應，渦旋2 min，離心10 min（18 800×g，4℃），取上清進樣檢測剩余的歐前胡素濃度。實驗平行設(shè)置不加輔酶的空白對照組、加入CYP底物普萘洛爾和UGT底物7-羥基香豆素的陽性對照組。各組設(shè)3個平行樣品。

1.4 歐前胡素在RLM和HLM的酶促動力學

首先在上述孵育體系，選取代謝穩(wěn)定性實驗中觀察到的呈線性消除范圍的時間點（HLM孵育為5 min，RLM孵育為2 min），通過不同肝微粒體蛋白濃度（0.1 ～1.0 g·L-1）的預實驗，選擇原型藥物呈線性消除的RLM或HLM蛋白質(zhì)濃度（0.5 g·L-1），進行酶促動力學研究［17］。為測定歐前胡素的酶促動力學參數(shù)：米氏常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax），在上述加入NADPH的Ⅰ相代謝孵育體系中加入系列濃度的歐前胡素（0.5，1，2.5，5，10，25和50 μmol·L-1），同1.3項下方法，分別與HLM孵育2 min與RLM孵育5 min后終止反應，應用LC-MS/MS法檢測剩余的歐前胡素濃度。

1.5 歐前胡素的CYP代謝酶表型

1.5.1 重組人源CYP同工酶法

孵育體系為 200 μL的 K2HPO4緩沖液（5 mmol·L-1，pH 7.4），體系內(nèi)分別含重組酶（蛋白質(zhì)濃度50 pmol·L-1）（CYP1A2，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4），歐前胡素1 μmol·L-1，37℃預孵育5 min后加入NADPH溶液啟動反應，37℃孵育10 min后加入預冷的含100 μg·L-1茴芹內(nèi)酯（內(nèi)標）的乙腈溶液終止反應，渦旋2 min，離心10 min（18 800×g，4℃），取上清進樣定量測定歐前胡素的剩余量，計算轉(zhuǎn)化率和初始消除速率。實驗平行設(shè)置的空白對照組（不加入NADPH孵育），零時組（在反應啟動前先加入600 μL用于滅活酶的沉淀劑），每組設(shè)3個平行樣品［18］。在歐前胡素實驗前應用實驗室已建立的LC-MS/MS法［19］，分析7個同工酶的探針底物（5 μmol·L-1）在上述孵育體系中代謝產(chǎn)物的生成率，評價各重組酶的活性。

1.5.2 CYP酶特異化學抑制劑法

在HLM孵育體系中，將CYP同工酶特異性化學抑制劑與歐前胡素共同孵育，評價抑制劑對歐前胡素代謝轉(zhuǎn)化的影響。孵育體系為200 μL的K2HPO4緩沖液（5 mmol·L-1，pH 7.4），歐前胡素（1 μmol·L-1），HLM（蛋白質(zhì)濃度0.5 g·L-1），各CYP同工酶的特異性抑制劑（CYP1A2：α-萘黃酮；CYP2B6：噻氯吡啶；CYP2C8：諾卡酮；CYP2C9：磺胺苯吡唑；CYP2C19：槲皮素；CYP2D6：奎尼丁；CYP3A4：酮康唑），37℃水浴預孵育5 min后加入NADPH啟動反應，10 min后用預冷的含茴芹內(nèi)酯100 μg·L-1（內(nèi)標）的乙腈溶液終止反應，渦旋2 min，離心10 min（18 800×g，4℃），取上清進樣定量檢測歐前胡素的剩余量。實驗平行設(shè)置發(fā)生完全反應的陽性對照組（不加入抑制劑）和不發(fā)生反應的零時組（實驗前滅活肝微粒體酶），與實驗組同法孵育，上述樣品每組設(shè)3個平行樣品。

1.6 數(shù)據(jù)處理

代謝半衰期和清除率：將零時的歐前胡素濃度作為100%，由各時間點剩余濃度與零時濃度的比值得到歐前胡素的剩余百分比。將各時間點剩余百分比的自然對數(shù)作為縱坐標，各相應的孵育時間點作為橫坐標作圖，直線回歸后得到斜率（-k），在式1中帶入斜率（-k）求得歐前胡素的代謝消除半衰期t1/2。應用Well-stirred模型對其數(shù)據(jù)進行外推，由式2和3求得歐前胡素在HLM和RLM中的固有清除率Clint和肝清除率Clh（mL·min-1·kg-1）［20］。相關(guān)動物理化參數(shù)的經(jīng)驗值引自文獻［21］。

式中，Qh：肝血流量。

整體歸一化（total normalized rate，TNR）法評價各同工酶的貢獻率：將歐前胡素的初始濃度（c0）和t時剩余濃度（ct）以及孵育液中各CYP酶的含量（ccyp）代入式4計算，分別得到歐前胡素在各重組酶中的初始代謝速率（vm）。

將各CYP同工酶在正常人肝微粒體中的平均特定含量（pmol CYP·mg-1蛋白質(zhì)）代入式5，評價各人源重組CYP同工酶在歐前胡素肝代謝中的貢獻［22-23］。

應用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Soft?ware Inc.，La Jolla，CA，USA）軟件，由歐前胡素的系列濃度（0.5，1，2.5，5，10，25和50 μmol·L-1），及各濃度對應的酶反應速率，計算得到歐前胡素在HLM和RLM中的表觀酶促動力學參數(shù)：Km和Vmax。

1.7 統(tǒng)計學分析

代謝穩(wěn)定性實驗所得t1/2，Clint和Clh值，以及酶促動力學實驗所得Km和Vmax值均用x±s表示。應用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用最小顯著性差異（least significant dif?ference，LSD）法進行組間兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素定量檢測方法的驗證

在本研究的分析條件下，微粒體孵育液中的其他物質(zhì)不干擾歐前胡素及內(nèi)標的測定。以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸，得到線性方程，歐前胡素的線性范圍為5 ～2000 nmol·L-1，最低定量限為5 nmol·L-1，在所列的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2>0.99）。批內(nèi)和批間精密度<9.8%，準確度在-7.4% ～8.2%之間，提取回收率>95%，且精密度≤15%。表明所建立的方法能滿足孵育液中歐前胡素定量檢測的要求。

2.2 歐前胡素在大鼠和人肝微粒體中代謝穩(wěn)定性

圖1結(jié)果表明，歐前胡素在加入NADPH的HLM和RLM孵育液中可發(fā)生明顯的代謝消除，在HLM和RLM孵育體系中，歐前胡素在30 min的代謝率分別為69.3%和95.5%，提示歐前胡素在肝微粒體的代謝是NADPH依賴性，且RLM的代謝轉(zhuǎn)化率高于HLM。在人和大鼠UDPGA組中，歐前胡素在孵育60min后的剩余濃度分別為1.04±0.02和（0.98±0.03）μmol·L-1與各零時組0.97±0.11和（1.07±0.09）μmol·L-1相比，均無顯著性差異；在人和大鼠NADPH+UDPGA組中，歐前胡素30min的代謝消除率分別為（61.5±5.4）%和（93.8±0.6）%，與NADPH組代謝消除率（69.7±0.4）%和（94.5± 2.8）%相比，無顯著性差異。陽性對照組孵育60 min后，UGT底物7-羥基香豆素的代謝轉(zhuǎn)化率為56.8%，可見這兩組中均未觀察到歐前胡素顯著的Ⅱ相代謝消除。人和大鼠NADPH加熱組與NADPH組的代謝轉(zhuǎn)化率均無顯著性差異，提示歐前胡素的肝微粒體Ⅰ相代謝主要由CYP酶介導，F(xiàn)MO的貢獻可忽略。

Fig.1 NADPH dependent metabolic elimination of im?peratorin in human liver microsomes（HLM）and rat liver microsomes（RLM）.Imperatorin 1 μmol·L-1was mixed with liver microsomes at the protein content of 0.5 g·L-1at 37℃ for 5 min.The mixtures were added with 1 mmol·L-1NADPH after being pre-warmed at 37℃for 5 min to reach the final volume of 200 μL.After 0，2，5，15，30 and 60 min of incuba?tion at 37℃，the reactions were stopped by addition of 600 μL acetonitrile containing 100 μg·L-1pimpinellin（internal standard，IS）.After vortexing for 2 min，the sample was centrifuged at 18 800×gfor 10 min（4℃）.A 5 μL aliquot of the supernatant was analyzed by LC/MS/MS.x±s，n=3.

歐前胡素在HLM和RLM中的Ⅰ相代謝清除參數(shù)（表1），其中消除半衰期分別為18.9±0.6和（2.9±0.4）min，提示RLM對化合物的代謝速率明顯快于HLM。由Clint外推得到人和大鼠的肝Clh分別為16.9±0.1和（51.9±0.4）mL·min-1·kg-1，分別略低于人和大鼠肝血流20.7和55.2 mL·min-1·kg-1，表明歐前胡素的肝代謝消除較快。

Tab.1 Clearance parameters and apparent enzyme kinetic parameters of imperatorin in HLM and RLM

2.3 歐前胡素在大鼠和人肝微粒體中的表觀酶促動力學

結(jié)果如表1所示，歐前胡素在HLM和RLM的Km無統(tǒng)計學差異（P>0.05），但RLM的Vmax顯著高于HLM（P<0.01）。

2.4 歐前胡素的CYP代謝酶表型

在肝微粒孵育體系中，歐前胡素主要發(fā)生依賴于NADPH的Ⅰ相代謝。為此，本研究進一步應用人源重組CYP酶和HML孵育體系，確定歐前胡素的CYP代謝表型。實驗前通過特異性探針底物的代謝轉(zhuǎn)化率評價重組酶的活性，進行質(zhì)量控制。結(jié)果表明，重組酶的活性符合供貨商的質(zhì)量指標，表明此CYP同工酶孵育體系滿足歐前胡素代謝表型研究的要求。

Fig.2 Metabolic rate（MR）of imperatorin in human recombinant CYPs（rCYPs）.See Fig.1 for the incubation system and procedure.Imperatorin 1 μmol·L-1was incubated with human rCYPs 50 pmol·L-1for 10 min.x±s，n=3.

圖2結(jié)果顯示，歐前胡素主要由CYP3A4，CYP1A2，CYP2C19和CYP2B6介導代謝，代謝轉(zhuǎn)化率分別為85.0%，77.4%，73.9%和57.8%，表明歐前胡素的Ⅰ相代謝是由多酶介導的。由于在肝中各同工酶的含量有較大差別，由同工酶孵育得到的代謝轉(zhuǎn)化率無法判斷各酶在歐前胡素肝代謝中的實際貢獻。為此，本研究結(jié)合各同工酶在正常HML的平均特定含量，進一步對歐前胡素在各同工酶孵育液的初始代謝速率進行整體歸一化，得到各個CYP同工酶對歐前胡素代謝的貢獻率（表2），其中CYP3A4的貢獻率為61.8%，CYP1A2為20.4%，它們均是主要參與歐前胡素代謝的CYP同工酶。

Tab.2 Contribution of rCYPs to imperatorin metabo?lism assessed with total normalized MR method

本研究進一步在人肝微粒體孵育體系中，將歐前胡素與CYP同工酶特異性化學抑制劑共孵育，對同工酶法確定的代謝表型進行驗證。各CYP酶特異性抑制劑對歐前胡素在HLM中代謝的影響見表3，CYP3A4，CYP1A2，CYP2C19和CYP2B6的特異性抑制劑酮康唑、噻氯吡啶、α-萘黃酮和槲皮素對歐前胡素的抑制率均>15%，表明它們均是介導歐前胡素Ⅰ相代謝的主要同工酶，與重組同工酶孵育得到的結(jié)果相符。

Tab.3 EffectofCYP inhibitors on imperatorin metabolism in human liver microsomes

3 討論

本研究結(jié)果表明，歐前胡素在HLM和RLM中主要發(fā)生CYP酶介導的Ⅰ相代謝反應。應用LC-MS/MS的選擇離子掃描，可在HLM和RLM孵育液中發(fā)現(xiàn)多個氧化產(chǎn)物，包括文獻報道的獨活素［6］。對比歐前胡素在兩個種屬肝微粒體的代謝消除參數(shù)和表觀酶促動力學參數(shù)可見，其在HLM和RLM中具有相近的表觀親和力，但RLM代謝轉(zhuǎn)化歐前胡素的速率較快，轉(zhuǎn)化率也顯著高于HLM，提示歐前胡素在大鼠的代謝清除可能比人快。

歐前胡素在肝微粒體中Ⅰ相代謝消除反應是由多個CYP酶亞型介導的，主要的亞型是CYP3A4，CYP1A2，CYP2C19和CYP2B6，其中CYP3A4和CYP1A2的貢獻率>20%。歐前胡素既是它們的底物，同時也是它們的抑制劑，歐前胡素與CYP同工酶之間的相互作用較為復雜，既能對自身代謝形成抑制，使自身代謝清除變慢，也會抑制合用的CYP酶底物藥物。由于歐前胡素具有較高的口服生物利用度，作為主要藥效成分在服用白芷等中藥后能達到較高的血藥濃度，在臨床應用時，應關(guān)注抑制CYP3A4，CYP1A2和CYP2B6等CYP酶相關(guān)藥物的相互作用風險，必要時調(diào)整給藥劑量，避免因酶抑制引起的血藥濃度變化和毒性作用。

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Enzyme kinetics of imperatorin and its cytochrome P450 phenotyping in liver microsomes

JIAN Yang，CHEN Lin，YUAN Mei，ZHUANG Xiao-mei，LI Hua
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To investigate enzyme kinetic characteristics of imperatorin in rat liver microsomes（RLM）or human liver microsomes（HLM），and to identify the reaction phenotyping of human recombinant cytochrome P450 enzyme（CYP）mediated phaseⅠ metabolism.METHODS Imperatorin was incubated at 37℃with HLM or RLM in the presence or absence of nicotinamide ade?nine dinucleotide phosphate（NADPH）or uridine 5′-diphosphoglucuronic acid（UDGPA）.The con?centrations of imperatorin in the incubation systems were determined with LC-MS/MS to evaluate its met?abolic stability and enzymatic kinetics.The CYP phenotyping of imperatorin was identified using a panel of human recombinant CYP isoforms（CYP1A2，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6 and CYP3A4）and also using a group of specific inhibitors in HLM.RESULTS Imperatorin was meta?bolically eliminated in the presence of NADPH in HLM or RLM.The elimination rates for HLM and RLM in 30 min were 69.7%and 94.5%，respectively，and elimination half-life（t1/2）values were 18.9±0.6 and（2.8±0.4）min，respectively.The extrapolated hepatic clearance parameters（Clh）were 16.9±0.1 and（51.9±0.4）mL·min-1·kg-1.The Michaelism-Menten parameters（Km）were 13.60±0.16 and（14.00± 0.24）μmol·L-1，and maximum velocity（Vmax）were（2928±96）and（8434±27）nmol·min-1·g-1，respec?tively.The metabolic elimination of imperatorin in RLM was quicker than in HLM.The results of CYP phenotyping indicated that CYP1A2，CYP2B6，CYP2C19 and CYP3A4 were the major CYP isoforms involved in the imperatorin metabolism.Their individual contributions assessed using the method of to?tal normalized rate were 20.4%，7.3%，10.5%and 61.8%，respectively.CONCLUSION Imperatorin is mainly eliminated by CYP mediated metabolism in HLM and RLM.CYP1A2 and CYP3A4 are the major responsible enzymes with a contribution rate above 20%.

imperatorin；liver microsomes；cytochrome P450 enzyme；metabolism

LI Hua，E-mail：amms_hli@126.com，Tel：（010）66930664

R969.1

A

1000-3002-（2016）08-0848-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.008

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09301003-001）；and National Science and Technology Major Project of China（2015ZX09J15104）

2016-01-28接受日期：2016-05-26）

（本文編輯：沈海南）

國家科技重大專項（2012ZX09301003-001）；國家科技重大專項（2015ZX09J15104）

蹇 陽，男，碩士研究生，主要從事藥物代謝研究，E-mail：jianyang425@163.com

李 樺，E-mail：amms_hli@126.com，Tel：（010）66930664