氯化汞對斑馬魚發(fā)育的毒性作用及對軸突蛋白2a基因表達的影響

樊成吉*，屠鴻薇*，陳小輝，柳家賢，彭 濤，孟曉靜

（南方醫(yī)科大學1.公共衛(wèi)生學院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學系，廣東省熱帶病研究重點實驗室，2.生命科學學院發(fā)育生物學系，廣東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選重點實驗室，廣東廣州 510515）

氯化汞對斑馬魚發(fā)育的毒性作用及對軸突蛋白2a基因表達的影響

樊成吉1*，屠鴻薇1*，陳小輝2，柳家賢1，彭 濤1，孟曉靜1

（南方醫(yī)科大學1.公共衛(wèi)生學院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學系，廣東省熱帶病研究重點實驗室，2.生命科學學院發(fā)育生物學系，廣東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選重點實驗室，廣東廣州 510515）

目的 觀察氯化汞（HgCl2）暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育時期的毒性作用，以及對神經(jīng)行為和軸突蛋白（nrxn）2a基因表達的影響。方法 將斑馬魚胚胎在受精后6 h內(nèi)（6 hpf）暴露在HgCl20.2，0.4和0.8 μmol·L-1中，在24 ～120 hpf時觀察HgCl2對斑馬魚死亡率、孵化率和畸形率的影響；用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定體內(nèi)Hg含量；用Video-Track系統(tǒng)記錄斑馬魚幼魚的行為改變；用吖啶橙染色檢測細胞凋亡；用原位雜交和實時定量PCR檢測其對nrxn2a基因表達的影響。結果 與正常對照組相比，HgCl20.8 μmol·L-1處理組72 hpf時，斑馬魚的死亡率開始顯著升高，在120 hpf時死亡率達到94%（P<0.01）；HgCl20.4 μmol·L-1處理組48 hpf時，斑馬魚的孵化率顯著上升（P<0.01）；HgCl20.2，0.4和0.8 μmol·L-1組斑馬魚的胚胎發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為脊柱彎曲和卵黃囊腫，各個時間點和濃度組的畸形率顯著高于正常對照組（P<0.05，P<0.01）。各處理組斑馬魚體內(nèi)Hg與正常對照組相比蓄積明顯（P<0.01），HgCl20.8 μmol·L-1處理組達到77 μg·g-1。與正常對照組相比，HgCl20.4 μmol·L-1暴露組斑馬魚自發(fā)活動的速度減緩（P<0.01），活動程度降低（P<0.05）；凋亡點的數(shù)量也出現(xiàn)顯著性增加（P<0.01）。斑馬魚胚胎中nrxn2aamRNA表達在受精后24 hpf（P<0.01）和72 hpf（P<0.05）兩個時間點呈顯著性增加，而nrxn2abmRNA表達在24和48 hpf兩個時間點呈顯著性下降（P<0.05）。結論 HgCl2對斑馬魚發(fā)育有明顯影響，主要表現(xiàn)為脊柱彎曲和卵黃囊腫，其行為變化可能與nrxn2a的表達變化有關。

氯化汞；斑馬魚；軸突蛋白；細胞凋亡；行為，動物

金屬汞（Hg）廣泛應用于化學、醫(yī)藥、冶金以及電器儀器等行業(yè)［1］，對環(huán)境造成持續(xù)的污染，是嚴重威脅人類健康的重金屬之一［2-3］。Hg可通過血胎屏障進入胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)［4］。另外，運動神經(jīng)元可選擇性地吸收和儲存低劑量無機Hg，這種吸收可能導致神經(jīng)元的傳導速度變慢［5］。流行病學研究也表明，早期的Hg暴露可能導致兒童神經(jīng)發(fā)育性疾病，進而發(fā)展為神經(jīng)精神性疾患，例如自閉癥、焦慮和抑郁等［6］。

軸突蛋白（neurexins，Nrxn）屬于突觸黏附蛋白家族，參與細胞識別和細胞黏附，在突觸生成中具有重要作用。在哺乳動物中，Nrxn是由3個不同的基因編碼（nrxn1，2和3），每個基因有2個亞型，分別由2個不同的啟動子控制，較長的α形式和較短的β形式，每個亞型可被剪接為成千上萬的變異亞型［7］。這6種主要的Nrxn功能有部分重疊，以不同的形式分布在各類神經(jīng)元中。Nrxn通過與神經(jīng)連接蛋白相連調(diào)控谷氨酸能或γ-氨基丁酸能神經(jīng)突觸的分化［8］。最近研究表明，多種認知疾病與編碼nrxn和神經(jīng)配蛋白的基因突變有關，例如自閉癥、精神分裂癥和智力障礙［9-10］。在動物實驗中，大鼠興奮性突觸的nrxn2a突變會導致與神經(jīng)疾病有重要關系的N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）功能的改變［11］。雖然早期Hg暴露可損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能，但對nrxn2a基因表達的影響尚未見報道。

近年來，斑馬魚因其與人類基因組的同源性高達87%，生命周期短，產(chǎn)卵量高且胚胎透明，體外發(fā)育易于觀察，不斷被用于行為學、免疫學和毒理學研究，使其成為研究人類疾病的模式生物和新藥篩選的重要工具［12］。斑馬魚的基因組測序已基本完成，并被證實是一個良好的環(huán)境毒物的研究模型［13］，包括研究重金屬和污染物的累積效應。本研究旨在研究氯化汞（HgCl2）對斑馬魚的早期發(fā)育毒性、nrxn2a基因表達及神經(jīng)行為的影響，為探討HgCl2致斑馬魚神經(jīng)行為改變的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HgCl2、亞甲基藍、三甲卡因和吖啶橙（acridine orange，AO）均購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR（q-PCR）試劑盒均購自日本TaKaRa公司；酶聯(lián)地高辛抗體和T7 RNA多聚酶購自瑞士Roche公司。體式熒光顯微鏡來自日本Olympus公司；實時熒光定量PCR儀（Stratagene MX3000P）購自美國Agilent公司；Viewpoint Lab觀測系統(tǒng)購自法國Viewpoint Life Sciences公司。

1.2 動物飼養(yǎng)和魚卵采集

AB型斑馬魚由南方醫(yī)科大學斑馬魚模式動物重點實驗室和人類疾病藥物篩選研究所提供。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield的方法［14］。光照周期14 h∶10 h，水溫27 ～29℃，養(yǎng)魚系統(tǒng)循環(huán)水為去離子水加海鹽，電導率保持為（880±20）μs·cm-1，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH值約為7.0。使用新鮮孵化的豐年蝦喂養(yǎng)，每日2次。

實驗前1 d晚間將成魚放入交配缸，雌雄比例為1∶1。次日清晨取隔板后，采集30 min內(nèi)所產(chǎn)受精卵，用循環(huán)水清洗2遍后放入孵化液中，同時加入亞甲基藍溶液防止真菌產(chǎn)生，于28.5℃繼續(xù)孵化。受精后2 h（2 h post fertilization，2 hpf）體式顯微鏡下觀察，確定發(fā)育階段［15］并選擇正常受精卵備用。

1.3 斑馬魚胚胎和幼魚染毒

參考OECD標準［16］，每個培養(yǎng)皿放置50個受精卵，加入30 mL培養(yǎng)液，6 hpf內(nèi)進行染毒。參照文獻［17］及預實驗確定胚胎暴露濃度為0，0.2，0.4和0.8 μmol·L-1，每個濃度設置3個復樣。將培養(yǎng)皿置于孵箱中，在光照晝夜比為14 h∶10 h的光周期下進行培養(yǎng)。為檢測不同濃度重金屬對斑馬魚死亡率、孵化率和畸形率的影響，分別在24，48，72，96和120 hpf用體式顯微鏡觀察并記錄每種重金屬實驗組和正常對照組胚胎和幼魚存活、孵化和發(fā)生畸形的數(shù)量。以心臟跳動停止和卵凝結為死亡的終點?；伟怪鶑澢托陌夷[等畸形狀態(tài)，并對各觀察終點計算50個胚胎中死亡、孵化和畸形比率。

1.4 用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasmamassspectrometry，ICP-MS）測定Hg含量

在3 d（3 d post fertilization，3 dpf）后收集各組斑馬魚，洗滌3遍后吸干液體放于-80℃進行冷凍干燥。用微波消化爐進行消化，定溶于25 mL容量瓶后進行Hg含量測量。

1.5 用軌跡錄像記錄檢測神經(jīng)行為

將各處理組斑馬魚飼養(yǎng)至受精后5 dpf，選取形態(tài)學正常的幼魚進行行為學觀察。將幼魚置于96孔板中，每孔1條，200 μL培養(yǎng)液，每個處理組24條。先將96孔板放入Viewpoint Lab觀測系統(tǒng)內(nèi)適應15 min［18］，采集5 min幼魚自發(fā)運動視頻，由于斑馬魚的自發(fā)運動在不同時間的差異較大，故每條幼魚采集3次，記錄5 min內(nèi)幼魚移動距離和活動次數(shù)，計算每分鐘移動距離和活動比例等運動參數(shù)?；顒颖壤?）=每分鐘活動次數(shù)/（每分鐘活動次數(shù)+每分鐘不活動次數(shù)）×100%。每分鐘活動次數(shù)和不活動次數(shù)由自定義軟件Open Office.Org2.4進行界定，并用該軟件進行部分數(shù)據(jù)的初步分析。

1.6 吖啶橙染色檢測細胞凋亡

在各個處理組處理3 dpf后，隨機選取每個處理組20條幼魚轉(zhuǎn)移到AO 2 mg·L-1的溶液（用PBS稀釋）中避光處理15 ～20 min。用新的PBS沖洗胚胎2次。隨后在0.16 g·L-1三甲卡因（用PBS稀釋）中處理5 ～10 min麻醉幼魚。在熒光體視顯微鏡下拍照，綠色熒光標記的細胞為AO染色的陽性凋亡細胞，測定整條魚的凋亡細胞，實驗重復3次。

1.7 原位雜交法檢測nrxn2aa和nrxn2abmRNA定位

利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)從線性化模板DNA合成地高辛標記的探針。12 hpf斑馬魚加入0.0045%1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）抑制色素生成，增加透明性。收集各濃度Hg?Cl2處理24，48和72 hpf的斑馬魚正常胚胎各6個，實驗步驟參照Thisse的方法［19］。將收集樣本重新水化和固定；60℃水浴預雜交>4 h；加入探針60℃溫浴過夜；探針回收，加入酶聯(lián)地高辛抗體4℃冰箱過夜；顯色和拍照。

1.8 q-PCR檢測nrxn2aa和nrxn2abmRNA表達

收集各濃度HgCl2處理24，48和72 hpf的斑馬魚正常胚胎各30個，按照Trizol說明書進行操作，提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以cDNA為模板進行q-PCR反應。以GAPDH作為參照。反應條件為：95℃15 s；55℃20 s；72℃20 s；共40個循環(huán)。nrxn2aa引物，上游：GCCTCCATGCACCTCTTCTT，下游：TGTCATTGAGCGGCTT?GTCG；nrxn2ab引物，上游：CAACGGATGGGA?CAAATGGG，下游：GTGGTGCTCAGGCTG?GAAGA；GAPDH引物，上游：TCTGACAGTCC?GTCTTGAGAAA，下游：ACAAAGTGATCGTT?GAGAGCAA。用溶解曲線檢測特異性，用標準曲線確定擴增效率。每個時間點和濃度均重復3次。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結果計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，利用SPSS軟件進行one-way ANOVA分析，兩兩比較采用Bonferroni法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HgCl2暴露對斑馬魚死亡率、孵化率和畸形率的影響

圖1可見，斑馬魚死亡率隨著HgCl2濃度的增加而上升，0.8 μmol·L-1處理組斑馬魚在120 hpf時的死亡率達到90%。HgCl20.4 μmol·L-1處理組在48 hpf時的孵化率高于正常對照組（P<0.01），72 hpf時正常對照組和處理組胚胎全部孵化，沒有明顯差異（因為正常生理情況下，72 hpf時斑馬魚已經(jīng)完成孵化）。另外，隨著HgCl2濃度的增加，斑馬魚的畸形率不斷升高，HgCl20.2 μmol·L-1處理組約為3.5%，0.4 μmol·L-1處理組約為30%，而0.8 μmol·L-1處理組在96和120 hpf時畸形率>98%。

2.2 HgCl2暴露在斑馬魚體內(nèi)的蓄積

圖2結果顯示，隨著HgCl2暴露濃度的增加，斑馬魚體內(nèi)Hg含量明顯增加，說明斑馬魚體內(nèi)出現(xiàn)明顯的Hg蓄積。

2.3 HgCl2暴露對斑馬魚自發(fā)活動的影響

Fig.2 Absorbed contents of Hg2+in zebrafish larvae after exposure to HgCl2for 3 d. x±s，n=3.**P<0.01，compared with normal control group.

對HgCl2處理5 d后的斑馬魚進行行為監(jiān)測，觀察5 min內(nèi)的自發(fā)活動。由于HgCl20.8 μmol·L-1處理組斑馬魚死亡率過高，故選取HgCl20.2和0.4 μmol·L-1處理組進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，兩組每分鐘運動距離和活動程度減少（P<0.01）（表1），表明HgCl2可抑制斑馬魚的自發(fā)活動。

Tab.1 Locomotor behavior of zebrafish after exposure to HgCl2for 5 d

2.4 HgCl2暴露對斑馬魚胚胎細胞凋亡的影響

選取HgCl20.2和0.4 μmol·L-1處理組進行檢測。如圖3所示，高亮的綠色斑點即為凋亡細胞，處理組斑馬魚的凋亡細胞主要集中在腦和脊柱部分，HgCl20.4 μmol·L-1組的凋亡細胞數(shù)目顯著高于正常對照組（P<0.01）。

Fig.1 Mortality（A），hatchability（B）and malformation（C）in larval zebrafish after exposure to HgCl2for 120 h post fertilization（hpf）.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0）group.

Fig.3 Apoptosis analysis in zebrafish larvae stained with acridine orange（AO）.Zebrafish was exposed to HgCl2for 3 d post fertilization（dpf）.B was the quantitative results of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with normal control group.The arrows show apoptosis.

Fig.4 Expression ofneurexin（nrxn）2aaandnrxn2abin zebrafish exposed to HgCl20.4 μmol·L-1.From whole mountin situhybridization，nrxn2aa（A）andnrxn2ab(B)（left：lateral view；right：dorsal view）were mainly expressed in the central nervous system and the mRNA level of the two genes was detected by qPCR in 24（C），48（D）and 72 hpf（E）.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control group.

2.5 HgCl2暴露對斑馬魚nrxn2a表達的影響

由圖4A和4B的原位雜交圖片可以看出，nrxn2aa和nrxn2ab的表達主要集中于腦和脊柱，尤其在48 h時在腦部居多。由圖4C，4D和4E的 RT-PCR與正常對照組相比，HgCl2處理組在24和72 hpf兩個時間點時，nrxn2aamRNA表達上調(diào)，分別為正常對照組的1.64（P<0.01）和1.46（P<0.05）倍；nrxn2abmRNA表達在24和48 hpf時低于正常對照組（P<0.05）。而nrxn2aa在48 hpf時間點以及nrxn2ab在72 hpf時間點，處理組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

斑馬魚除具有易飼養(yǎng)、實驗操作方便等特點外，胚胎和早期幼魚在神經(jīng)發(fā)育毒性研究中又有獨特優(yōu)勢［20-21］。Korbas等［22］研究表明，斑馬魚能夠吸收環(huán)境中的Hg至腦、眼、脊柱等各器官和細胞內(nèi)，從而對斑馬魚的視覺和運動產(chǎn)生危害。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著HgCl2暴露濃度的升高，斑馬魚體內(nèi)Hg含量增加。斑馬魚運動行為按照固定的順序發(fā)育，發(fā)育到5 dpf開始能夠產(chǎn)生運動、探索、學習等一系列復雜行為的變化。行為學的檢測雖然相對比較簡單，但可以從宏觀上早期發(fā)現(xiàn)外源性化合物引起的神經(jīng)功能性障礙，較引起器質(zhì)性改變后的病理學檢查更為直接、敏感并且經(jīng)濟、有效。本研究結果表明，通過低劑量HgCl2的暴露，斑馬魚活動受到一定程度的抑制，活動時間和游動距離均有降低。有研究認為，Hg暴露能夠損傷斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而影響斑馬魚的運動［23］。但斑馬魚運動抑制產(chǎn)生的原因是否與Hg中毒所致的中樞神經(jīng)和運動神經(jīng)功能障礙相關或是由于如眼、骨骼肌發(fā)育不良等相關組織有關尚需進一步研究。

Ung等［24］研究表明，Hg的肝毒性是由氧化應激、凋亡通路觸發(fā)。Hg能夠下調(diào)核受體和Gsk3激酶活性，導致線粒體功能障礙。Gonzalez等［25］研究發(fā)現(xiàn)，HgCl2也能引起斑馬魚肝、骨骼肌和腦細胞的凋亡。本研究AO染色結果顯示，HgCl2可以導致斑馬魚體內(nèi)細胞凋亡明顯增多，凋亡細胞遍布全身，主要集中在腦和脊柱部分。但HgCl2導致細胞凋亡的具體機制有待進一步研究。

Nrxn是一類重要的神經(jīng)黏附分子，它和神經(jīng)連接蛋白是分別位于突觸前膜和突觸后膜的跨膜蛋白。這兩種蛋白可以相互結合，在突觸的組裝、分化以及突觸發(fā)揮其傳遞信息的功能方面起到核心的調(diào)控作用。越來越多的研究顯示，nrxn基因突變與多種認知障礙有關，例如自閉癥、精神分裂癥和智力缺陷［7］。Pizzarelli等［26］等研究表明，nrxn2a的突變會增加患自閉癥的風險。Dachtler等［27］nrxn2a基因敲除小鼠實驗提示，nrxn2a基因缺失和小鼠自閉癥樣行為發(fā)生有因果關系。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，自閉癥兒童患者體內(nèi)Hg的含量明顯高于正常對照組［28］。本研究通過原位雜交技術對nrxn2a時空表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)nrxn2a主要表達在大腦和脊柱區(qū)域，這與See等［29］研究結果相一致，即nrxn2a在腦和脊柱均有表達，2個亞型nrxn2aa和nrxn2ab均在24 hpf達到高峰，在31 hpf表達開始降低。在24 hpf，nrxn2aa表達主要集中在腦，而nrxn2ab表達在腦和脊柱比較均勻。這些表達方式提示，二者可能在腦的發(fā)育過程中均起到重要作用。

本研究通過Viewpoint Lab系統(tǒng)對斑馬魚進行行為學監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過HgCl2暴露的斑馬魚，活動時間和每分鐘移動距離都降低。同時qPCR檢測發(fā)現(xiàn)斑馬魚腦和脊柱區(qū)域nrxn2a的mRNA水平表達改變，提示HgCl2可能通過影響神經(jīng)系統(tǒng)nrxn2a的表達而導致斑馬魚神經(jīng)行為學的改變，為HgCl2神經(jīng)毒性作用機制的探討提供了一個新的視角。

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Effect of HgCl2on zebrafish embryonic development and nuerexin2a gene expression

FAN Cheng-ji1*，TU Hong-wei1*，CHEN Xiao-hui2，LIU Jia-xian1，PENG Tao1，MENG Xiao-jing1
（1.Department of Occupational Health and Occupational Medicine，Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research，School of Public Health and Tropical Medicine，2.Key Laboratory of Zebrafish Modeling and Drug Screening for Human Diseases of Guangdong Higher Education Institutes，Department of Developmental Biology，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

OBJECTIVE To investigate the developmental toxicology of mercury chloride（HgCl2）in zebrafish embryos and larvae，and determine its effects on neurobehavior and neurexin（nrxn）2agene expression.METHODS Wild-type zebrafish embryos/larvae were exposed to HgCl20.2-0.8 μmol·L-1.The mortality，hatching rate and malformation of zebrafish were determined.The content of Hg in zebrafish was detected by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）analysis.Locomotor activity of zebrafish larvae was detected by a Video-Track system.Cell apoptosis in embryos was observed by the staining of acridine orange（AO）.Expression ofnrxn2awas examined byin situhybridization and quantitative PCR（qPCR）.RESULTS Compared with control，mortality started to increase after the zebrafish was treated with HgCl20.8 μmol·L-1for 72 h and reached 94%at 120 h post fertilization（hpf）（P<0.01）.Moreover，the hatching rate was significantly increased in the zebrafish treated with HgCl20.4 μmol·L-1for 48 h.HgCl2had significantly deleterious effects on zebrafish embryonic development，as mainly evidenced by spinal curvature and yolk edema.Malformation and Hg accumu?lation were markedly increased（P<0.05，P<0.01）.The content of Hg reached 77 μg·g-1in zebrafish treated with HgCl20.8 μmol·L-1.Moreover，compared with control，the velocity and the proportion of activity were significantly inhibited，while the apoptosis was markedly increased in zebrafish larvae exposed with HgCl20.4 μmol·L-1（P<0.05，P<0.01）.mRNA level ofnrxn2aawas up-regulated in zebrafish embryos at 24 hpf（P<0.01）and 72 hpf（P<0.05），while mRNA level ofnrxn2abwas down-regulated at 24 and 48 hpf（P<0.05）.CONCLUSION The development of zebrafish embryos and larvae is inhibited because of toxicity of HgCl2，which is probably associated with changes innrxn2aexpression.

HgCl2；zebrafish；neurexin2a；apoptosis；behavior，animal

MENG Xiao-jing，E-mail：xiaojingmeng@smu.edu.cn，Tel：（020）61648471

R396.4

A

1000-3002-（2016）08-0860-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.010

Foundation item：TheprojectsupportedbyNationalBasicResearchProgram ofChina（2012CB525004）

2016-03-04接受日期：2016-07-17）

（本文編輯：齊春會）

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2012CB525004）

樊成吉，碩士研究生，主要從事重金屬毒物的神經(jīng)毒性作用及機制研究。

孟曉靜，E-mail：xiaojingmeng@smu.edu.cn，Tel：（020）61648471

*共同第一作者。

*Co-first author.