人免疫系統(tǒng)重建NPG小鼠不能誘發(fā)直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)陽性反應(yīng)

郭巖乳，曾繁光，姚景春，孫 蓉，劉兆華

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院新藥評價(jià)中心，山東濟(jì)南 250012；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400；3.山東省中醫(yī)研究院，山東濟(jì)南 250014）

人免疫系統(tǒng)重建NPG小鼠不能誘發(fā)直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)陽性反應(yīng)

郭巖乳1，曾繁光1，姚景春2，孫 蓉3，劉兆華1

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院新藥評價(jià)中心，山東濟(jì)南 250012；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂273400；3.山東省中醫(yī)研究院，山東濟(jì)南 250014）

目的 觀察陽性藥物D-鹽酸青霉胺（D-pen）和鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)的人免疫系統(tǒng)重建NPG（hu-NPG）小鼠的直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)（d-PLNA）反應(yīng)，并比較其與NPG和BALB/c小鼠反應(yīng)的異同，探索可提高藥物超敏反應(yīng)預(yù)測價(jià)值的模型動(dòng)物。方法 雌性NPG小鼠，1.8 Gy的X線輻照后，植入人臍血造血干細(xì)胞，制備hu-NPG小鼠，取外周血，進(jìn)行淋巴細(xì)胞表型分析及淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。hu-NPG，NPG和BALB/c小鼠各10只，每種小鼠隨機(jī)分成D-pen和STZ組，每組5只。各組分別在右后肢足趾部sc給予D-pen每只1 mg或STZ 0.75 mg，左后肢不做處理作為對照。注射后7 d處死小鼠，取左、右側(cè)腘窩淋巴結(jié)稱重，計(jì)算質(zhì)量指數(shù)；將淋巴結(jié)制成單細(xì)胞懸液，計(jì)算細(xì)胞指數(shù)，并對部分淋巴結(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以比較d-PLNA反應(yīng)。結(jié)果 注射陽性藥物D-pen和STZ后，各組小鼠一般狀態(tài)良好，均未見全身毒性，且至處死時(shí)局部炎性刺激癥狀消失。D-pen和STZ均能誘導(dǎo)BALB/c小鼠出現(xiàn)典型的d-PLNA陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為注射側(cè)淋巴結(jié)質(zhì)量和細(xì)胞數(shù)量比對照側(cè)增加，平均質(zhì)量指數(shù)≥2或平均細(xì)胞指數(shù)≥5。而NPG小鼠和hu-NPG小鼠均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，NPG和hu-NPG小鼠的腘窩淋巴結(jié)體積明顯小于BALB/c小鼠，發(fā)育不完善。淋巴細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)，NPG小鼠僅有少量淋巴細(xì)胞，而hu-NPG小鼠外周血中人源性淋巴細(xì)胞以CD45+CD19+的B細(xì)胞為主，CD45+CD3+T細(xì)胞較少，且絲裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠體內(nèi)的人源或鼠源性淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)論 D-pen和STZ所致的小鼠d-PLNA陽性反應(yīng)依賴于體內(nèi)正常的淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能。NPG小鼠缺乏正常淋巴細(xì)胞，d-PLNA反應(yīng)陰性。hu-NPG小鼠體內(nèi)的人淋巴細(xì)胞功能不全，也不能誘發(fā)陽性反應(yīng)。因此，hu-NPG小鼠尚不能成為d-PLNA的敏感動(dòng)物。

藥物超敏反應(yīng)；直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)；人源化小鼠

藥物超敏反應(yīng)（drug hypersensitivity reaction，DHR）是藥物正常使用過程中出現(xiàn)的一種免疫激活性病理綜合征。該綜合征與藥物的藥理作用無直接關(guān)系，常在治療劑量下產(chǎn)生且無劑量依賴性，即具有B型藥物不良反應(yīng)的特征［1-2］。它的臨床表現(xiàn)和癥狀與多種疾病相似，缺乏有效的診斷方法，極易被誤診或漏診［3-4］；DHR可通過免疫或非免疫機(jī)制介導(dǎo)發(fā)生，同時(shí)還易受多種因素影響，這種復(fù)雜性致使目前尚無有效的臨床前評價(jià)方法準(zhǔn)確預(yù)測其發(fā)生，使之成為臨床用藥及藥物研發(fā)的瓶頸而廣受重視［5-6］。準(zhǔn)確預(yù)測DHR發(fā)生以及發(fā)現(xiàn)特異性診斷生物標(biāo)志物，需要新的評價(jià)模型。腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)（popliteal lymph node assay，PLNA）是一種預(yù)測小分子藥物致敏潛能的常用模型，盡管其機(jī)制不清，但目前被認(rèn)為是唯一可靠的有效模型。本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了小鼠的PLNA模型，并用于探索了中藥注射劑的致敏性［7-8］。但因動(dòng)物和人之間存在著種屬差異，妨礙了實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至臨床。本研究用人免疫系統(tǒng)重建NPG小鼠（humanized NPG mice with a reconstituted immune system，hu-NPG小鼠）復(fù)制直接PLNA（direct PLNA，d-PLNA）模型，比較其與NPG和BALB/c小鼠反應(yīng)的異同，探索尋找能消除種屬差異、提高DHR預(yù)測值的敏感動(dòng)物。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

8周齡雌性NPG小鼠，體質(zhì)量22 ～24 g，購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號：11806300000184；BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2012-0001。D-鹽酸青霉胺（D-penicil?lamine hydrochloride，D-pen），美國Mp Biomedi?cals公司，批號151806；鏈脲佐菌素（streptozoto?cin，STZ）（批號S0130）、植物血凝素（phytohae?magglutinin，PHA）（批號L1668）和脂多糖（lipo?polysaccarides，LPS）（批號L4391），美國Sigma公司；PANSORBIN?細(xì)胞〔金黃色葡萄球菌細(xì)胞（Staphylococcus aureus cells，SAC）〕（批號507858），美國Millipore公司；抗小鼠流式檢測抗體：APC-CD45（103112），F(xiàn)ITC-CD3（100203），APC-B220（103311），APC-CD4（100411）和PE/ Cy5-CD8a（100709）為美國Biolegend產(chǎn)品；抗人流式檢測抗體：FITC-CD45（555482），PE-CD19（555413），F(xiàn)ITC-CD3（347344），APC-CD4（317415）和PE-CD8a（340046）為美國BD Biosciences產(chǎn)品；部分人臍帶血由濟(jì)南賽爾生物科技有限公司惠贈(zèng)。AB135-S型分析天平，瑞士梅特勒公司；Minispin型離 心機(jī) ，德 國 Appendorf公司 ；CYT-1000型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國CytoreconTM公司；RS2000型X-ray生物學(xué)輻照儀，美國Rad Source公司。

1.2 hu-NPG小鼠的構(gòu)建和篩選

取采集好的人臍帶血樣品，分別用無菌PBS溶液稀釋2倍，緩慢加入預(yù)裝15 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管液面上，室溫下500×g離心25 min；收集單個(gè)核細(xì)胞富集的液體；加PBS洗滌1次，再用含0.1%BSA的PBS（BSA-PBS）離心洗滌1次后計(jì)數(shù)。按每2×108細(xì)胞加BSA-PBS 300 μL、阻斷液100 μL和CD34抗體磁珠100 μL，4 ～8℃保溫30 min，期間不斷搖動(dòng)混勻，PBS洗滌，離心。每2×108標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞加入BSA-PBS 0.5 mL使分散成為單細(xì)胞懸液。將液體加入置于磁架上的預(yù)濕磁珠分離柱內(nèi)，待液體不再滴落后，用BSA-PBS 0.5 mL洗脫3次。將分離柱從磁鐵上取下，放在離心管中，加BSA-PBS 1.0 mL以筒芯推出，收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞，備用。

取NPG小鼠35只，X-ray生物學(xué)輻照儀照射1.8 Gy。小鼠輻照處理后4 ～24 h內(nèi)，ip給予三溴乙醇（tribromethanol，Avertin）溶液20 mL·kg-1麻醉。用1 mL精細(xì)刻度胰島素注射器先在小鼠膝關(guān)節(jié)股骨面向骨髓腔鉆孔，然后用另一只相同規(guī)格注射器吸取20 μL上述制備的細(xì)胞懸浮液，從孔內(nèi)把人臍帶血CD34+細(xì)胞注射植入骨髓腔內(nèi)（每鼠1× 105細(xì)胞）。小鼠蘇醒后放回籠內(nèi)，在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)。

照射處理的NPG小鼠移植人CD34+細(xì)胞12周，采血約50 μL放入肝素抗凝的1.5 mL離心管中，分別加入不同熒光標(biāo)記的抗小鼠或抗人的流式抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色。利用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測分析。以有核細(xì)胞群設(shè)門，分析小鼠外周血中人CD45+細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例。選擇人CD45+細(xì)胞>20%的hu-NPG小鼠進(jìn)行d-PLNA。

1.3 直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)

NPG，hu-NPG和BALB/c小鼠各10只，每種小鼠均隨機(jī)分為D-pen和STZ組，每組5只，共6組。每組小鼠右后肢足趾部以75%乙醇消毒，用胰島素注射器分別皮下注射陽性藥物D-pen每只1 mg或STZ每只0.75 mg，給藥體積為50 μL，以0.9%生理鹽水為溶媒，左側(cè)不做處理。給藥后記錄小鼠一般狀態(tài)，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量足趾厚度。給藥后7 d，頸椎脫臼法處死小鼠；迅速取出左、右側(cè)腘窩淋巴結(jié)（popliteal lymph node，PLN），放入置于冰上盛有1%BSA-PBS的培養(yǎng)皿中，去除脂肪組織，吸干水分，稱重。制備單細(xì)胞懸液。計(jì)算淋巴結(jié)質(zhì)量指數(shù)（mass index，MI）和細(xì)胞指數(shù)（cellularity index，CI）。MI=右側(cè)PLN質(zhì)量/左側(cè)PLN質(zhì)量，CI=右側(cè)PLN細(xì)胞計(jì)數(shù)/左側(cè)PLN細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 流式檢測外周血淋巴細(xì)胞增殖

照射處理的NPG小鼠移植人CD34+細(xì)胞12周，取肝素抗凝血約100 μL，加入PBS 1 mL，離心去上清，加入紅細(xì)胞裂解液0.6 mL，作用10 min。加入0.6 mL沖洗液離心去上清；PBS洗滌1次。用1 mL含5 μmol·L-1CFSE熒光染料的PBS懸浮細(xì)胞，室溫避光15 min。用10 mL PBS洗滌1次。以5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；37℃溫育30 min。培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，調(diào)細(xì)胞密度為1×109L-1。每孔加入100 μL。每份樣品接種3孔。一孔加入100 μL培養(yǎng)液稀釋的PHA，終濃度為5 mg·L-1；一孔加入100 μL培養(yǎng)液稀釋的0.01% PANSORBIN?細(xì)胞，終濃度為0.005%；另一空孔加入100 μL培養(yǎng)液作為空白對照。37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育72 h；收集細(xì)胞，加入抗CD45或CD19流式抗體，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測分析人CD45+細(xì)胞在PHA刺激下有無CFSE熒光強(qiáng)度的倍減，及人CD19+B細(xì)胞在SAC刺激下有無CFSE熒光強(qiáng)度的倍減，計(jì)算熒光強(qiáng)度倍減細(xì)胞的比例。同樣檢測BALB/c和空白NPG小鼠外周血的淋巴細(xì)胞增殖，刺激B細(xì)胞的絲裂原為LPS 50 mg·L-1。

1.5 臟器系數(shù)和病理學(xué)檢查

各組小鼠均于給藥前和處死前稱量體質(zhì)量。給藥后每日用游標(biāo)卡尺測量足趾厚度。摘取心、肝、脾和腎等器官織稱重，計(jì)算臟器系數(shù)〔臟器濕重（g）/動(dòng)物體質(zhì)量（g）×100〕。組織病理學(xué)檢查時(shí)，標(biāo)本迅速投入4%中性多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)制片，切片厚度3 μm，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。與對照側(cè)比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）且平均MI≥2或平均CI≥5時(shí)為PLNA反應(yīng)陽性。

2 結(jié)果

2.1 hu-NPG小鼠外周血淋巴細(xì)胞表型分析

35只NPG小鼠照射并移植人臍血來源的CD34+造血干細(xì)胞，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束存活率為85.7%（5只小鼠因照射死亡），存活小鼠的一般狀態(tài)良好。移植后12周，流式細(xì)胞術(shù)檢查可見26只小鼠外周血有核細(xì)胞中可見人CD45+陽性細(xì)胞，提示這些小鼠體內(nèi)不同程度地重建了人的免疫系統(tǒng)，其中10只小鼠人CD45+陽性細(xì)胞數(shù)>20%（29.8±4.7）%，達(dá)到本研究預(yù)定的hu-NPG小鼠標(biāo)準(zhǔn)。

10只hu-NPG小鼠外周血人源和鼠源T、B淋巴細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)，人的淋巴細(xì)胞以CD45+CD19+的B細(xì)胞為主，約為（75.5±6.6）%，CD45+CD3+T細(xì)胞占（17.1±6.6）%，其中CD45+CD3+CD4+T細(xì)胞為（11.6±3.7）%和CD45+CD3+CD8+T為細(xì)胞（5.5±3.1）%，即人T細(xì)胞的比例僅為hu-NPG小鼠外周血有核細(xì)胞總數(shù)的（5.0±1.7）%。同時(shí)，hu-NPG小鼠體內(nèi)也含有少量的鼠源性CD3+T和B220+B細(xì)胞，二者占有核細(xì)胞的比例分別約為（3.6±2.7）%和（0.1±0.2）%，這與NPG小鼠體內(nèi)鼠源性CD3+T（2.34±0.49）%和B220+B（0.40± 0.28）%占有核細(xì)胞的比例基本接近，但顯著低于BALB/c小鼠（P<0.01）（圖1）。

2.2 d-PLNA小鼠一般狀態(tài)、臟器系數(shù)、組織病理和足趾厚度的變化

表1數(shù)據(jù)顯示，足趾部sc給予兩種陽性藥物后7 d，NPG，hu-NPG和BALB/c小鼠一般狀態(tài)良好。與給藥前比較，同種小鼠之間體質(zhì)量比較未見明顯改變，且其心、肝和腎的濕重及臟器系數(shù)組間未見明顯差異。但NPG和hu-NPG小鼠的脾系數(shù)明顯低于BALB/c小鼠（P<0.01），且hu-NPG小鼠的脾系數(shù)顯著高于NPG小鼠（P<0.01）。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，NPG小鼠脾缺乏脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘，細(xì)胞密度明顯減少，白髓和紅髓分界模糊。盡管hu-NPG小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)量比BALB/c小鼠少，但比NPG小鼠明顯增多，且有明顯的脾白髓重建形成（圖2）。

Fig.1 Phenotype analysis of human or mouse derived lymphocytes in peripheral blood from humanized NPG mice with reconstituted immune system（hu-NPG），NPG and BALB/c mice.

Tab.1 Effect of D-pen and STZ treatment on body mass and organ coefficient in different strains of mice

Fig.2 Histopathology of spleen in direct popliteal lymph node assay（d-PLNA）in different strains of mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：spleen of normal BALB/c mice；B：spleen of NPG mice，lack of white pulp;C：spleen of hu-NPG mice，reconstitution ofwhitepulp.WP：white pulp；RP：red pulp；MZ：marginal zone.The arrow indicates periarterial lymphatic sheath around the central artery.

給藥局部觀察顯示（圖3），各組給藥前足趾部厚度左、右后肢無顯著差異；給藥后前4 d，與對照側(cè)比較，給藥側(cè)足趾厚度明顯腫脹增厚（P<0.05，P<0.01），主要表現(xiàn)為局部急性炎癥反應(yīng)，且BALB/c小鼠右側(cè)測量數(shù)值明顯大于NPG或hu-NPG小鼠右側(cè)數(shù)值（P<0.01），隨時(shí)間延長，局部炎癥逐漸消退，至給藥后6 d時(shí)，給藥局部已基本恢復(fù)正常，與左側(cè)比較無顯著差異。

2.3 陽性藥物注射后的d-PLNA

Fig.3 Effect of STZ（A）and D-pen（B)on thickness of lateral hind foot pad in direct popliteal lymph node assay in different strains of mice.See Tab.1 for the mouse treatment.*P<0.05，**P<0.01，compared with control lateral hind foot pad.

陽性藥物D-pen和STZ注射后，BALB/c小鼠出現(xiàn)典型的d-PLNA陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為與對照側(cè)比較，給藥側(cè)PLN體積明顯增大，質(zhì)量增加（P<0.05）且組平均MI≥2（表2）。細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，陽性對照藥可致PLN細(xì)胞增生，數(shù)量增多，細(xì)胞大小不一致，PLN單細(xì)胞懸液中可見體積較大的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，給藥側(cè)淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)量比對照側(cè)顯著增多（P< 0.05），組平均CI≥5（表3，圖4）。顯微鏡觀察可見，未給藥側(cè)BALB/c小鼠PLN的皮質(zhì)、副皮質(zhì)區(qū)與髓質(zhì)界線清楚，不含或很少淋巴濾泡，無明顯生發(fā)中心；副皮質(zhì)區(qū)內(nèi)高內(nèi)皮小靜脈（high endothelial ven?ule，HEV）較小，內(nèi)皮低矮，腔內(nèi)幾乎不含細(xì)胞成分；髓質(zhì)不含或含有很少數(shù)量的組織細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，STZ或D-pen均可致BALB/c小鼠給藥側(cè)PLN淋巴濾泡數(shù)量增加，生發(fā)中心明顯，致使PLN表面呈凹凸不平狀；細(xì)胞密度和HEV橫斷面增多，HEV的上皮呈高柱狀凸入血管腔中，且腔內(nèi)含有較多的淋巴細(xì)胞（圖5A，B）。NPG及hu-NPG小鼠給藥側(cè)，對照側(cè)PLN未見差異，二者均體積較小，僅為正常BALB/c小鼠的約1/3，辨認(rèn)困難，易遺漏。鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，PLN缺乏正常的組織結(jié)構(gòu)，皮髓質(zhì)分界不清且表面光滑，淋巴結(jié)發(fā)育不完善（圖4，圖5C）。提示D-pen和STZ不能誘導(dǎo)NPG及hu-NPG小鼠產(chǎn)生d-PLNA陽性反應(yīng)。

Tab.2 Average popliteal lymph node（PLN）mass index（MI）of different mice

Tab.3 Average PLN cellularity index（CI）of different mice

Fig.4 Volume and lymphocyte changes of PLN in d-PLNA in different strains of mice.A：the photos from left to right are 2 PLN of NPG mice treated with STZ，hu-NPG mice treated with STZ，BALB/c mice treated with D-pen and BALB/c mice treated with STZ，respectively.Upper：treated lateral PLN；lower：control lateral PLN.The arrow indicates enlarged treated lateral PLN with STZ in BALB/c mice.B：cell counting of control lateral PLN in BALB/c mice；C：cell counting of STZ treated lateral PLN in BALB/c mice.The arrow indicates enlarged lymphocyte.

Fig.5 Histopathology of PLN in direct popliteal lymph node assay in different strains of mice.GC：germinal center.A：STZ treated lateral PLN of BALB/c mice，positive PLNA responses；B：same lymph node as Fig.A，lymphoid follicle formation and high endothelial venule（HEV）increase（arrow）. There were obvious lymphocytes in HEV；C：STZ treated lateral PLN of hu-NPG mice，lack of lymphoid tissue.

2.4 絲裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠外周血中人源或鼠源性淋巴細(xì)胞增殖

Fig.6 Lymphocyte transformation in hu-NPG mice. Lymphocytes were incubated with PHA 5 mg·L-1or 0.005% PANSORBIN?cells for 72 h.

Fig.7 Lymphocyte transformation in BALB/c mice and NPG mice.Lymphocytes were incubated with PHA 5 mg·L-1or LPS 50 mg·L-1for 72 h.

圖6結(jié)果顯示，hu-NPG小鼠的外周血人CD45+或CD19+單核細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（1.2±0.7）%和（0.5±0.3）%，與未加絲裂原刺激的細(xì)胞對照組比較未見顯著性差異（n=5），提示絲裂原未能刺激hu-NPG小鼠的外周血人源性淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯增殖。圖7結(jié)果顯示，NPG小鼠外周血鼠源CD45+單核細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（1.3±0.6）%和（1.8±1.3）%，與未加絲裂原刺激的細(xì)胞對照組比較未見顯著性差異（n=5）。而BALB/c小鼠外周血鼠源性CD45+單核細(xì)胞與PHA或LPS共孵育72 h后，CFSE熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的比例分別為（2.9± 0.6）%和（12.4±1.8）%，與未加絲裂原刺激的對照組比較顯著增加（n=5，P<0.01），表明絲裂原可刺激BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的增殖反應(yīng)。提示BALB/c小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞功能正常，但NPG和hu-NPG小鼠外周血中無論是人源還是鼠源性淋巴細(xì)胞的功能均有缺陷。

3 討論

小分子藥物所致的DHR目前尚無公認(rèn)有效的預(yù)測方法。對于靜脈給藥的這些化合物，國際上通常應(yīng)用PLNA研究評價(jià)其致敏性潛能，被公認(rèn)為是目前唯一可靠的致敏性檢測方法［9］。根據(jù)給藥處理方式的不同，PLNA可分為d-PLNA、間接PLNA等多種類型。其中d-PLNA周期短，操作簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人臨床DHR間具有較好的一致性和可重復(fù)性，最有可能通過驗(yàn)證而廣泛用于全身給藥新藥的DHR篩選和研究。然而d-PLNA陽性反應(yīng)的機(jī)制不清楚，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，不易區(qū)分免疫機(jī)制介導(dǎo)的反應(yīng)和刺激性因素引起的炎癥反應(yīng)，妨礙了d-PLNA結(jié)果的外推至人。已證實(shí)，對氨基苯可誘導(dǎo)嚴(yán)重的DHR，卻不能誘發(fā)d-PLNA陽性反應(yīng)，而非致敏物丙酮或乙醇卻能誘導(dǎo)明顯的d-PLNA陽性反應(yīng)［10-14］。因此，d-PLNA作為常規(guī)評價(jià)方法還需要進(jìn)一步的發(fā)展和完善。近年來應(yīng)用人源化動(dòng)物對藥物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的毒性測試取得了較大進(jìn)展［15-16］，但尚無人源化小鼠用于d-PLNA的報(bào)道。

NOD-PrkdcscidIl2rgnull小鼠由于突變基因而影響到自身淋巴細(xì)胞的分化和發(fā)育，但是其淋巴細(xì)胞發(fā)育微環(huán)境正常，成為目前國際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高、最適合人源細(xì)胞移植的工具小鼠，為在小鼠體內(nèi)重建人的免疫系統(tǒng)和功能奠定了基礎(chǔ)［17］。NPG小鼠是北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的同類小鼠。為了消除種屬差異，提高臨床前預(yù)測DHR的能力及闡明d-PLNA反應(yīng)機(jī)制，本研究將人臍血CD34+造血干細(xì)胞移植入照射后NPG小鼠體內(nèi)，以期在免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建人的免疫系統(tǒng)和功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，接受人臍血移植的小鼠外周血中可檢測到人CD45+白細(xì)胞表型，且有人的B和T細(xì)胞分化，表明hu-NPG小鼠模型復(fù)制成功。但hu-NPG小鼠體內(nèi)的人源性細(xì)胞以B細(xì)胞為主，T細(xì)胞僅為少數(shù)（約5%）。而正常人外周血中以T為主，B細(xì)胞僅占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10% ～20%，這種明顯差異提示hu-NPG小鼠重建的免疫系統(tǒng)與人的免疫系統(tǒng)之間存在較大差異。進(jìn)一步利用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測hu-NPG小鼠體內(nèi)人源化T和B細(xì)胞的功能發(fā)現(xiàn)，PHA和SAC均不能誘導(dǎo)人源性細(xì)胞發(fā)生明顯增殖反應(yīng)，表明這些淋巴細(xì)胞盡管具有人淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志物，但免疫功能卻不完善，這可能與該小鼠缺乏主要組織相容性復(fù)合體分子，T細(xì)胞不能在胸腺選擇成熟有關(guān)［17］。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)NPG小鼠和hu-NPG小鼠的外周血內(nèi)含有少量鼠源性T和B細(xì)胞，但這些鼠源性T和B細(xì)胞也均不能對有絲分裂原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)。上述結(jié)果表明hu-NPG小鼠的免疫功能不全。這與重建具有一定人免疫功能的人源化小鼠還需提供人淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)因子的文獻(xiàn)報(bào)道相一致［17-20］。鑒于缺乏有效免疫功能，提示hu-NPG小鼠不能對藥物產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

1981年Gleichmann等［21］首次將苯妥英注射入小鼠足趾部發(fā)現(xiàn)，PLN產(chǎn)生與移植物抗宿主反應(yīng)相似的病變，由此開始了PLNA在DHR研究中的應(yīng)用。不同實(shí)驗(yàn)室間已經(jīng)用PLNA檢測了130余個(gè)已知具有致敏性的小分子化合物，獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PLNA以藥物在致敏誘導(dǎo)階段局部引流淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖為觀察終點(diǎn)。因此，動(dòng)物的免疫功能或局部炎癥反應(yīng)可以影響PLNA反應(yīng)。前期我們已經(jīng)成功建立了BALB/c小鼠d-PLNA模型，并研究了中藥注射劑的致敏性［8，22-23］。本研究進(jìn)一步利用可致敏的陽性藥物在hu-NPG小鼠中復(fù)制d-PLNA模型，觀察比較其與NPG小鼠和BALB/c小鼠的反應(yīng)差異。分別以STZ和D-pen為陽性藥物，是因?yàn)樗鼈兛煞謩e誘導(dǎo)Th1和Th2型免疫反應(yīng)，利于進(jìn)一步利用報(bào)告抗原PLNA闡明藥物引起d-PLNA陽性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制［24-25］。研究結(jié)果顯示，BALB/c，NPG和hu-NPG小鼠足趾部注射陽性藥物后，小鼠一般狀態(tài)良好，給藥前后體質(zhì)量沒有明顯變化。盡管因年齡、種系差異，BALB/c，NPG和hu-NPG小鼠的體質(zhì)量有一定差異，但其心、肝、腎的臟器系數(shù)之間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)合病理組織學(xué)檢查未見異常，表明陽性藥物無全身毒性作用。給藥局部觀察顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)局部炎癥反應(yīng)消失，足趾厚度恢復(fù)正常，表明本試驗(yàn)的陽性反應(yīng)與炎癥刺激無關(guān)，即所選的劑量不會(huì)產(chǎn)生明顯的局部刺激。上述結(jié)果表明，本研究的劑量和時(shí)間選擇符合d-PLNA要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性藥物可引起B(yǎng)ALB/c小鼠產(chǎn)生顯著的d-PLNA反應(yīng)，但卻不能誘導(dǎo)NPG和hu-NPG小鼠產(chǎn)生陽性反應(yīng)。結(jié)合前述淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明STZ和D-pen所致小鼠d-PLNA反應(yīng)與體內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能密切相關(guān)，缺少淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞功能不正常均不能誘導(dǎo)d-PLNA陽性反應(yīng)。故這種hu-NPG小鼠尚不適用于d-PLNA。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，免疫缺陷小鼠同時(shí)移植人胚胎胸腺組織和肝組織或敲入人細(xì)胞因子基因可產(chǎn)生具有一定功能的T細(xì)胞，并可產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)［17-18］，這為進(jìn)一步完善d-PLNA提供了新模型動(dòng)物。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，NPG和hu-NPG小鼠脾系數(shù)明顯低于BALB/c小鼠，且肉眼檢查可見NPG小鼠和hu-NPG小鼠的脾均顯著小于BALB/c小鼠。組織病理學(xué)檢查可見，NPG小鼠脾缺乏脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘，細(xì)胞密度明顯減少，白髓和紅髓分界模糊，這與這些小鼠的自身免疫系統(tǒng)功能缺陷有關(guān)。值得注意的是，hu-NPG小鼠的脾系數(shù)盡管低于正常BALB/c小鼠，但卻顯著大于NPG小鼠，脾細(xì)胞數(shù)量盡管比BALB/c小鼠少，但比NPG小鼠明顯增多，且有脾小體和動(dòng)脈周圍淋巴鞘形成?？紤]到NPG和hu-NPG小鼠淋巴結(jié)大小未見區(qū)別，提示hu-NPG小鼠脾的免疫結(jié)構(gòu)或功能重建比淋巴結(jié)重建更完善。事實(shí)上，已有一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)免疫缺陷小鼠脾內(nèi)人造血細(xì)胞出現(xiàn)多系重建，可檢測到人CD45+，CD4+和CD8+表達(dá)細(xì)胞［18，20］。因?yàn)槠⒖梢哉J(rèn)為是靜脈給藥的引流淋巴結(jié)，靜脈給藥是否較易引起hu-NPG小鼠脾發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Pirmohamed M，Ostrov DA，Park BK.New genetic findings lead the way to a better understanding of fundamental mechanisms of drug hypersensitivity［J］.J Allergy Clin Immunol，2015，136（2）：236-244.

［2］Makowska JL，Lewandowska-Polak A，Kowalski ML. Hypersensitivity to aspirin and other NSAIDs：diag-nostic approach in patients with chronic rhinosinus itis［J］.Curr Allergy Asthma Rep，2015，15（8）：47.

［3］Duranfigueroa N，Badillocorona JA，Naisbitt DJ，Castrejonflores JL.Towards the development of mechanism-based biomarkers to diagnose drug hypersensitivity［J］.Toxicol Res，2015，4（4）：777-795.

［4］Ratajczak HV.Drug-induced hypersensitivity：role in drug development［J］.Toxicol Rev，2004，23（4）：265-280.

［5］Pichler WJ.Immune mechanism of drug hypersen?sitivity［J］.Immunol Allergy Clin North Am，2004，24（3）：373-397.

［6］Ebo DG，Leysen J，Mayorga C，Rozieres A，Knol EF.Thein vitrodiagnosis of drug allergy：status and perspectives［J］.Allergy，2011，66（10）：1275-1286.

［7］Liu ZH，Liu ZP，Zhou GY.Application of popliteal lymph node assay in study of drug hypersensitivity［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2009，23（1）：70-75.

［8］Liu Z，Liu Z，Shi Y，Zhou G.Evaluation of the immunosensitizing potential of chlorogenic acid using a popliteal lymph node assay in BALB/c mice［J］.Food Chem Toxicol，2010，48（4）：1059-1065.

［9］Tuschl H，Landsteiner HT，Kovac R.Application of the popliteal lymph node assay in immunotoxicity testing：complementation of the direct popliteal lymph node assay with flow cytometric analyses［J］.Toxicology，2002，172（1）：35-48.

［10］Aida T，Kimura T，Ishikawa N，Shinkai K.Evaluation of allergenic potential of low-molecular compounds by mouse popliteal lymph node assay［J］.J Toxicol Sci，1998，23（5）：425-432.

［11］L?vik M，Alberg T，Nygaard UC，Samuelsen M，Groeng EC，Gaarder PI.Popliteal lymph node（PLN）assay to study adjuvant effects on respiratory allergy［J］.Methods，2007，41（1）：72-79.

［12］Ravel G，Descotes J.Popliteal lymph node assay：facts and perspectives［J］.J Appl Toxicol，2005，25（6）：451-458.

［13］Gutting BW，Schomaker SJ，Kaplan AH，Amacher DE. A comparison of the direct and reporter antigen popliteal lymph node assay for the detection of immunomodulation by low molecular weight com?pounds［J］.Toxicol Sci，1999，51（1）：71-79.

［14］Shinkai K，Nakamura K，Tsutsui N，Kuninishi Y，Iwaki Y，Nishida H，et al.Mouse popliteal lymph node assay for assessment of allergic and autoimmunity-inducing potentials of low-molecular-weight drugs［J］.J Toxicol Sci，1999，24（2）：95-102.

［15］Kalscheuer H，Danzl N，OnoeT，F(xiàn)austT，Winchester R，Goland R，et al.A model for per?sonalizedin vivoanalysis of human immune respon?siveness［J］.Sci Transl Med，2012，4（125）：125ra30.

［16］Zhang B，Duan Z，Zhao Y.Mouse models with human immunity and their application in biomedical research［J］.J Cell Mol Med，2009，13（6）：1043-1058.

［17］Liu K，F(xiàn)ang RG，Li HB，Yang WF，Miao ZC，Wen JH，et al.Efficient derivation of embryonic stem cells from NOD-scid Il2rg（-/-）mice［J］.Pro?tein Cell，2015，6（12）：916-918.

［18］Rajesh D，Zhou Y，Jankowska-Gan E，Roenneburg DA，Dart ML，Torrealba J，et al.Th1 and Th17 immuno?competence in humanized NOD/SCID/IL2r gamma（null）mice［J］.Hum Immunol，2010，71（6）：551-559.

［19］Martinez-Torres F，Nochi T，Wahl A，Garcia JV，Denton PW.Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice-an animal model of primary anti?body deficiency［J］.PLoS One，2014，9（10）：e108663.

［20］Shultz LD，Lyons BL，Burzenski LM，Gott B，Chen X，Chaleff S，et al.Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma（null）mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells［J］.J Immunol，2005，174（10）：6477-6489.

［21］Gleichmann H.Studies on the mechanism of drug sensitization：T-cell-dependent popliteal lymph node reaction to diphenylhydantoin［J］.ClinImmunol Immunopathol，1981，18（2）：203-211.

［22］Liu ZH，Cheng F，Zhou GY.Study on the sensitizing potential of Shuanghuanglian injection using popliteal lymph node assay in C57BL/6J mice［J］.Chin J Integrated Tradit Chin West Med（中國中西醫(yī)結(jié)合雜志），2010，30（1）：64-67.

［23］Wang HH， Liu ZP.Establishmentof popliteal lymph node assay model and application to evalua?tion of Qingkailing Injection sensitivity［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2012，26（2）：183-188.

［24］Choquet-Kastylevsky G， Descotes J. Popliteal lymph node responses to acetone and ethanol differ from those induced by streptozotocin［J］.Arch Toxicol，2004，78（11）：649-654.

［25］Nierkens S，Pieters R.The Reporter Antigen Popliteal Lymph Node Assay［M］∥Current Protocols in Toxicol?ogy.New Jersey.John Wiley&Sons Inc.，2006：557-559.

Positive reaction of direct popliteal lymph node assay isn′t induced in humanized NPG mice with reconstituted immune system

GUO Yan-ru1，ZENG Fan-guang1，YAO Jing-chun2，SUN Rong3，LIU Zhao-hua1
（Center for New Drug Evaluation School，of Pharmaceutical Sciences of Shandong University，Jinan 250012，China；2.Lunan Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Linyi 273400，China；3.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

OBJECTIVE To perform direct popliteal lymph node assay（d-PLNA）induced by D-penicillamine hydrochloride（D-pen）or streptozotocin（STZ）in humanized NPG（hu-NPG）mice with a reconstituted immune system，NPG mice and BALB/c mice respectively，and to compare the responses in these mice to elucidate the mechanism of d-PLNA.METHODS Female NPG mice were ir?radiated and transplanted with human hematopoietic stem cells isolated from cord blood to form hu-NPG mice.The number and function of peripheral blood lymphocytes in hu-NPG mice were detected by flow cytometry and lymphocyte proliferation test.The hu-NPG，NPG and BALB/c mice were randomly divided into D-pen group and STZ group（5 mice per group），respectively.Then，the positive chemical D-pen（1 mg per mouse）or STZ（0.75 mg per mouse）was injected subcutaneously into the right hind footpad of these mice using the established d-PLNA protocol.On the 7thday after injection，the mice were sacrificed.The bilateral popliteal lymph nodes（PLNs）were weighed.The difference of d-PLNA response was evaluated at 7 d after the injection of positive drugs.RESULTS All the NPG，hu-NPG and BALB/c mice behaved normally after the injection of positive drugs.No systemic toxicity was observed.The symptom of local irritation disappeared within 7 d.As in previous studies，the BALB/c mice showed a typical positive response of d-PLNA，as evidenced by the increase in both mass and cell count of the PLNs in the treated lateral（mass index>2 and cellularity index>5），while NPG mice and hu-NPG mice showed a negative resoponse.Pathological examinations demonstrated that the PLNs of NPG mice and hu-NPG mice had developmental defect in lymphoid tissue and were smaller in size than BALB/c mice.Phenotypic analysis of the peripheral blood lymphocytes in hu-NPG mice showed that the majority of human lymphocytes expressed B cell markers CD45+CD19+（75.5±6.6）%，and only about（17.1±6.6）%of the lymphocytes expressed T cell markers CD45+CD3+.There were few lymphocytes in NPG mice.In addition，these cells did not proliferate with mitogen stimulation in the lymphocyte proliferation test.CONCLUSION The d-PLNA reaction induced by D-pen or STZ in mice is closely related to the number and normal function of lymphocytesin vivo.Negative d-PLNA reaction results from a lack of normal lymphocytes in NPG mice or from defected human lymphocyte function in hu-NPG mice.Thus hu-NPG mice are currently not suitable for d-PLNA.

drug hypersensitivity reaction；direct popliteal lymph node assay；humanized mice

LIU Zhao-hua，E-mail：liuzhaohua@sdu.edu.cn，Tel：（0531）88382186

R967

A

1000-3002-（2016）08-0839-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.007

Foundation item：The project supported by Shandong Provincial Natural Science Foundation（ZR2012HM056）；and Shandong Provincial Independent Innovation and Transformation of Achievements Foundation（2014ZZCX02104）

2015-10-23接受日期：2016-07-15）

（本文編輯：齊春會(huì)）

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012HM056）；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（2014ZZCX02104）

郭巖乳，女，碩士研究生，主要從事藥物免疫毒性研究；劉兆華，男，高級工程師，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物免疫毒性和毒性病理學(xué)研究。

劉兆華，E-mail：liuzhaohua@sdu.edu.cn，Tel：（0531）88382186