新型酪氨酸激酶抑制劑B-1對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活和凋亡的影響

楊媛媛，王康敏，張士坤，宋錦文，檀英霞，李素波，高紅偉，季守平，宮 鋒

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850；2.成都知普萊生物醫(yī)藥科技有限公司，四川成都 610000）

·論 著·

新型酪氨酸激酶抑制劑B-1對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活和凋亡的影響

楊媛媛1，王康敏2，張士坤1，宋錦文1，檀英霞1，李素波1，高紅偉1，季守平1，宮 鋒1

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850；2.成都知普萊生物醫(yī)藥科技有限公司，四川成都 610000）

目的 探討GNF-5837修飾改造而合成的神經(jīng)生長因子受體酪氨酸激酶A（TrkA）抑制劑B-1對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞存活和凋亡的影響，為惡性膠質(zhì)瘤治療提供新的思路。方法 B-1和GNF-5837 1.0×10-11～ 1.0×103mol·L-1分別與TrkA激酶作用1 h，ADP-Glo?激酶檢測法測定TrkA活性；MTT法檢測膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）存活率；直接計(jì)數(shù)法檢測膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞集落形成；流式細(xì)胞儀檢測膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡率；Western蛋白印跡法檢測BAD、BCL-2和胱天蛋白酶原3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果B-1和GNF-5837對TrkA活性的抑制作用相近，IC50值分別為4.7±1.0和（4.3±1.7）nmol·L-1；B-1可濃度依賴性抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的存活（r=0.968，P<0.01），14 μmol·L-1時(shí)存活率降到50%；且B-1對HUVEC的IC50約為31 μmol·L-1，高于GNF-5837的IC5013 μmol·L-1；B-1濃度依賴性抑制U251細(xì)胞集落形成能力（r= 0.959，P<0.05）；與細(xì)胞對照組相比，B-1 10 ～40 μmol·L-1作用72 h后U251細(xì)胞的凋亡率升高（P<0.01）；U251細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白BAD水平顯著上升（P<0.01），而抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表達(dá)水平降低（P<0.01）。結(jié)論 B-1能抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞存活，其機(jī)制與B-1通過抑制Trk活性及下游信號通路，降低抗凋亡蛋白水平的同時(shí)增加促凋亡蛋白水平，最終誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。

酪氨酸激酶抑制劑；B-1；細(xì)胞，U251；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目前神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療手段仍是手術(shù)切除加放化療，患者的預(yù)后較差，中位生存期不足12個(gè)月［1］。如何提高膠質(zhì)瘤的療效是目前腫瘤治療的一個(gè)難點(diǎn)。酪氨酸激酶（tyrosine kinases，Trk）家族屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子受體家族，包括TrkA，TrkB和TrkC等［2］。Trk為跨膜蛋白，由3部分組成，即含有配體結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜的疏水α螺旋區(qū)及含有受體Trk活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［3］。神經(jīng)營養(yǎng)因子通過黏附和激活跨膜Trk受體激酶而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用。近年研究表明，神經(jīng)生長因子與其受體結(jié)合后的信號通路不僅可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)功能，而且在多種腫瘤的增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移等中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-6］。Lawn等［7］報(bào)道，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中部分Trk亞型的高表達(dá)與腫瘤的生長和侵襲相關(guān)，有可能成為膠質(zhì)瘤治療的新靶標(biāo)。最近，Iyer等［8］報(bào)道，Trk抑制劑可有效抑制膠質(zhì)瘤的生長。

GNF-5837是一種小分子Trk抑制劑，分子式為C28H21N5O2F4，相對分子質(zhì)量為535.49。GNF-5837通過競爭性結(jié)合受體Trk，抑制其下游蛋白的磷酸化，從而阻斷絲/蘇氨酸激酶等信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，GNF-5837對正常細(xì)胞也有一定的殺傷作用，會產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用。因此，我們對GNF-5837進(jìn)行修飾改造，合成一系列新型Trk抑制劑，經(jīng)過篩選得到了抗腫瘤活性較高且毒副作用小的候選化合物B-1。本研究主要針對B-1對膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的影響進(jìn)行研究，期望能獲得高效低毒的膠質(zhì)瘤治療藥物，從而為臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和儀器

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）均為美國ATCC公司，由本室保存。GNF-5837（圖1A）和合成的抑制劑B-1（圖1B）均由成都知普萊生物醫(yī)藥科技有限公司提供，B-1的化學(xué)名稱為：（Z）-1-（3-（（3-（（N-（2-（二乙基氨基）乙基）2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺-5-）亞甲基）-2-吲哚啉-6-基）胺基）-4-甲基苯基）-3-（4-硝基）苯基）。胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibico公司；MTT，DMSO和β肌動蛋白抗體，美國Sigma公司；TrkA激酶系統(tǒng)和ADP-GloTM激酶檢測試劑盒，美國Promega公司；ATP，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；胱天蛋白酶原3、BCL-2和BAD抗體（一抗），中國Proteintech公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗，碧云天生物技術(shù)研究所；早期凋亡蛋白檢測試劑盒（AnnexinⅤ-FITC），天津三箭生物公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒，德國Thermo公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀和Western電泳儀，均為美國BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋電器公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司。

Fig.1 Chemical structure of GNF-5837（A）and new nerve growth factor receptors tropomyosin kinase（Trks）inhibitor B-1（B）.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制

U251細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用胰酶消化法進(jìn)行傳代。稱取適量藥物以DMSO溶解為100 μmol·L-1，4℃保存?zhèn)溆?。每次?shí)驗(yàn)前用新鮮培養(yǎng)液按一定比例稀釋到終濃度（0，3.5，7.0，10.5，14.0，17.5和35.0 μmol·L-1），所有實(shí)驗(yàn)中DMSO的終濃度均<0.05%，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。

1.3 ADP-GloTM激酶法測定TrkA活性

將B-1和GNF-5837用DMSO稀釋成1 mmol·L-1待用，3倍比稀釋成12個(gè)濃度梯度，分別取2 μL加入到38 μL 1×激酶緩沖液中；同時(shí)制備500 μg·L-1的TrkA緩沖液，250 μg·L-1Poly E4Y1（反應(yīng)底物）和50 μmol·L-1ATP激酶緩沖液。在384孔板中依次加入2 μL TrkA、1 μL不同濃度的抑制劑溶液，室溫放置30 min后，加入2 μL底物溶液，反應(yīng)60 min。隨后加入ADP-GloTM5 μL，室溫靜置40 min；加入10 μL檢測緩沖液，室溫40 min。Perkin Elmer Envision 2104讀取相對光單位（relative light unit，RLU）信號值。RLU信號值即表示抑制率，采用Graphpad Prism5.0計(jì)算IC50。

1.4 MTT法測定細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期U251和HUVEC細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為2×108L-1，接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，棄去原液，加入含有不同濃度B-1和GNF-5837的新培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，另設(shè)細(xì)胞對照組和空白對照組。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，各孔加入MTT（5 g·L-1）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值A(chǔ)490nm。細(xì)胞存活率（%）=（藥物處理組A490nm-空白對照組A490nm）/（正常對照組A490nm-空白對照組A490nm）× 100%。

1.5 細(xì)胞集落形成測定

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，分別用胰酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液稀釋成每毫升100個(gè)，以每孔200個(gè)接種于6孔板中，輕輕晃動混勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天加入B-1使終濃度為0，3，4和5 μmol·L-1，每濃度設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)2周后終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，然后棄去固定液并加入適量結(jié)晶紫染料染色30 min。棄去染料，用PBS洗3 ～5次，空氣干燥。用肉眼直接計(jì)數(shù)，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡

用不同濃度B-1處理U251細(xì)胞72 h后，經(jīng)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，離心去上清，再用預(yù)冷的PBS洗2次，400×g離心5 min，棄上清，按照早期凋亡蛋白AnnexinⅤ-FITC檢測試劑盒說明書依次加入結(jié)合緩沖液和AnnexinⅤ-FITC，避光10 min后上機(jī)測試。采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行檢測，CellQuest Pro軟件進(jìn)行分析。

1.7 Western蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集不同濃度B-1處理72 h后的U251細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，1000×g離心5 min后棄上清，重復(fù)2次。用加PMSF抑制劑的細(xì)胞裂解液RI?PA冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000×g離心10 min，取裂解上清液用BCA蛋白檢測試劑盒，在562 nm波長下測定樣品吸光度，進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量。將蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液以4∶1比例混勻后，沸水浴10 min使蛋白變性。常規(guī)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加抗β肌動蛋白（1∶10 000）、BAD（1∶500）、胱天蛋白酶原3（1∶500）和BCL-2（1∶500）抗體（一抗），4℃孵育過夜。洗膜后，分別加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶4000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后化學(xué)發(fā)光液暗室曝光顯影。采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參β肌動蛋白積分吸光度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B-1對TrkA活性的抑制作用

化合物B-1和GNF-5837對TrkA活性的抑制作用見圖2。B-1與GNF-5837相比，抑制率的擬合曲線幾乎重合，作用1 h后IC50值分別為4.7±1.0和（4.3±1.7）nmol·L-1，二者對TrkA活性的抑制作用相近。

Fig.2 Effect of B-1 and GNF-5837 for 1 h on tyrosine kinase A（TrkA）enzyme activity detected by ADP-GloTMkinase assay.n=2.

2.2 B-1對U251細(xì)胞和HUVEC存活的影響

由圖3A可以看出，與GNF-5837相比，同濃度的B-1能夠顯著抑制U251細(xì)胞的存活（P<0.01），且呈濃度依賴性（r=0.968，P<0.01）。當(dāng)B-1為14 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率降低至50%。由圖3B可以看出，B-1和GNF-5837對HUVEC的毒性作用隨濃度增高而增加，且B-1處理后HUVEC細(xì)胞活性明顯高于GNF-5837處理組（P<0.01），說明B-1對HUVEC的細(xì)胞毒性作用小于GNF-5837。

Fig.3 Effect of B-1 and GNF-5837 on survival of U251 cells（A）and human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）（B）determined by MTT assay.U251 cells and HUVEC were treated with B-1 and GNF-5837 for 72 h，respec?tively.x±s，n=6.**P<0.01，compared with corresponding GNF-5837 group.

2.3 B-1對U251細(xì)胞集落形成的影響

由圖4可以看出，B-1 3，4和5 μmol·L-1組克隆形成個(gè)數(shù)分別為31.0±2.0，15.0±2.0和8.7±1.5，與對照組43.0±3.6相比明顯減少（P<0.01），表明B-1明顯抑制U251細(xì)胞的克隆形成能力，且呈濃度依賴性（r=0.959，P<0.05）。

2.4 B-1對U251細(xì)胞早期凋亡的影響

Fig.4 Effect of B-1 on ability of colony formation of U251 cells.U251 cells were treated with B-1 for 2 weeks.B was the quantitative result of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

Fig.5 Effect of B-1 on U251 cell eraly apoptosis detected by flow cytometry.U251 cells were exposed to B-1 for 72 h.A，B，C，D and E：B-1 0，10，20，30 and 40 μmol·L-1，respectively；F：quantitative result.x±s，n=3.**P<0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

如圖5結(jié)果所示，B-1 10 ～40 μmol·L-1處理膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞72 h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡。與細(xì)胞對照組相比，B-1各組的凋亡率明顯增加（P<0.01），呈濃度依賴性（r=0.994，P<0.01）。

2.5 B-1對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

B-1 10 ～30 μmol·L-1處理膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞72 h，用Western蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白胱天蛋白酶原3、BCL-2和BAD蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常對照組相比，促凋亡蛋白BAD表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；而抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表達(dá)水平均降低（P<0.01）（圖6）。

Fig.6 Effect of B-1 on protein expression levels of pro-caspase3（A），BCL-2（A）and BAD（B）in U251 cells detected by Western blotting.U251 cells were exposed to B-1 for 72 h.C：semi-quantitative result of A and B.x±s，n=3.**P<0.01，compared with corresponding cell control（0 μmol·L-1）group.

3 討論

目前認(rèn)為，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生源于遺傳的積累和控制生物學(xué)行為如調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及增殖等的關(guān)鍵基因的改變［9］。細(xì)胞凋亡的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此在抗腫瘤藥物的研發(fā)中，大多是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來預(yù)測抗腫瘤作用的［10］。研究表明，Trk在包括膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)預(yù)示患者存活率低、預(yù)后差［11-12］。Trk可以調(diào)控包括磷脂酰肌醇-3-激酶-絲/蘇氨酸激酶信號通路在內(nèi)的多種信號通路的活化，從而在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

研究表明，含有Michael-受體的化學(xué)小分子具有較高的生物學(xué)活性，尤其是對含半胱氨酸殘基的蛋白酶有抑制活性［13］。因此，來那替尼、達(dá)克替尼和阿法替尼等Trk抑制劑抗腫瘤藥物的分子結(jié)構(gòu)中都含有親電的基團(tuán)Michael-受體［14］。有鑒于此，我們與成都知普萊生物醫(yī)藥科技有限公司合作，以原肌球蛋白受體激酶抑制劑GNF-5837為研究對象，在其母核上引入了Michael-受體及氨基等結(jié)構(gòu)，合成了一系列化合物。通過初步篩選，獲得了激酶抑制活性較好且毒副作用小的抑制劑B-1。研究結(jié)果表明，新合成的抑制劑B-1和GNF-5837均可顯著抑制TrkA激酶的活性，兩者的抑制能力無顯著差異。在藥物的敏感性研究中，B-1對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的增加而升高，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效率略高于GNF-5837，提示新合成的Trks抑制劑B-1可能對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力。B-1處理膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞后其克隆形成能力也顯著降低。本研究還比較了2個(gè)抑制劑對HUVEC的毒性，發(fā)現(xiàn)新合成的化合物B-1對HUVEC的細(xì)胞毒性低于GNF-5837。以上結(jié)果提示，B-1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效果更好、細(xì)胞毒性更低。

為研究B-1的作用機(jī)制，以FITC標(biāo)記的早期凋亡蛋白（AnnexinⅤ-FITC）為指標(biāo)，用流式細(xì)胞儀檢測B-1處理后膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的早期凋亡率，表明B-1具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的能力。進(jìn)一步檢測B-1處理后膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白BAD表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白BCL-2和胱天蛋白酶原3表達(dá)水平均降低，提示B-1有可能通過抑制Trk活性及其下游信號通路，降低抗凋亡蛋白水平的同時(shí)增加促凋亡蛋白水平，最終誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的目的。

綜上所述，B-1是一個(gè)相對高效低毒的Trk抑制劑，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，有可能成為一個(gè)有應(yīng)用前景的膠質(zhì)瘤靶向藥物。下一步將對其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、殺傷膠質(zhì)瘤的機(jī)制進(jìn)行深入研究，為其臨床治療應(yīng)用打好基礎(chǔ)。

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Effect of new tyrosine kinase inhibitor B-1 on survival and apoptosis of human U251 glioma cells

YANG Yuan-yuan1，WANG Kang-min2，ZHANG Shi-kun1，SONG Jin-wen1，TAN Ying-xia1，LI Su-bo1，GAO Hong-wei1，JI Shou-ping1，GONG Feng1
（1.Institute of Transfusion Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；2.Chengdu Zeple Tech inc.，Chengdu 610000，China）

OBJECTIVE To detect the effect of a new nerve growth factor receptor tropomyosin ki?nase（Trks）inhibitor B-1，a derivative of GNF-5837，on survival and apoptosis of human glioma U251 cells so as to provide a potential molecular target therapy for human glioma.METHODS After being treated with different concentrations of B-1 and GNF-5837（1.0×10-11-1.0×103mol·L-1）for one hour re?spectively，TrkA activity was detected by ADP-Glo?kinase assay.The survival of B-1 and GNF-5837 treat?ed U251 and human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were detected by MTT method.The clone formation unit of treated U251 cells was directly counted.The apoptotic rate of treated U251 cells was determined by FACS with AnnexinⅤ-FITC/PI method.The expression levels of apoptosis-regulated proteins（BAD，BCL-2 and pro-caspase 3）in treated U251 cells were detected by Western blotting. RESULTS B-1 and GNF-5837 had similar inhibitory effects against TrkA，and the IC50values were 4.7±1.0 and（4.3±1.7）nmol·L-1respectively.The survival fraction of U251 cells was inhibited by B-1 in a con?centration-dependent manner（r=0.968，P<0.01）.The inhibition rate reached 50%at 14 μmol·L-1.However，the IC50value ofB-1 in HUVEC cells was 31 μmol·L-1，better than that ofGNF-5837（IC50= 13 μmol·L-1）。The colony formation ability of B-1 treated U251 cells decreased in a concentration-depen?dent manner（r=0.959，P<0.05）.After being treated with B-1 10-40 μmol·L-1for 72 h，the apoptosis rate of U251 cells increased，compared with cell control group.The level of pro-apoptosis protein（BAD）（P<0.01），and anti-apoptosis proteins（BCL-2 and pro-caspase3）in U251 cells decreased（P< 0.01）.CONCLUSION The new TrkA inhibitor B-1 can inhibit U251 glioma cell growth.The mechnism may be related to the ability of B-1 to inhibit the activity of Trk，decrease the anti-apoptosis protein expres?sion，increase the pro-apoptosis protein expression and induce cell apoptosis.

tyrosine kinase inhibitors；B-1；cells，U251；cell proliferation；apoptosis

JI Shou-ping，E-mail：1492466132@qq.com，Tel：（010）66931937

R979.1

A

1000-3002-（2016）08-0833-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.08.006

2016-03-10接受日期：2016-08-02）

（本文編輯：齊春會）

楊媛媛，女，碩士研究生，主要從事膠質(zhì)瘤耐藥性研究，E-mail：yangyuanyuanchina@163.com，Tel：（010）66931545

季守平，E-mail：1492466132@qq.com，Tel：（010）66931937