蝴蝶蘭液泡型ATP酶E亞基基因的克隆及序列分析

袁秀云，田云芳，梁 芳，蔣素華，許申平,王默霏,崔 波*(.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044； .鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450044)

蝴蝶蘭液泡型ATP酶E亞基基因的克隆及序列分析

袁秀云1，田云芳2，梁 芳1，蔣素華1，許申平1,王默霏1,崔 波1*
(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044； 2.鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450044)

E亞基是液泡型ATP 酶(V-ATPase)多亞基復(fù)合體的重要組成部分，響應(yīng)植物的非生物脅迫，對(duì)其基因的克隆及分析有助于闡釋其逆境條件下的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。根據(jù)蝴蝶蘭低溫誘導(dǎo)差異蛋白的序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)從蝴蝶蘭葉片中克隆獲得2條V-ATPase E亞基的cDNA序列，分別命名為PhVHA-Ea和PhVHA-Eb，GenBank登錄號(hào)分別為KT758849和KT758850。PhVHA-Ea和PhVHA-Eb全長(zhǎng)分別為960 bp和1 036 bp，二者均具有687 bp的開放閱讀框，編碼228個(gè)氨基酸，包含相同的vATP-synt_E保守域；生物信息學(xué)分析表明，2個(gè)序列編碼蛋白具有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)和相同的親水性，預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)也相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，蝴蝶蘭PhVHA-Ea和PhVHA-Eb與單子葉植物液泡型ATP 酶E亞基距離最近。

蝴蝶蘭； 液泡型ATP 酶； E亞基； RACE； 序列分析

液泡型氫離子三磷酸腺苷酶(Vacuolar proton-ATPase，V-ATPase)是一類多亞基膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛分布于真核細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上[1-2]。在結(jié)構(gòu)上，V-ATPase由膜外周球頸結(jié)構(gòu)的V1和膜內(nèi)部的V0兩大亞復(fù)合體組成，其中V1部分功能是催化ATP水解，由A、B、C、D、E、F、G、H亞基組成，而V0部分功能是跨內(nèi)膜形成質(zhì)子通道，由a、c、c′、c″、d、e亞基組成[3-5]。V-ATPase利用水解ATP產(chǎn)生的能量將質(zhì)子泵入細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，形成跨膜的質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)，維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，為其他各種離子及代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力，維持機(jī)體正常的代謝平衡[6-7]。研究表明，V-ATPase結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣[8-9]，當(dāng)植物處于高鹽、干旱、低溫或重金屬等脅迫時(shí)，V-ATPase通過調(diào)節(jié)各亞基的表達(dá)和酶活性的變化使植物適應(yīng)環(huán)境[10-12]。

V-ATPase E亞基是V1的重要組成部分[13]，在V1和V0復(fù)合體的組裝步驟中起關(guān)鍵作用[14-15]。同時(shí)V-ATPase E亞基對(duì)機(jī)體內(nèi)新陳代謝、發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫也起重要作用。例如，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的V-ATPase E亞基對(duì)其pH值的內(nèi)平衡及幼蟲發(fā)育至關(guān)重要[16]；擬南芥V-ATPase E亞基有3個(gè)異位表達(dá)的編碼基因(AtVHA-E1、AtVHA-E2和AtVHA-E3)，具有不同的特性和功能[17-18]。對(duì)小麥的研究表明，V-ATPase E亞基基因在擬南芥中超表達(dá)能促進(jìn)鹽脅迫下種子發(fā)芽、根及成苗的發(fā)育[19]。小麥V-ATPase各亞基在高鹽和ABA脅迫下協(xié)同表達(dá)促進(jìn)小麥對(duì)高鹽的抗性[19]。蘭科植物中還未見V-ATPase的研究報(bào)道。

蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis)以花型奇特、花色艷麗、花期長(zhǎng)而著稱，具有很高的觀賞價(jià)值。但蝴蝶蘭原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，適合生長(zhǎng)在溫濕的環(huán)境，在我國(guó)北方地區(qū)只能在現(xiàn)代化溫室內(nèi)種植，種植成本較高，因此研究蝴蝶蘭的抗寒分子調(diào)控機(jī)制不但能夠豐富植物的低溫逆境調(diào)控理論，而且能為蘭花的引種栽培和分子育種提供依據(jù)，最終達(dá)到蘭花栽培節(jié)能、環(huán)保、高效的目的。在對(duì)蝴蝶蘭低溫誘導(dǎo)差異蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)V-ATPase E亞基蛋白的上調(diào)表達(dá)[20]，為深入研究該基因在蝴蝶蘭低溫脅迫中的作用，本研究以蝴蝶蘭葉片為材料克隆了V-ATPase E亞基基因的全長(zhǎng)，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，以期為開展該基因的功能及在低溫脅迫中的分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

蝴蝶蘭栽培品種滿天紅來自鄭州師范學(xué)院生物工程研究所組培室，以生長(zhǎng)在1/2MS基本培養(yǎng)基的生根苗為試驗(yàn)材料。將生長(zhǎng)大小一致的瓶苗放在光照培養(yǎng)箱中，13 ℃/8 ℃的晝夜溫度，12 h/12 h的光照條件，培養(yǎng)9 d 時(shí)取第2葉片組織，取材后迅速用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 葉片組織的總RNA用Trizol試劑(Invitrogen)提取。RNA的完整性用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用Q5000核酸蛋白分析儀(美國(guó)Quawell)測(cè)定其A260、A280值，計(jì)算RNA濃度和純度。

1.2.2 蝴蝶蘭PhVHA-E基因全長(zhǎng)的克隆 采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)以葉片總RNA為模板合成單鏈cDNA。根據(jù)蝴蝶蘭低溫誘導(dǎo)差異蛋白分析中鑒定的蛋白(gi:388495094和gi:115438974)序列及肽段序列DLIVQGLLR、LKEPAVLLR和IVCENTLDAR[20]，設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物V-ATP-F和 V-ATP-R(表1)，用于擴(kuò)增蝴蝶蘭PhVHA-E基因的中間片段，預(yù)期長(zhǎng)度為270 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含10×Buffer 2 μL，4種dNTP各150 μmol/L，每條引物0.5 μmol/L，cDNA模板1 000～2 000 ng，TaqDNA聚合酶1 U。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳康钠危B接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進(jìn)行克隆和測(cè)序。根據(jù)以上步驟所得的2條cDNA基因片段序列，設(shè)計(jì)2對(duì)3′端特異引物ATP-Ea-F1、ATP-Ea-F2，以及ATP-Eb-F1、ATP-Eb-F2；2對(duì)5′端特異引物ATP-Ea-R1、ATP-Ea-R2，以及ATP-Eb-R1、ATP-Eb-R2(表1)，按SMARTTMRACE Amplification kit(Clontech)操作說明進(jìn)行擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，鑒定后進(jìn)行測(cè)序并與中間片段進(jìn)行拼接。然后再根據(jù)拼接的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物ATP-ORFF和ATP-ORFR進(jìn)行開放閱讀框(ORF)的擴(kuò)增并進(jìn)行驗(yàn)證(表1)。引物和測(cè)序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

表1 引物序列

1.2.3 蝴蝶蘭PhVHA-E基因序列的分析 利用NCBI的Open Reading Frame Finder 工具分析PhVHA-E基因的ORF；PhVHA-E基因的核苷酸和氨基酸序列分別通過Blastx和Blastp進(jìn)行同源序列的搜索和比對(duì)；功能域分析用NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù) (conserved domain database,CDD) 進(jìn)行，采用ProtScale程序分析該蛋白質(zhì)親疏水性；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用GOR Protein secondary structure prediction分析；利用phyre2對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用MEGA軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭PhVHA-E基因全長(zhǎng)的克隆

葉片總RNA提取后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，28S和18S條帶清晰，28S濃度約為18S的2倍(圖1)，核酸蛋白分析儀檢測(cè)其OD260/OD280為2.04，質(zhì)量濃度為778.9 ng/μL，能夠滿足基因克隆的要求。

圖1 蝴蝶蘭葉片總RNA提取結(jié)果

以蝴蝶蘭葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以簡(jiǎn)并引物V-ATP-F和V-ATP-R進(jìn)行中間片段的PCR 擴(kuò)增，如期得到1個(gè)270 bp 的保守片段(圖2D)，測(cè)序得到2條編碼序列，2條核苷酸序列的一致性為95.93%，具有11個(gè)堿基的差異，編碼的氨基酸序列一致性為93.26%，具有6個(gè)氨基酸的差異，都包含預(yù)期的LKEPAVLLR和IVCENTLDAR肽段，將2條片段分別命名為ATP-Ea和ATP-Eb。2條序列經(jīng)Blastx分析，其氨基酸為vATP-synt-E多功能域，該功能域包含V-ATPase E亞基和古細(xì)菌V-ATPase E亞基。ATP-Ea與玉米(Zeamays，ACG31413.1)、荷花(Nelumbonucifera，XP_010251551.1)和高粱(Sorghumbicolor，XP_002456080.1)的V-ATPase E亞基有78%、75%和79%的一致性。ATP-Eb與晚香玉(Polianthestuberosa，AIN42254.1)、油棕(Elaeisguineensis，XP_010914312.1)和荷花(Nelumbonucifera，XP_010251551.1)的氨基酸分別具有75%、76%和73%的一致性。說明此2條中間片段為V-ATPase E亞基基因序列。

A:3′端RACE; B:5′端RACE; C:ORF擴(kuò)增; D:中間片段的擴(kuò)增；1:ATP-Ea的3′端片段; 2:ATP-Eb的3′端片段; 3:ATP-Ea的5′端片段; 4:ATP-Eb的5′端片段; 5:PhVHA-Ea的ORF片段; 6:PhVHA-Eb的ORF片段; 7:中間片段; M:Marker

根據(jù)ATP-Ea序列設(shè)計(jì)的3′端巢式特異引物ATP-Ea-F1和ATP-Ea-F2，采用RACE技術(shù)，得到ATP-Ea 3′端316 bp的片段(圖2A-1)，根據(jù)ATP-Eb序列設(shè)計(jì)的3′端巢式特異引物ATP-Eb-F1和ATP-Eb-F2，進(jìn)行RACE試驗(yàn)，得到ATP-Eb 3′端393 bp的片段(圖2A-2)；同樣采用RACE技術(shù)，利用ATP-Ea和ATP-Eb 5′端巢式特異引物ATP-Ea-R1和ATP-Ea-R2、ATP-Eb-R1和ATP-Eb-R2分別得到ATP-Ea和ATP-Eb 5′端536 bp和533 bp的片段(圖2B-3，圖2B-4)。將中間片段ATP-Ea和ATP-Eb分別與其3′端目的片段和5′端目的片段序列拼接，然后在開放閱讀框區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，得到了預(yù)期687 bp的ORF片段(圖2C)，最終得到960 bp和1 036 bp，分別命名為PhVHA-Ea和PhVHA-Eb。通過ORF查找，PhVHA-Ea具有86 bp的5′ UTR和187 bp的3′ UTR，PhVHA-Eb具有89 bp 的5′ UTR和260 bp的3′ UTR，2條序列均有1個(gè)687 bp的ORF，編碼228 個(gè)氨基酸；PhVHA-Ea和PhVHA-Eb的核苷酸序列一致性為89.02%，主要差異在編碼區(qū)兩端。在編碼區(qū)有19個(gè)核苷酸堿基的差異(圖3)，氨基酸一致性為96.49%，有8個(gè)氨基酸的差異(圖4)。通過Blastn分析，PhVHA-Ea的核苷酸序列與油棕(Elaeisguineensis，XM_010916010.1)、海棗(Phoenixdactylifera，XM_008800441.1 )和水稻(Oryzasativa，NM_001050302.1)V-ATPase E亞基分別具有80%、79%和79%的一致性。PhVHA-Eb的核苷酸序列經(jīng)過Blastn分析得到了相似的結(jié)果。將PhVHA-Ea和PhVHA-Eb的序列提交GenBank，登錄號(hào)分別為KT758849和KT758850。

圖3 PhVHA-E基因核苷酸序列的比對(duì)

圖4 PhVHA-E基因氨基酸序列的比對(duì)

2.2PhVHA-E基因的生物信息學(xué)分析

利用 NCBI 的蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù) (conserved domain database,CDD)對(duì)PhVHA-E基因進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)保守區(qū)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，PhVHA-Ea和PhVHA-Eb編碼的蛋白質(zhì)與登錄號(hào)為pfam01991的蛋白質(zhì)匹配，該蛋白質(zhì)在16—225位氨基酸殘基之間有1個(gè)vATP-synt_E功能保守域(圖5)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PhVHA-Ea和PhVHA-Eb編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均約為26.39 ku，等電點(diǎn)約為7。疏水性最大值為1.967，最小值為-3.567，氨基酸殘基大部分在親水區(qū)域。說明此2條基因序列編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白(圖6C)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，PhVHA-Ea編碼的蛋白質(zhì)包括61.4%的α螺旋、13.6%的延伸鏈、7.02%的β轉(zhuǎn)角、17.98%的隨機(jī)卷曲(圖6A)。PhVHA-Eb編碼的蛋白質(zhì)與PhVHA-Ea相似，同樣包括α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲，分別占序列的59.66%、15.35%、4.82%和20.18%(圖6B)。phyre2在線預(yù)測(cè)3級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，PhVHA-Ea和PhVHA-Eb編碼的蛋白具有相同的三級(jí)結(jié)構(gòu)，都與蛋白模型c4dl0J具有95%(217個(gè)氨基酸)的覆蓋度和100%的可信度(圖6D)，該蛋白質(zhì)為V-ATPase E亞基蛋白，為一水解酶，是酵母液泡型ATP酶EGC頭部異源三聚體外周莖軸復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)的一部分[21]。以上分析表明，PhVHA-Ea和PhVHA-Eb為同一功能的V-ATPase E亞基基因。

圖5 PhVHA-E蛋白保守結(jié)構(gòu)域

A:PhVHA-Ea二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); B:PhVHA-Eb二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); C:疏水性分析; D:三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖6 蝴蝶蘭PhVHA-E基因預(yù)測(cè)蛋白的特征

為進(jìn)一步分析蝴蝶蘭PhVHA-E基因與其他植物的V-ATPase E亞基基因的進(jìn)化關(guān)系，將其氨基酸序列提交至NCBI 在線進(jìn)行Blastp搜索，結(jié)果表明，蝴蝶蘭V-ATPase E亞基的氨基酸序列與其他植物該蛋白質(zhì)的氨基酸序列覆蓋率為99%以上，序列一致性為74%～83%，說明該基因的氨基酸序列相對(duì)保守。選擇枇杷(Eriobotryajaponica)V-ATPase E1亞基(AIY85417.1)、葡萄(Vitisvinifera)V-ATPase E1亞基(XP_002270168)、水稻(Oryzasativa)V-ATPase E2亞基(OsVHA-E2，NP_001055857.1)和V-ATPase E亞基(NP_001043767.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)V-ATPase E1亞基(XP_003611036.1)、小麥(Triticumaestivum)V-ATPase E亞基(ABC70183.1)、大麥(Hordeumvulgare)V-ATPase E亞基(YLP，AAD10336.1)、 醉蝶花(Tarenayahassleriana)V-ATPase E1亞基(XP_010529628.1)和E3亞基(XP_010533611.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)V-ATPase E1亞基(AtVHA-E1，NP_192853.1)、E2亞基(AtVHA-E2，NP_187468.1)、E3亞基(AtVHA-E3，NP_176602.1)等基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)，結(jié)果顯示，分析的9個(gè)物種14個(gè)基因被分為2個(gè)大的分支，在第1大分支中，包括擬南芥、醉蝶花、枇杷和蒺藜苜蓿等雙子葉植物亞支和單子葉植物小麥、大麥、水稻和蝴蝶蘭亞支。其中擬南芥的AtVHA-E1與醉蝶花V-ATPase E1亞基、擬南芥的AtVHA-E3與醉蝶花V-ATPase E3亞基、枇杷V-ATPase E1亞基與蒺藜苜蓿V-ATPase E1亞基分別有較近的親緣關(guān)系；本研究中蝴蝶蘭的2個(gè)V-ATPase E亞基關(guān)系最近，與單子葉植物小麥、大麥和水稻的V-ATPase E亞基聚在一起。在另外1個(gè)分支中，擬南芥AtVHA-E2和水稻OsVHA-E2關(guān)系最近，與葡萄V-ATPase E1亞基聚在一起。分析表明，蝴蝶蘭的2個(gè)V-ATPase E亞基在進(jìn)化上具有明顯的種屬特異性，與植物分類系統(tǒng)有較強(qiáng)的相關(guān)性；植物的V-ATPase E2亞基與V-ATPase E1亞基和E3亞基親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖7 蝴蝶蘭PhVHA-E基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 結(jié)論與討論

本研究首次從蘭科植物蝴蝶蘭葉片中克隆了2條V-ATPase E亞基基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，該序列具有vATP-synt_E功能保守域，編碼的蛋白質(zhì)為一親水性蛋白，具有水解酶活性；三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白質(zhì)為酵母V-ATPase外周莖軸EGC復(fù)合體的一部分，研究結(jié)果與其他生物V-ATPase E亞基的特征一致[22-24]。

在擬南芥中，V-ATPase E亞基有3個(gè)亞型，各亞型間具有不同程度的功能特化，其中AtVHA-E1是胚胎發(fā)育表達(dá)的主要亞型，而AtVHA-E2是花粉特異表達(dá)亞型，在配子體發(fā)育中具有專一性但又不是必需的，AtVHA-E3主要在發(fā)育種子的胚乳及周圍組織中表達(dá)[5]。對(duì)突變體研究表明,AtVHA-E3能夠恢復(fù)AtVHA-El缺失的表型，而AtVHA-E2卻不能[17-18]。目前對(duì)其他植物V-ATPase E亞基基因的研究相對(duì)較少，在不同生物中基因名稱和亞型還沒有一致的命名[5]，例如，大麥的V-ATPase E亞基基因命名是TpP31[25]，小麥的是TaVATE(ABC70183.1)[26]。本研究中系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果也顯示了這一現(xiàn)象：例如醉蝶花和擬南芥的AtVHA-E1和AtVHA-E3分別顯示較近的親緣關(guān)系，與這2種植物在植物界的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一致[27-28]，而葡萄V-ATPase E1亞基(XP 002270168)與擬南芥AtVHA-E2(NP 187468.1)和水稻(NP_001055857.1)的OsVHA-E2關(guān)系較近，既沒有體現(xiàn)物種之間的進(jìn)化關(guān)系，也沒有體現(xiàn)出V-ATPase E亞基的同源關(guān)系，說明了V-ATPase E亞基基因命名的混亂。本研究中蝴蝶蘭的2個(gè)V-ATPase E亞基基因核苷酸序列一致性為89.02%，而氨基酸的一致性為96.49%，只有8個(gè)氨基酸的差異，由此推斷這2個(gè)核苷酸序列是蝴蝶蘭V-ATPase E亞基基因的同源基因，來源于不同親本，但是由于沒有顯示與擬南芥的3個(gè)V-ATPase E亞基基因亞型更近的親緣關(guān)系，為了慎重起見，以PhVHA-Ea和PhVHA-Eb命名。

由于V-ATPase通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[29-30]，涉及到多種信號(hào)的調(diào)節(jié)[22]，參與多種脅迫生理調(diào)控[31-33]。V-ATPase E亞基基因在脅迫中的調(diào)控作用也有報(bào)道[20,26]，然而其調(diào)控機(jī)制還是未知。蝴蝶蘭作為熱帶和亞熱帶物種，對(duì)低溫更為敏感。在低溫脅迫下的研究發(fā)現(xiàn)了該基因蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)[20]，而其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。顯然，本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究V-ATPase E亞基基因功能及在低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of Vacuolar Proton-ATPase E Subunit Gene fromPhalaenopsisamabilis

YUAN Xiuyun1,TIAN Yunfang2,LIANG Fang1,JIANG Suhua1,XU Shenping1,WANG Mofei1,CUI Bo1*
(1.Institute of Bioengineering,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China; 2.College of Life Science,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China)

E subunit is an important part of the multisubunit complex of V-ATPase,which responds to abiotic stress in plant.Cloning and analysis of the gene encoding V-ATPase E subunit is helpful to elucidate its molecular regulation mechanism under stress.In this paper,two cDNA sequences of V-ATPase E subunit genes fromPhalaenopsisamabilisleaf were isolated by the methods of RT-PCR combined with RACE techniques using degenerate primers designed according to the sequence of the differentially expressed protein.They were named asPhVHA-EaandPhVHA-Eb,the GenBank accession numbers were KT758849 and KT758850 respectively.The two sequences length were 960 bp and 1 036 bp with the intact open reading frame of 687 bp,encoding a polypeptide of 228 amino acids with the same domain of vATP-synt_E.Bioinformatics analysis indicated that the two sequences had similar secondary structure,the same feature of hydrophilic protein and the same three-dimensional structure.The phylogenetic analysis revealedPhVHA-EaandPhVHA-Ebwere closed to the V-ATPase E subunits gene from monocots.

Phalaenopsisamabilis; V-ATPase; E subunit; RACE； sequence analysis

2016-01-20

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110128)

袁秀云(1970-)，女，河南許昌人，教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail:yuanxiuyun@163.com

*通訊作者：崔 波(1962-)，男，河南泌陽(yáng)人，教授，博士，主要從事花卉育種研究。 E-mail:laocuibo@163.com

S682.31

A

1004-3268(2016)06-0104-07