馬立克氏病病毒編碼的miR-M12-5p對(duì)雞HVCN1基因表達(dá)的靶向調(diào)控

李會(huì)珍，滕 蔓，黨 露，馮麗麗，馬圣明，趙 樸，羅 俊,，張改平(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 5000； .河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州5000； .河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州5000； .河南科技大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 7100)

馬立克氏病病毒編碼的miR-M12-5p對(duì)雞HVCN1基因表達(dá)的靶向調(diào)控

李會(huì)珍1,2，滕 蔓2，黨 露2，馮麗麗3，馬圣明4，趙 樸2，羅 俊2,4，張改平1,2*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州450002； 4.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

為研究miR-M12-5p在馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染過程中的調(diào)控作用，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其候選靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miR-M12-5p的結(jié)合靶點(diǎn)。體外雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-M12-5p可結(jié)合宿主雞的氫離子電壓門控通道1(HVCN1) 基因mRNA的3′-UTR相應(yīng)位點(diǎn)并發(fā)生特異性相互作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析進(jìn)一步證實(shí)，miR-M12-5p能夠在體內(nèi)下調(diào)HVCN1基因的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明，miR-M12-5p可以靶向調(diào)控宿主基因HVCN1的表達(dá)。

馬立克氏病病毒； miRNA； miR-M12-5p； 靶基因；HVCN1基因

馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)是雙鏈DNA病毒，有囊膜，基因組大小約180 kb，在感染自然宿主雞后可引發(fā)雞馬立克氏病(Marek’s disease，MD)，臨床上以實(shí)質(zhì)器官惡性腫瘤為特征[1]。MD是第1個(gè)可用病毒疫苗免疫預(yù)防的腫瘤性疾病[2]，因此，MDV感染對(duì)于研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了極好的動(dòng)物模型[3]。MDV共有3個(gè)血清型：血清Ⅰ型(MDV-1)、血清Ⅱ型(MDV-2)、血清Ⅲ型(即火雞皰疹病毒，herpesvirus of turkeys，HVT)[1]。疫苗免疫接種對(duì)該病的有效防控貢獻(xiàn)巨大，但在過去幾十年中，MDV-1流行毒株的毒力因免疫壓力選擇而逐漸增強(qiáng)。因此，深入研究MDV的致病致瘤機(jī)制對(duì)MD的防控具有非常重要的意義。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為22～25 nt的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，存在于包括動(dòng)物、植物、病毒在內(nèi)的多種生物體中[4-6]。miRNA通過與mRNA相應(yīng)的靶點(diǎn)結(jié)合抑制蛋白質(zhì)翻譯，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控作用[7-8]。此前研究表明，MDV編碼的miRNA在病毒復(fù)制[9]、維持潛伏感染[10]、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]、激活原癌基因表達(dá)[12]等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。MDV-1基因組共編碼26個(gè)病毒miRNA，這些miRNA在MDV致病及致瘤過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。此前，筆者所在課題組通過基因缺失Meq基因簇中各個(gè)miRNA單基因研究其與MDV致病表型的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-M12-5p的前體基因缺失毒株與其親本毒株GX0101相比，致腫瘤率顯著降低，表明miR-M12-5p在調(diào)控MDV致瘤作用中可能發(fā)揮重要作用[13]?；诖?，利用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-M12-5p的宿主靶基因進(jìn)行了預(yù)測和分析，并利用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)(DLRA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-pCR)對(duì)miR-M12-5p的候選靶基因進(jìn)行了體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證，旨在為進(jìn)一步揭示miR-M12-5p調(diào)控MDV致病致瘤的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞

MDV超強(qiáng)毒株GX0101，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈(zèng)；GX△miR-M12毒株(miR-M12-5p前體基因缺失的MDV毒株)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；HEK 293T細(xì)胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryoi broblast，CEF)取自7～9日齡SPF雞胚。

1.2 試劑和載體

PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、DNA限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ和EcoRⅠ、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、2×SYBR Premix ExTaq、DNA Ligation Kit Ver.2.1和pMD19-T(Simple) vector，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine 2000和TRIzol Reagent，購自Invitrogen公司；DLRA系統(tǒng)購自Promega公司；Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)，購自碧云天生物技術(shù)公司；psiCHECK-2、pcDNA-6.2和pcDNA-miR-neg載體，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA6.2-miR-M12菌種及質(zhì)粒，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本研究所使用的DNA引物均使用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名稱、序列及用途等相關(guān)信息見表1。

表1 供試引物的背景信息

引物對(duì)編號(hào)引物名稱用途序列(5′—3′)產(chǎn)物大小/bp1HVCN1-3′-UTR-F3′-UTR的PCR擴(kuò)增CCTCGAGTGCTGGGCTACCGAGTCATC549HVCN1-3′-UTR-RTTGCGGCCGCGCAGGCAGAAAGGGAAGGAG2HVCN1-mut-3′-UTR-F3′-UTR突變體載體構(gòu)建TCGAGCAGGCTTCTCCAATTGATTTCAGCT?58GCAGCCAGCTCCTCCCAGCACTGAGCGCHVCN1-mut-3′-UTR-RGGCCGCGCTCAGTGCTGGGAGGAGCTGGC?TGCAGCTGAAATCAATTGGAGAAGCCTGC3mut-miR-M12-5p-F3′-UTR突變體載體構(gòu)建AATTCATTAAAGAAGTATAATGTAAATGTCC?59AAAGGTTTGCATAATACGGAGGGTTCTCmut-miR-M12-5p-RTCGAGAGAACCCTCCGTATTATGCAAACCT?TTGGACATTTACATTATACTTCTTTAATG4HVCN1-qPCR-FqRT-PCRTGAGGAGGAGGACAATGGAGAGA111HVCN1-qPCR-RTGAAACCTGCGTGAACTGAAGAG5GAPDH-qPCR-FqRT-PCRAAGTCCCTGAAAATTGTCAGCAAT119GAPDH-qPCR-RATGGCATGGACAGTGGTCATAAG

1.4 miR-M12-5p候選靶基因生物信息學(xué)預(yù)測

分析挑選出30個(gè)在MDV感染過程中表達(dá)下調(diào)的宿主基因，利用miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測軟件RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)在線預(yù)測miR-M12-5p的候選靶基因。根據(jù)miRNA∶mRNA雜合配對(duì)的特異性及預(yù)測軟件的特點(diǎn)，設(shè)定篩選條件為允許G∶U配對(duì)，miRNA 2—8位種子區(qū)域匹配，匹配區(qū)域位于mRNA的3′-UTR序列中。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

以CEF基因組cDNA為模板，擴(kuò)增雞HVCN1基因3′-UTR目的片段。PCR反應(yīng)體系包括：ExTaq10 μL、引物對(duì)1的上下游引物(表1)各1 μL(10 μmol/L)、CEF cDNA 1 μL(100 ng/μL)和ddH2O 7 μL。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。割膠回收目的片段，將其和psiCHECK-2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。同上電泳分析，割膠回收目的片段。將純化后的目的片段與載體連接，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂瓊脂平板培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落經(jīng)PCR及雙酶切鑒定陽性后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將引物對(duì)2和3(表1)合成的寡核苷酸分別用ddH2O溶解至終濃度為50 μmol/L，進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：Nuclease-Free Water 40 μL，Annealing Buffer for DNA Oligos (5×) 20 μL，正、反寡核苷酸鏈各20 μL(50 μmol/L)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性2 min，然后每90 s下降1 ℃直至25 ℃。將退火形成的雙鏈DNA同上構(gòu)建人工突變型報(bào)告基因載體。

1.6 DLRA

psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR 和pcDNA6.2-miR-M12-5p質(zhì)粒各取300 ng，均勻混于12.5 μL無血清培養(yǎng)基中，按照48孔細(xì)胞板每孔1 μg Lipofectamine 2000和12.5 μL質(zhì)粒的比例均勻混合，按Lipofectamine 2000說明書，將孵育后的Lipofectamine 2000和混合質(zhì)粒(25 μL/孔)共轉(zhuǎn)染融合度為80%～90%的HEK 293T細(xì)胞。以pcDNA6.2-miR-neg為陰性對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染48 h后，將HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用PBS洗2次，然后用DLRA系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)告基因檢測。首先用20 μL ddH2O稀釋細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞，室溫孵育15 min。然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至96孔白色底透酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL LAR Ⅱ，輕柔混合均勻后用Ω酶標(biāo)儀(BMG Labtech)測定螢火蟲熒光素酶數(shù)值。最后向每孔中加入100 μL Stop & Glo Reagent，輕柔混合均勻后，同上測定海腎熒光素酶數(shù)值。最后統(tǒng)計(jì)分析海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性比值。

1.7 qRT-PCR

用MDV親本毒株GX0101和miR-M12-5p前體基因缺失株GX△miR-M12分別感染CEF細(xì)胞，分別于感染后96 h和120 h收集細(xì)胞樣品，同時(shí)以CEF細(xì)胞為陰性對(duì)照，按照TRIzol操作說明書提取總RNA。取上述RNA樣品各1 μg，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作說明書去除基因組DNA，反應(yīng)體系包括：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、RNA 1 μg、RNase-free H2O補(bǔ)足至10 μL，42 ℃反應(yīng)2 min。向上述10 μL反應(yīng)體系中加入：5×Primer Script Buffer 4 μL、Primer Script RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL、RT Primer Mix 1 μL和RNase-free H2O 4 μL，于37 ℃反應(yīng)15 min，然后85 ℃反應(yīng)5 s進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)，合成的cDNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以CEF陰性細(xì)胞為對(duì)照，以雞GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR分析，每個(gè)反應(yīng)體系均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。20 μL qPCR反應(yīng)體系包括：cDNA模板(1.4 μg/μL)2 μL、引物對(duì)4或5的上下游引物(表1)各 0.8 μL(10 μmol/L)、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、2×SYBR Premix ExTaq10 μL和ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s。溶解曲線生成條件為熒光定量PCR儀(7500 Fast，ABI)默認(rèn)參數(shù)。所有qRT-PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-M12-5p候選靶基因的預(yù)測結(jié)果

利用RNAhybrid在線預(yù)測軟件對(duì)miR-M12-5p的候選靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，從MDV感染過程中下調(diào)表達(dá)的30個(gè)基因中，預(yù)測出4個(gè)位于mRNA 3′-UTR的匹配靶點(diǎn)(表2)，包括HVCN1、P2RX5、CD79B、SLC22A16基因。HVCN1基因?yàn)槎鄠€(gè)MDV-1編碼的miRNA的共同候選靶基因，故優(yōu)先選取HVCN1進(jìn)行下一步試驗(yàn)分析。

表2 生物信息學(xué)預(yù)測 miR-M12-5p 的候選靶基因背景信息

2.2 雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

從CEF基因組cDNA中擴(kuò)增出大小為549 bp的HVCN1 3′-UTR片段(圖1)，然后將該片段定向插入到psiCHECK-2載體中，經(jīng)過PCR及雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定(圖1)，最后進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增序列與預(yù)期完全相符，成功獲得重組載體質(zhì)粒psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR。將人工合成的突變型miR-M12-5p前體序列或HVCN1基因的3′-UTR分別定向插入pcDNA-6.2和psiCHECK-2載體中，分別獲得重組質(zhì)粒pcDNA6.2-mut-miR-M12-5p和psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR，經(jīng)過質(zhì)粒測序分析，與預(yù)期完全一致(未顯示)。

M.DNA Marker； 1.HVCN1基因3′-UTR PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2.psiCHECK-2空載體雙酶切； 3.psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR重組質(zhì)粒雙酶切圖1 HVCN1 3′-UTR的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 DLRA分析結(jié)果

將雙熒光素酶報(bào)告基因載體psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR分別和pcDNA6.2-miRKG-M12-5p或陰性對(duì)照組質(zhì)粒pcDNA6.2-miR-neg共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，48 h后用DLRA系統(tǒng)檢測熒光值并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性(即海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組pcDNA6.2-miR-neg質(zhì)粒相比，pcDNA6.2-miR-M12-5p質(zhì)粒與psiCHECK2-HVCN1-3′-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞時(shí)，海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性比值極顯著降低 (圖2)。將HVCN1 3′-UTR或miR-M12-5p靶點(diǎn)序列進(jìn)行人工突變，構(gòu)建2個(gè)突變重組載體質(zhì)粒psiCHECK2-mut-HVCN1-3′-UTR和pcDNA6.2-mut-miR-M12-5p，分別交叉對(duì)應(yīng)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞時(shí)，海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性比值明顯提高(圖2)。上述結(jié)果表明，miR-M12-5p可與HVCN1 3′-UTR發(fā)生特異性相互作用，即miR-M12-5p可以體外靶向結(jié)合HVCN1的mRNA 3′-UTR，并顯著抑制報(bào)告基因活性。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同圖2 DLRA分析miR-M12-5p與HVCN1 3′ -UTR的相互作用結(jié)果

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證HVCN1表達(dá)的分析結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-M12-5p與候選靶基因HVCN1的體內(nèi)相互作用關(guān)系，用qRT-PCR分析HVCN1的表達(dá)水平。如圖3所示，與CEF陰性對(duì)照相比，在GX0101感染的細(xì)胞中HVCN1 mRNA的表達(dá)水平極顯著下調(diào)，而在GX△miR-M12感染的CEF細(xì)胞中HVCN1 mRNA的表達(dá)量與GX0101感染組相比極顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明，在MDV感染的CEF細(xì)胞中，HVCN1的表達(dá)水平與miR-M12-5p的表達(dá)水平呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)miR-M12-5p在體內(nèi)抑制HVCN1的表達(dá)。

圖3 MDV感染CEF細(xì)胞中HVCN1的表達(dá)變化

3 討論

MDV對(duì)雞不僅具有致病性，而且MDV-1強(qiáng)毒株的感染最終還誘發(fā)其自然宿主發(fā)生多組織臟器的T淋巴腫瘤，是少數(shù)幾個(gè)可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的代表性皰疹病毒之一。因此，深入研究MDV-1編碼的病毒基因的結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于揭示其他致瘤性皰疹病毒的感染及致病機(jī)制也具有重要的科學(xué)意義。MDV-1病毒共編碼14個(gè)miRNA前體基因，表達(dá)26個(gè)成熟的miRNA分子，并且在基因組中形成3個(gè)miRNA基因簇[14-15]。其中miRNA前體基因miR-M2、miR-M3、miR-M4、miR-M5、miR-M9和miR-M12組成第1個(gè)基因簇，即Meq基因簇；miR-M6、miR-M7、miR-M8、miR-M10和miR-M13組成第2個(gè)基因簇被稱為LAT基因簇；另外3個(gè)前體基因miR-M1、miR-M11和miR-M31組成第3個(gè)miRNA基因簇，位于上述2個(gè)基因簇之間，因此之前又被稱為Mid基因簇[15]。這些病毒miRNA在MD的發(fā)生、發(fā)展過程中，如在病毒復(fù)制[9]、維持潛伏感染[10]、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]、激活原癌基因表達(dá)[12]等方面都可能發(fā)揮極其重要的作用，其中位于Meq基因簇中的miR-M4-5p，此前已被鑒定為宿主的原癌基因miR-155類似物，筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，miR-M4-5p可在感染宿主體內(nèi)靶向調(diào)控宿主基因LTBP1的表達(dá),影響TGF-β1的成熟及向胞外分泌的過程,進(jìn)而抑制TGF-β信號(hào)通路來激活原癌蛋白c-Myc的表達(dá)，最終促進(jìn)誘導(dǎo)MD的腫瘤發(fā)生[12]。動(dòng)物攻毒試驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示，缺失miR-M4前體基因的MDV突變毒株與其親本毒株相比致瘤率顯著下降[9]。miR-M3-5p是位于Meq基因簇中的另外一個(gè)病毒miRNA，此前有國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-M3-5p可通過靶向下調(diào)宿主基因SMAD2的表達(dá)，從而抑制TGF-β信號(hào)通路、促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡，為MDV的病毒復(fù)制提供空間[11]。

除了miR-M4-5p和miR-M3-5p之外，Meq基因簇中編碼的其他多個(gè)miRNA在MDV-1的致病及致瘤過程中也可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-M12-5p也位于Meq基因簇中，筆者所在課題組通過逐一基因缺失該基因簇中各病毒miRNA的前體單一基因研究其對(duì)MDV致病表型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-M12-5p的前體基因缺失也可使MDV的致瘤率顯著下降[13]。為了進(jìn)一步研究miR-M12-5p在MDV致病過程中的調(diào)控作用，本研究首先利用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-M12-5p的宿主候選靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，然后通過DLRA對(duì)miRNA與候選靶基因3′-UTR的體外相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過qRT-PCR對(duì)MDV感染細(xì)胞中候選基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，最終證實(shí)miR-M12-5p可靶向調(diào)控宿主基因HVCN1的表達(dá)。HVCN1的作用主要在于調(diào)節(jié)電壓依賴型質(zhì)子，興奮細(xì)胞膜的滲透性，可能與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，電壓門控性通道基因在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并通過影響細(xì)胞膜電壓、改變細(xì)胞體積等方式影響腫瘤細(xì)胞的周期和增殖[16-17]。此外，HVCN1還參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，可調(diào)控多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[18]，ROS在腫瘤細(xì)胞的遷移和入侵過程中發(fā)揮重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-M12-5p可靶向調(diào)控雞HVCN1基因的表達(dá)，預(yù)示氫電壓門控通道可能在MD腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

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Targeted Regulation of Host GeneHVCN1 by Viral microRNA miR-M12-5p Encoded by Marek’s Disease Virus

LI Huizhen1,2,TENG Man2,DANG Lu2,FENG Lili3, MA Shengming4,ZHAO Pu2,LUO Jun2,ZHANG Gaiping1,2*
(1.College of Animal Scienceand Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculturel/Henan Provincial Key Laboratory of Aminal Immunology,Zhengzhou 450002,China; 3.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 45000 2,China; 4.College of AnimalScience and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

In order to study the regulatory role of miR-M12-5p,we predicted the host target genes utilizing bioinformatics method and obtained four candidate mRNA targets for miR-M12-5p.Dual luciferase reporter assay(DLRA) showed that miR-M12-5p couldinvitrointeract with the 3′-UTR of the mRNA of hydrogen voltage gated channel 1(HVCN1) gene.Further analysis results of the quantitative real-time PCR(qRT-PCR) showed that the expression level ofHVCN1 gene wasinvivodown-regulated by miR-M12-5p.These data suggested that miR-M12-5p could regulate the expression of host chicken geneHVCN1.

MDV; miRNA; miR-M12-5p; target gene;HVCN1 gene

2016-01-30

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31372445)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金項(xiàng)目(2013YQ28)

李會(huì)珍(1990-)，女，河南鄭州人，在讀碩士研究生，研究方向：動(dòng)物疫病分子致病機(jī)制。 E-mail:lihuizhen01@163.com

*通訊作者：張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及重大疫病快速檢測技術(shù)研究。 E-mail：zhanggaiping2003@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)06-0121-06