蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目和鯉形目魚類中的通用性研究

楊忠禮，連總強，吳旭東,3，俞兆曦，王 燕，肖 偉，賽清云(.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070； .寧夏回族自治區(qū)水產研究所，寧夏 銀川75000； 3.寧夏漁業(yè)工程技術研究中心，寧夏 銀川75000)

蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目和鯉形目魚類中的通用性研究

楊忠禮1,2，連總強2,3，吳旭東1,2,3*，俞兆曦1，王 燕2，肖 偉2,3，賽清云2,3
(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070； 2.寧夏回族自治區(qū)水產研究所，寧夏 銀川750001； 3.寧夏漁業(yè)工程技術研究中心，寧夏 銀川750001)

為研究蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目和鯉形目魚類中的通用性，以12種不同魚類為試驗材料，分別采用改進的酚-氯仿法結合DNA產物純化試劑盒法、傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法提取其尾鰭基因組DNA，對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計檢測。結果表明，改進的酚-氯仿法結合DNA產物純化試劑盒法提取的魚類基因組DNA 在純度和穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法，且電泳條帶清晰、整齊、明亮，操作簡單，耗時短，便于快速、批量提取。利用蘭州鲇14對G-SSR引物和21對EST-SSR引物在12種魚類中進行跨目通用性分析，結果顯示，蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目、鯉形目魚類的通用率分別為63.10%、32.14%和61.11%、44.44%，表明隨著物種間親緣關系變遠，其通用性隨之降低。

基因組DNA； 蘭州鲇； 鲇形目； 鯉形目； G-SSR； EST-SSR； 通用性

隨著分子生物學的快速發(fā)展，基于PCR技術從核酸水平對魚類的起源進化、種質資源鑒定、遺傳多樣性評估等研究，是目前魚類分子生物學研究的有效手段。獲得高質量的DNA是這些分子生物學研究的基礎。目前，關于魚類基因組DNA提取已有較多報道[1-5],主要有3種常見方法：傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法[6-7]、高鹽沉淀法[8-9]、離心柱型試劑盒法[10]。傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法消化時間長，操作步驟繁瑣且穩(wěn)定性差；高鹽沉淀法操作簡便快捷，但所提取的DNA純度及穩(wěn)定性較差[11]；離心柱型試劑盒提取效果較好，可以最大限度地除去蛋白質、脂肪、及其他有機化合物對DNA的污染，但由于試劑的限制(保存、運輸、安全等因素)，DNA提取量較少，且價格較貴[12]。一些對DNA質量要求高的試驗，如構建基因組文庫、簡化基因組測序、Southern雜交等，傳統(tǒng)酚-氯仿法和高鹽法提取的DNA往往達不到其質量要求?；谝陨?種方法的缺點和科研的需求，急需開發(fā)一種快捷、廉價且穩(wěn)定性高的DNA提取方法。

微衛(wèi)星(microsatellites)又稱簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)，是由1～6個堿基串聯重復排列的DNA序列。根據其來源分為基因組SSR(genomic SSR,G-SSR)和表達序列標簽SSR(expressed sequence tag,EST-SSR)。微衛(wèi)星標記因其具有共顯性遺傳、重復性好、多態(tài)性高等優(yōu)點，而廣泛應用于魚類遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定和遺傳連鎖圖譜構建等方面的研究[13-14]。研究表明，微衛(wèi)星的側翼序列在近緣物種之間較為保守，具有通用性，根據這一特性，已有不少科研工作者利用近緣物種的微衛(wèi)星開發(fā)出目標物種的微衛(wèi)星標記[14-16]。此外，有報道稱某些微衛(wèi)星位點在親緣關系較遠的物種間也具有一定通用性[17]。關于同一物種的G-SSR和EST-SSR在其他物種中的通用性報道較少，缺乏系統(tǒng)性比較研究。為此，本研究以12種不同魚類的尾鰭為試驗材料，用改進的酚-氯仿法抽提其基因組DNA，對蘭州鲇(Siluruslanzhouensis)的G-SSR和EST-SSR在親緣關系較近的鲇形目(Siluriformes)魚類和親緣關系較遠的鯉形目(Cypriniformes)魚類中進行通用性研究,旨在研發(fā)一種操作簡單、提取效果好、穩(wěn)定性高、便于批量提取的DNA提取方法，同時為蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在其他物種間的通用性研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用12種魚分屬2個目，5個科，10個屬(表1)。將活魚帶回實驗室處死，剪取部分尾鰭組織浸泡在無水乙醇中，于-20 ℃保存。

主要試劑：組織裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、 pH值8.0的0.1mol/L EDTA、pH值8.0的1% SDS)、20 mg/mL蛋白酶K、普通DNA產物純化試劑盒及海洋動物基因組DNA提取試劑盒等均購自天根生化試劑公司；3 mol/L NaAc、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇等均為國產分析純。

1.2 基因組DNA提取

分別采用改進的酚-氯仿法結合DNA產物純化試劑盒法、傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒法提取其尾鰭基因組DNA。

消化：將保存在無水乙醇中的蘭州鲇尾鰭組織取出，剪取30 mg左右，用干凈的濾紙將乙醇吸干后放置于1.5 mL離心管中，將組織剪碎后加入350 μL組織裂解液和8 μL蛋白酶K，充分混勻后放置在56 ℃水浴鍋中消化3～4 h，期間每隔30 min將樣品顛倒混勻1次，直至組織完全溶解并澄清。

苯酚-氯仿抽提：消化完成后加入1/5體積(約70 μL)的3 mol/L NaAc、等體積(約500 μL)的Tris-苯酚︰氯仿︰異戊醇混合液(25∶24∶1)，上下顛倒充分混勻2～5 min,使核蛋白徹底變性裂解，DNA充分溶解。充分混勻后于室溫下12 000 r/min離心10 min，吸取上清液200～250 μL至另一新的離心管中。

采用DNA純化試劑盒進一步純化：按照普通DNA產物純化試劑盒說明對上述酚-氯仿法初步抽提的DNA進一步純化，得到高純度的DNA。由于DNA提取量較大，在洗脫步驟時，可以適當加大洗脫液用量，提高DNA得率。

用上述方法提取20尾蘭州鲇基因組DNA并驗證其穩(wěn)定性，用同樣的方法提取大口鲇、小口鲇、革胡子鲇、斑點叉尾鮰、黃顙、鯉魚、草魚、鯽魚、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈基因組DNA。此外，對4尾蘭州鲇分別采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法[2]和海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA。

表1 試驗用12種魚類的分類及采樣地

種名屬名科名目名樣品數量/尾采樣地蘭州鲇(S．lanzhouensis)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)20寧夏水產研究所科研基地大口鲇(S．meridionalis)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當地水產市場小口鲇(S．asotus)鲇屬(SilurusLinnaeus)鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當地水產市場革胡子鲇(C．fuscus)胡子鲇屬(ClariasScopoli)胡子鲇科(Siluridae)鲇形目(Siluriformes)1當地水產市場斑點叉尾鮰(I．Punetaus)鮰屬(Ictalurus)鮰科(Ictaluridae)鲇形目(Siluriformes)1寧夏水產研究所科研基地黃顙(P．fulvidraco)黃顙魚屬(Pelteobagrus)鲿科(Bagridae)鲇形目(Siluriformes)1當地水產市場鯉魚(C．carpio)鯉屬(Cyprinus)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產研究所科研基地草魚(C．idellus)草魚屬(Ctenopharyngodon)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產研究所科研基地鯽魚C．auratus)鯽屬(Carassius)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產研究所科研基地白鰱(H．molitrix)鰱屬(Hypophthalmichthys)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產研究所科研基地花鰱(A．nobilis)鳙屬(Aristichthys)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1寧夏水產研究所科研基地大鼻吻鮈(R．nasutus)吻鮈屬(Rhinogobio)鯉科(Cyprinidae)鯉形目(Cypriniformes)1內蒙古澄口

1.3 DNA提取結果檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測3種方法所提取的魚類基因組DNA，電壓120 V，室溫下電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測電泳結果，并拍照保存。DNA樣品用紫外分光光度計檢測其含量并計算A260/A280比值。檢測完后根據需要將DNA稀釋，并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過電泳圖譜、DNA含量及其A260/A280比值判斷不同提取方法的效果。

1.4 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR通用性檢測

將采用改進方法提取的12種不同魚類DNA稀釋至50 ng/μL作為底物。14對蘭州鲇G-SSR引物來自魏大為等[18]公布的序列，21對EST-SSR引物由筆者所在實驗室積累，引物序列見表2。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，模板DNA(50 ng/μL)2 μL，去離子水6 μL。PCR程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性 30 s，退火30 s，退火溫度依引物而定，72 ℃延伸 1 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。統(tǒng)計每對引物在其他12種魚類中的擴增情況，根據統(tǒng)計結果計算每對引物的有效擴增率，以及G-SSR型和EST-SSR型微衛(wèi)星的平均有效擴增率。

表2 21對蘭州鲇EST-SSR分子標記引物序列

位點引物序列(5′—3′)退火溫度/℃JZ845705 F：TGTGCGAAAGGTGAAAGATTA R：AACTTGAATGGGAAGGAGGTG58JZ845090 F：CATAAAGTCTCCGTCAACC R：GTCATGGGAAATCAACAAT53JZ845784 F：ATCAATAAGCGTGGTGTCA R：GCTGTTTGCCTAACCTGA57JZ845762 F：TGTGAGTGATTGGTATGTGGT R：TTAATGCTGGGTCATGTAGAG59JZ845190 F：ACCTCCACTGAATCACAACA R：AAGACAGAAAAGAAAGAAACG56JZ845743 F：AGTGACTGCTAGTCCCAGAG R：GAGACGCAACATACAGAACC61JZ845100 F：ATCCCTGTATTTACCAGTCTCAC R：GCTTCACTTGGGTTCCTTTGT58JZ845703 F：CCAAATAGCGTGTAGTAGT R：CACTAAACTGTGAAGAAAGA55JZ845726 F：TATGAATGACCGTGGCAGAG R：CCAAGCGTAAGTTGAGGAA56JZ845789 F：ACGCAGACCAGACACCACC R：GCCAGCGGAGAAAGCAGT63JZ905272 F：GTAAGAGCGTCAGGGACTG R：GAATGTTGGTATGCTGGAAT62JZ905276 F：TCAAGCGTTCTGTGGGGTAT R：AAGTCGCATCCGTTCGTG59JZ905300 F：AGTATGTGAGTGCGAGA R：TAACGTAATGCAGGTAA53JZ905308 F：GGAAGTGATGTCGGTGTC R：CTGCTCGATGTAAAGAATGT59JZ905309 F：CCTGCTCCTTCCATCCTTT R：CGTTTACGCTCCGACTCTTAT59JZ905311 F：CCAGAATCCACCTTTGCCTAT R：GTCCTCCTGCTCCTTCCATC63JZ905314 F：TGACAGTGGAGGAGTATTGAGG R：ACAGGAAACCGAAGTGGAGT59JZ905328 F：TACATATTATGGCACTCGC R：AGATTGGTGAAACAGGCTA56JZ905334 F：CGCTCATTCCACATCCTT R：ACCACATCACCCAGTCCA61JZ905338 F：CAGGAAATGATGTGGGAGAA R：GAGACGAAGATGGGAAAGAGTA58JZ905348 F：TGTAAAGGCTGCGGTTCTC R：CCAATTTGTTGATGCTTAATGTA55

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量檢測

由圖1—3可見，酚-氯仿法和試劑盒法提取的DNA主條帶模糊，有拖尾現象，表明DNA含量較低，降解嚴重。與傳統(tǒng)的酚-氯仿法和試劑盒法相比，改進方法提取的基因組DNA質量較好，DNA主條帶清晰、明亮、整齊、無拖尾，DNA含量高，純度好，蛋白質、RNA和雜質污染少，且DNA降解程度低。

純凈的DNA樣品 A260/A280介于1.8～2.0，小于1.8表明有蛋白質污染，大于2.0表明嚴重降解或含有大量RNA。由表3可以看出，傳統(tǒng)酚-氯仿法、試劑盒提取的DNA其A260/A280比值偏大，表明DNA降解比較嚴重，與電泳檢測結果一致。改進方法提取的DNA其A260/A280比值介于1.78～1.91、接近1.8，表明提取的DNA純度較好。

M:DL15000 Marker；1—4:蘭州鲇基因組DNA; A:酚-氯仿法; B:試劑盒法

M:DL15000 Marker； 1—12:分別為蘭州鲇、大口鲇、小口鲇、胡子鲇、斑點叉尾鮰、黃桑、鯉魚、草魚、鯽魚、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈的基因組DNA

M:DL15000 Marker； 1—20:蘭州鲇基因組DNA圖3 改進方法提取的20尾蘭州鲇基因組DNA結果

表3 不同方法提取的魚類基因組DNA純度及濃度

方法A260/A280平均含量/(ng/μL)含量范圍/(ng/μL)酚-氯仿法2．02～2．14404．52±53．54349．4～468．8試劑盒法1．94～2．0689．67±13．4274．7～104．1改進的方法1．78～1．91216．96±71．3289．7～353．5

2.2 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR通用性

2.2.1 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種魚類中的擴增結果 由表4可以看出，14對G-SSR引物和21對EST-SSR引物均可在蘭州鲇個體中擴增出特異性片段。蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚類中的通用率相近，EST-SSR在鯉形目魚類中的通用率明顯高于G-SSR；6個EST-SSR型位點JZ845705、JZ905272、JZ905276、Z905309、JZ905311、JZ905314在12種魚類中均可獲得特異性擴增，且擴增片段大小基本一致，在G-SSR型位點中不曾發(fā)現這種現象。2種類型的微衛(wèi)星均表現出隨物種間遺傳距離的增加，其通用性下降(表5)。

表4 14個G-SSR和21個EST-SSR在12種魚類的擴增結果

SSR類型位點核心序列有效擴增率/%物種蘭州鲇大口鲇小口鲇革胡子鲇斑點叉尾鮰黃顙鯉魚草魚鯽魚白鰱花鰱大鼻吻鮈G-SSRKJ008491(AC)11?(TC)2325．00+++---------KJ008560(CT)14?(AC)1858．33+++--+-++--+KJ008535(AG)2850．00+++？-+-++---KJ008529(AG)28?(AC)1450．00++++？----+？+KJ008462(AG)31?(GT)3233．33+++--+------KJ008547(GA)1658．33+++？-+--+++？KJ008567(AG)1641．67++++？+？-----KJ008551(GA)2283．33++++？？++++++KJ008523(AC)3133．33+++--+-----？KJ008552(GA)22?(AG)32?(CA)3750．00+++--+-+？+--KJ008564(AC)2158．33++++？+-++--？KJ008548(GA)18?(AGAT)8?(AG)24?58．33+？+？-++++？+-(AGAT)7?(GA)29KJ008522(AC)29?(GA)2450．00++？？+--？-+++KJ008557(TC)20?(CT)1416．67++？---------EST-SSRJZ845705(AG)12?(GA)7100．00++++++++++++JZ845090(AC)12?(AC)1341．67+？-----+-+++JZ845784(TG)23?(GT)1825．00+++---------JZ845762(GT)13?(GA)1016．67++？---------JZ845190(CT)7?(TC)2558．33++++-++-？+--JZ845743(CT)2316．67++----？-----JZ845100(GCA)1433．33+++-+？------JZ845703(AC)16?(CT)2516．67++----------JZ845726(CAG)6?(AGC)741．67++-----++-？+JZ845789(TGC)18?(TGT)441．67+++-？----++-JZ905272(CA)40100．00++++++++++++JZ905276(GT)17100．00++++++++++++JZ905300(GT)2016．67++？---------JZ905308(AG)10?(GA)10?(AG)1225．00++？？+-------JZ905309(TC)11?(CA)8100．00++++++++++++JZ905311(GT)14?(AG)11100．00++++++++++++JZ905314(GA)13100．00++++++++++++JZ905328(CA)12?(AC)950．00+++？-？+？+？？+JZ905334(TG)1116．67++--？---？---JZ905338(CA)2591．67++？+++++++++JZ905348(TG)12?(TG)716．67++？---------

注：“+”表示有特異性擴增條帶；“-”表示無特異性擴增條帶；“?”表示非特異性擴增或擴增條帶很弱難以判斷。

表5 蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚類和鯉形目魚類中的通用率 %

2.2.2 G-SSR和EST-SSR擴增圖譜分析 根據蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種不同魚類的擴增圖譜(圖4)發(fā)現，G-SSR比EST-SSR在不同物種間具有更高長度變異性，如G-SSR型微衛(wèi)星位點KJ008547在白鰱和花鰱中的擴增條帶明顯偏大。

M：DL2000 Marker； 1—12:分別為以蘭州鲇、大口鲇、小口鲇、革胡子鲇、斑點叉尾鮰、黃顙、鯉魚、草魚、鯽魚、白鰱、花鰱、大鼻吻鮈基因組DNA為底物的PCR產物圖4 部分蘭州鲇G-SSR(A)和EST-SSR(B)PCR產物電泳檢測結果

3 結論與討論

高質量的DNA提取有4個關鍵：對組織和細胞進行有效破碎，使核蛋白釋放出來；核蛋白充分變性，釋放出DNA；使DNA酶失去活性，防止DNA被其酶解；盡量除去蛋白質、多糖等雜質污染。為此，在DNA提取過程中應盡量做到以上幾點以確保提取到高質量的基因組DNA。傳統(tǒng)的酚-氯仿法是提取動物基因組DNA最常用的方法，此方法為了最大限度除去蛋白質等雜質需多次抽提，每次抽提為了不吸到中間相雜質，需留下較多的上清液，抽提次數越多，DNA的損失量就越大；此外吸取上清對試驗操作者的技能要求較高，對初學者是一種挑戰(zhàn)；因整個試驗流程較長，出錯的可能性較大，造成提取效果不穩(wěn)定。

本試驗參考Turtinen等[19]和樂小亮等[5]的方法對傳統(tǒng)的酚-氯仿法進行改進，在組織消化完畢后，加入高濃度的NaAc，有利于DNA的充分溶解，蛋白質變性析出。同時加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇混合物(25∶24∶1)對裂解液抽提1次，得到大量低純度的基因組DNA，然后用基于吸附材料的離心柱型DNA純化試劑盒對其純化，得到高純度的DNA。這種DNA提取方法減少了抽提次數，DNA的損失量大大減少，DNA得率較高，并且可最大限度地除去蛋白質等雜質。改進的方法中DNA純化步驟主要采用離心的方式進行，便于批量化操作，且比傳統(tǒng)酚-氯仿法操作簡單，耗時少。與傳統(tǒng)的酚-氯仿法相比較，改進方法成本有所提高，但提取效果卻明顯提高。與專業(yè)的DNA提取試劑盒相比較，成本大幅降低，并且提取效果優(yōu)于試劑盒。此外，改進方法還具有需要樣品量小、穩(wěn)定性高、便于批量提取等優(yōu)點。

關于微衛(wèi)星的通用性在水生生物中的研究，前人已有報道[20-21]。本研究利用蘭州鲇14對G-SSR引物和21對EST-SSR引物對來自鲇形目和鯉形目的12種魚類進行通用性分析，結果顯示：蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目、鯉形目魚類中的通用率分別為63.10%、32.14%和61.11%、44.44%，表明蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在近緣物種中有很高的通用性，但隨著親緣關系拉大，微衛(wèi)星的通用性隨之降低。

6個EST-SSR型位點JZ845705、JZ905272、JZ905276、Z905309、JZ905311、JZ905314在12種魚類中均可獲得特異性擴增，且擴增片段大小基本一致，在G-SSR型位點中不曾發(fā)現這種現象。此外，根據二者的擴增圖譜發(fā)現，G-SSR比EST-SSR在不同物種間具有更高長度變異性，可見，基因組中編碼序列要比非編碼序列更為保守。本研究表明，蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在鲇形目魚類中的通用率相近，但EST-SSR在鯉形目魚類中的通用率明顯高于G-SSR，這表明EST-SSR比G-SSR在物種間通用性好，這一結果與Liewlaksaneeyanawin等[22]和宿俊吉等[23]的報道結果一致。蘭州鲇G-SSR和EST-SSR在12種魚類的通用率分別為47.62%和52.78%，具有較高的通用性，當缺乏微衛(wèi)星標記時，借用近緣物種的微衛(wèi)星是一種更為簡單、快捷、廉價的方法[15]。

本研究利用酚-氯仿法結合DNA純化試劑盒提取魚類基因組DNA效果較好，具有穩(wěn)定性高、操作簡單、節(jié)約時間和成本低等優(yōu)點，非常適合一些樣品珍貴、需批量提取的科學研究試驗。此外，本研究利用蘭州鲇微衛(wèi)星對來自鲇形目和鯉形目的12種魚類進行跨目通用性分析，結果顯示，隨著物種間親緣關系變大，其通用性逐漸降低，但部分微衛(wèi)星在親緣關系較遠的物種間仍具有很好的通用性。這些研究結果為微衛(wèi)星在跨目物種間的通用性研究及利用微衛(wèi)星開展比較基因組學等方面的研究提供基礎資料。

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Transferability Analysis ofSiluruslanzhouensisG-SSR and EST-SSR Markers in Siluriformes and Cypriniformes Fishes

YANG Zhongli1,2,LIAN Zongqiang2,3,WU Xudong1,2,3*,YU Zhaoxi1,WANG Yan2,XIAO Wei2,3,SAI Qingyun2,3
(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Ningxia Fisheries Research Institute,Yinchuan 750001,China; 3.Ningxia Engineering Research Center for Fisheries,Yinchuan 750001,China)

In order to investigate the transferability ofSiluruslanzhouensisG-SSR and EST-SSR in Siluriformes and Cypriniformes,12 different fishes were used as research objectives to extract genomic DNA by using improved phenol-chloroform method,which combined with DNA purification kit,traditional phenol-chloroform method and DNA extraction kit,respectively.The genomic DNA was detected by agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometer.The results showed that the genomic DNA extracted by the improved phenol-chloroform method was obviously superior to the other two methods in purity and stability,and the electrophoresis bands were very clear,neat and bright.The method had the advantages of simple manipulating,short time-consuming,speediness and batch extraction.Furthermore,14 G-SSRs and 21 EST-SSRs ofSiluruslanzhouensiswere selected to analyze the transferability of 12 Siluriformes and Cypriniformes fishes.The results indicated that the transferable rates of 14 G-SSRs and 21 EST-SSRs in Siluriformes and Cypriniformes fishes were 63.10%,32.14% and 61.11%,44.44% respectively,revealing that the transferability decreased with the increase of genetic relationship among species.

genomic DNA;Siluruslanzhouensis; Siluriformes; Cypriniformes; G-SSR; EST-SSR; transferability

2015-12-28

國家自然科學基金項目(31360633)；寧夏對外科技合作項目；國家科技支撐計劃項目(2012BAD25B09)

楊忠禮(1990-)，男，甘肅合水人，在讀碩士研究生，研究方向：淡水經濟動物生物學及增養(yǎng)殖。 E-mail:yang2009191048@163.com

*通訊作者：吳旭東(1967-)，男，寧夏銀川人，研究員，博士，主要從事水生動物分子生物學及種質資源保護與增養(yǎng)殖研究。E-mail:amy95@126.com

Q346+.5

A

1004-3268(2016)06-0130-07