信號通路抑制劑對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響

鄧守恒，吳亞玲，柯賢柱，陳 萍，李 芳，石小燕

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其發(fā)病率逐年上升。Lax等［1］將內(nèi)膜癌按發(fā)病機制分為兩型:Ⅰ型與雌激素相關(guān)，占85%;Ⅱ型與雌激素無關(guān)，占15%。其中I型最常見的分子水平改變?yōu)?人10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白基因 (PTEN)突變?nèi)笔Ъ発－RAS基因突變等［2］。已知子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與一些信號通路的活性改變密切相關(guān)，其中主要包括表皮生長因子受體 (EGFR)和雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)兩條通路。當前，抑制相關(guān)信號通路已成為腫瘤靶向治療的熱點，故本研究擬以PTEN呈不同表達狀態(tài)的兩株子宮內(nèi)膜癌細胞株 (PTEN缺失的Ishikawa細胞和PTEN表達完整的HEC－1A細胞)為研究對象，采用 EGFR及mTOR兩條信號通路抑制劑進行干預(yù)，觀察兩株子宮內(nèi)膜癌細胞的生物學行為改變，探討不同PTEN狀態(tài)下兩條信號通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的可能作用，為進一步明確發(fā)病機制，合理選擇抗腫瘤藥物提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑和儀器 表皮生長因子 (EGF)、甲基纖維素(CPS4000)、碘化丙錠 (PI)為Sigma產(chǎn)品;EGFR抑制劑RG－14620(RG)、mTOR抑制劑雷帕霉素 (RA)購自美國Biomol公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;Transwell小室購自美國Costar公司;BMP型倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;Epics Elite ESP型流式細胞儀購自美國Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 兩株子宮內(nèi)膜癌細胞株 (Ishikawa和HEC－1A)由本院臨床醫(yī)學研究所提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%CO2條件下培養(yǎng)。兩株細胞分別經(jīng)EGF預(yù)處理2 h，并分別給予10 μmol/L RG、10μmol/L RA、10μmol/L RG+10μmol/L RA，另設(shè)空白對照細胞 (未給予任何信號通路抑制劑)，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 細胞克隆法檢測細胞增殖 參照文獻［3］配制半固體培養(yǎng)基，收集經(jīng)不同抑制劑處理24 h后的各組細胞，PBS洗去藥物，離心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培養(yǎng)液稀釋為7.0×103個/ml單細胞懸液，于24孔板預(yù)加1.2%甲基纖維素培養(yǎng)基1.0 ml/孔，加入單細胞懸液50μl，使每孔細胞數(shù)為350個，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，混勻后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12～14 d后于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù)，計算細胞存活率 (給藥組平均克隆數(shù)/未給藥組平均克隆數(shù)×100%)。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式法檢測細胞周期及凋亡 收集消化經(jīng)不同抑制劑處理24 h后的各組細胞，0.01 mol/L PBS 0.5 ml重懸細胞，加70%乙醇1 ml，－20℃固定24 h，加入PI(終濃度為50 μl/ml)和RNA酶 (終濃度為0.25 mg/ml)，室溫下避光孵育30 min后流式細胞儀做DNA分析，以ModFit LT軟件分析，擬合計算各時相細胞的百分比。

1.2.4 Transwell法分析細胞侵襲性改變 細胞分組及處理同上，在Transwell小室 (Costar公司)中進行，NIH3T3細胞培養(yǎng)液做趨化液，在上室內(nèi)加入100μl不含胎牛血清的DMEM，37℃孵育1 h，加入上述各組細胞懸液20μl(調(diào)細胞濃度為1.0×105個/ml)，每組4個復(fù)孔。37℃ 12 h后取出濾膜，甲醇固定，HE染色。顯微鏡下計數(shù)濾膜外表面的細胞數(shù)，每張濾膜隨機取5個視野 (×200)取均值，實驗重復(fù)3次，以相對侵襲抑制率表示腫瘤細胞的侵襲力，相對侵襲抑制率 (%)=(對照組－實驗組)/對照組×100%。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 未經(jīng)處理的Ishikawa細胞核大，多形，核仁多個，肥大，胞質(zhì)內(nèi)線粒體等細胞器形態(tài)正常，經(jīng)10 μmol/L RG和10μmol/L RA單獨或合用處理24 h后，細胞貼壁能力下降，細胞外形發(fā)生改變，許多細胞脫落，細胞數(shù)量明顯減少，細胞表面空泡明顯增多，上清液中可見細胞碎片(見圖1)，兩藥合用組效果更為明顯。相比之下，HEC－1A細胞則對上述抑制劑處理不太敏感，細胞外形基本未改變，無明顯凋亡、生長抑制現(xiàn)象發(fā)生 (見圖2)。

2.2 兩株子宮內(nèi)膜癌細胞周期分布、凋亡率比較 RG、RA單獨作用后的Ishikawa細胞G1期細胞比例均較對照Ishikawa細胞呈明顯上升趨勢，S期細胞比例明顯下降 (p＜0.05)，RG、RA合用，Ishikawa細胞 G1期比例上升更明顯 (p＜0.05)，而S期比例則下降更顯著 (p＜0.01)。等劑量的RG、RA單獨或聯(lián)合作用HEC－1A細胞后，G1期和S期細胞比例與對照HEC－1A細胞組比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。RG、RA均可誘導(dǎo) Ishikawa細胞出現(xiàn)凋亡 (p＜0.05)，聯(lián)合使用凋亡率更高 (p＜0.01)，而RG、RA單獨或聯(lián)合作用對HEC－1A細胞誘導(dǎo)的凋亡作用均不明顯 (P＞0.05)。RG、RA單獨或聯(lián)合作用對Ishikawa細胞產(chǎn)生的凋亡率均明顯高于相同處理的HEC－1A細胞組 (p＜0.01，見表1)。

圖1 Ishikawa細胞對EGFR單獨或聯(lián)合mTOR信號通路抑制劑的光鏡下表現(xiàn) (×200)Figure 1 Change of Ishikawa cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

圖2 HEC－1A細胞對EGFR單獨或聯(lián)合mTOR信號通路抑制劑的光鏡下表現(xiàn) (×200)Figure 2 Change of HEC－1A cell morphology after treatment with signal transduction inhibitor

表1 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率和細胞周期分布影響 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表1 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡率和細胞周期分布影響 ，n=4)Table 1 The effect on apoptosis rate and cell phase of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:與Ishikawa組比較，*p＜0.05，△p＜0.01;與Ishikawa+RG組比較，▲p＜0.01;與Ishikawa+RA組比較，☆p＜0.01;與Ishikawa+RG+RA組比較，○p＜0.01

類別 G1期細胞(%)S期細胞(%)M期細胞(%)凋亡率(%)Ishikawa 62.1±2.8 35.4±1.5 3.5±0.9 5.1±0.6 Ishikawa+RG 79.5±2.7 16.3±1.8* 4.2±1.1 25.3±1.2*Ishikawa+RA 77.3±1.9 18.7±2.3* 3.7±1.8 19.7±0.9*Ishikawa+RG+RA 85.2±3.1* 8.3±1.2△ 6.6±1.7 32.7±0.8△HEC－1A 67.2±3.2 31.6±1.7 1.7±0.8 3.7±0.7 HEC－1A+RG 69.5±3.1 29.8±2.1 1.2±0.4 5.4±0.6▲HEC－1A+RA 65.8±3.4 27.4±2.7 5.6±3.4 6.9±0.9☆HEC－1A+RG+RA 71.2±2.3 21.9±2.3 6.7±2.6 7.1±0.5○

2.3 抑制劑對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞存活率和侵襲力的影響RG、RA單獨作用24 h，Ishikawa細胞存活率分別降至 (52.7±5.3)%和 (48.6±4.6)%，與對照Ishikawa細胞存活率相比，差異有統(tǒng)計學意義 (p＜0.05)，RG、RA合用24 h，Ishikawa細胞存活率降至 (28.9±2.7)%，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。RG、RA單獨或聯(lián)合作用24 h后的Ishikawa細胞侵襲細胞數(shù)目均較對照Ishikawa細胞組顯著下降 (p＜0.01)，細胞侵襲抑制率均明顯增加 (p＜0.01)，RG、RA單獨或聯(lián)合作用HEC－1A細胞24 h，細胞存活率、侵襲細胞數(shù)目雖較對照HEC－1A細胞有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。經(jīng)RG、RA單獨或聯(lián)合作用后各組HEC－1A細胞存活率、侵襲細胞數(shù)目及侵襲抑制率與相應(yīng)處理的Ishikawa細胞組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (p＜0.01，見表2)。

表2 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞存活率和侵襲力影響，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

表2 RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞存活率和侵襲力影響，n=4)Table2 The effect on survival rate and invasion of two human endometrial carcinoma cell after admistration of RG and RA

注:與Ishikawa組比較，*p＜0.05，△p＜0.01;與 Ishikawa+RG組比較，▲p＜0.01;與Ishikawa+RA組比較，☆p＜0.01;與Ishikawa+RG+RA組比較，○p＜0.01

類別 存活率 (%)侵襲細胞 (n)抑制率 (%)Ishikawa 100 206±20 0 Ishikawa+RG 52.7± 5.3* 117±12△ 43.3±5.6△Ishikawa+RA 48.6± 4.6* 124±19△ 38.9±7.1△Ishikawa+RG+RA 28.9± 2.7△ 94± 6△ 54.3±4.3△HEC－1A 100 227±14 0 HEC－1A+RG 91.3± 9.5▲ 199±21▲ 12.8±2.2▲HEC－1A+RA 89.8±11.2☆ 205±23☆ 10.4±2.9☆HEC－1A+RG+RA 87.6±10.7○ 187±19○ 17.9±4.7○

3 討論

惡性腫瘤的生物學行為之一是失控性生長，細胞周期出現(xiàn)紊亂導(dǎo)致細胞始終處于增殖狀態(tài)而不能進入靜止期以及細胞凋亡受阻是腫瘤細胞失控性生長得以發(fā)生的主要機制［4］。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是指原發(fā)灶的腫瘤細胞脫落，隨循環(huán)移動后與血管、淋巴管內(nèi)皮細胞黏附、進而侵襲穿過內(nèi)皮細胞及其基底膜定植形成轉(zhuǎn)移灶［5］，是惡性腫瘤的另一生物學行為。

本研究將EGFR抑制劑RG和mTOR抑制劑RA單獨和聯(lián)合作用于兩株不同子宮內(nèi)膜癌細胞，采用經(jīng)典方法觀察其對細胞生物學行為的影響，結(jié)果顯示，RG、RA單獨作用Ishikawa細胞能明顯阻滯細胞周期于G1期并誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡，兩種抑制劑合用則G1期阻滯和細胞凋亡更為顯著，相比之下，HEC－1A細胞則對上述抑制劑處理不太敏感，G1期細胞比例和凋亡率雖有上升趨勢，但均無統(tǒng)計學差異，與鏡下觀察的細胞形態(tài)學改變相一致。細胞克隆和侵襲實驗結(jié)果顯示，HEC－1A細胞對RG、RA單獨和聯(lián)合作用均不敏感，而兩種抑制劑單獨作用后的Ishikawa細胞存活率和侵襲能力均明顯下降，抑制率明顯增加，合用兩種抑制劑則可進一步降低細胞存活率，抑制細胞的侵襲。經(jīng)RG、RA單獨或聯(lián)合作用后的各組Ishikawa細胞存活率、侵襲細胞數(shù)目及侵襲抑制率與相應(yīng)處理的HEC－1A細胞組比較，差異均具有顯著性。

由上述結(jié)果可看出，(1)RG、RA單獨或聯(lián)合使用均可通過阻滯細胞周期于G1期誘導(dǎo)Ishikawa細胞凋亡，兩抑制劑合用，細胞凋亡率更高。(2)由于克隆形成法可反映出單個細胞的增殖能力，故RG、RA不僅對增殖期Ishikawa細胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，而且還對Ishikawa腫瘤干細胞具有明顯的生長抑制作用，這較單純抑制或殺死癌細胞本身具有更大的參考價值［6］。(3)RG、RA均可降低Ishikawa細胞侵襲力，有效抑制細胞的遠處轉(zhuǎn)移，二者合用作用更強。(4)RG、RA單獨和合用對Ishikawa細胞作用效果明顯，而對HEC－1A細胞相對不明顯，說明EGFR和mTOR信號通路僅在PTEN基因表達缺失時才對抑制劑作用敏感，PTEN基因在整合多條信號通路中發(fā)揮著重要作用，可通過影響靶分子及其上下游的信號級聯(lián)反應(yīng)對細胞生物學行為產(chǎn)生影響，這與趙麗君等［7］將HEC－1A細胞PTEN基因敲減后觀察到的細胞生物學行為改變及Blanco等［8］得出的結(jié)論一致。

PTEN突變在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中是一個早期事件［9－10］，PTEN在人子宮內(nèi)膜癌中的突變丟失率可高達60% ～80%［11］，PTEN的丟失又可進一步激活子宮內(nèi)膜細胞中的磷酸化AKT通路［12］，說明PTEN的缺失突變與子宮內(nèi)膜癌的形成和發(fā)生、發(fā)展都有著密切聯(lián)系。PTEN基因?qū)僖职┗?，定位于染色體10q23.3，由9個外顯子和8個內(nèi)含子構(gòu)成，其cDNA序列包含由1 209個核苷酸組成的開放閱讀框架，編碼403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，可通過雙重磷酸酯酶活性負性調(diào)控三條途徑(PI3K/AKT/mTOR途徑、FAK途徑和MAPK途徑)來調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、凋亡、細胞遷移、血管生長等。本研究結(jié)果提示PTEN基因的表達水平還可成為預(yù)測相關(guān)信號通路抑制劑敏感與否的標志物之一。腫瘤患者在接受化療前如果能了解此種腫瘤中是哪條或哪幾條信號通路起主要作用，就可能有針對性地應(yīng)用信號通路抑制劑，提高化療效果。本研究為進一步闡明子宮內(nèi)膜癌的致病機制，更好地選擇信號通路抑制劑治療目標人群、提高其治療有效率提供了一個新靶向。

1 Lax SF，Kurman RJ.A dualistic model for endometrial carcinogenesis based on immunohisto －chemical and molecular geneticanalyses［J］.Verh Dtsch Ges Path，1997，81(10):228 －232.

2 Para J，Gallardo A，Catasus I，et al.Endometrial carcinoma:pathol and genetics［J］.Pathology，2007，39(5):72 －87.

3 韓銳.抗癌藥物研究與實驗技術(shù)［M］.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1996:284－290.

4 Frew AJ，Lindemann RK，Martin BP，et al.Combination therapy of established cancer using a histone deacetylase inhibitor and a TRAIL receptor agonist［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(12):11317－11322.

5 Tantivejkul K，Vvcenik I，Shamsuddin AM.Inositol hexaphos phate(IP6)inhibits key events of cancer metastasis:In vitro studies of adhesion，migration and invasion of MDA －MB 231 human breast cancer cells［J］.Anticancer Res，2003，23(5A):3671－3679.

6 潘啟超，胥彬.腫瘤藥理學及化學治療學［M］.廣東:廣東高等教育出版社，1989:45－47.

7 趙麗君，魏麗惠，劉寧，等.PTEN基因敲減后HEC－1A細胞生長和信號通路變化的研究 ［J］.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2008，9(3):191－195.

8 Blanco Aparicio C，Refiner O，Leal JF，et al.PTEN，more than the AKT pathway［J］.Carcinogenesis，2007，28(2):1379－1386.

9 Bakiewicz A，Gozdzik J，Sporny S.Pten gene expression in the endometrial mucosa［J］.Ginekol Pol，2006，77(4):323 －329.

10 石紹蘭，高寶蓮.子宮內(nèi)膜癌中Bcl－2、PTEN表達的研究 ［J］.中國婦幼保健，2010，25(12):1632－1634.

11 Dahia PL.PTEN，a unique tumor suppressor gene.Endocr Relat［J］.Cancer，2000，7(2):115 －129.

12 GAO Qling － lei，YE Fei，XIA Xi，et al.Correlation between PTEN Expression and PI3K/Akt Signal Pathway ln Endometrial carcinoma［J］.Journal of Huazhong Uni Sci Technol(Med Sci)，2009，29(1):59－63.