• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    飼料原料基質中不同營養(yǎng)成分對黃曲霉毒素B1合成關鍵基因表達影響的研究

    2020-11-05 09:58:42余保寧張妮婭齊德生
    飼料工業(yè) 2020年20期
    關鍵詞:水蘇天冬氨酸精氨酸

    ■劉 婕 余保寧 李 理 張妮婭 齊德生*

    (1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州510641;2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司,廣東廣州511356;3.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,湖北武漢430070)

    據(jù)世界糧農(nóng)組織估計,目前世界范圍內(nèi)至少有25%的農(nóng)作物受到了真菌毒素的污染[1],其中黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)的污染最嚴重。不同的飼料原料被黃曲霉毒素污染的程度會有差別,如同為能量飼料的玉米和小麥,玉米更容易被AF污染;且同為蛋白質飼料的豆粕和花生粕,花生粕更易被AF污染[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),在油料種子中AF 的污染要更嚴重[2],Mellon 等[3]發(fā)現(xiàn),在玉米胚中A. flavus產(chǎn)生AFB1的量遠遠高于玉米胚乳中的產(chǎn)毒量。且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),除了油脂含量能顯著影響AFB1合成以外,飼料原料基質成分的差異也會造成AF污染水平的不同[2,4]。天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生,而銅、鐵和錳不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1。隨著可溶性糖、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量增加,均能明顯促進黃曲霉菌絲生長(P<0.05);而鋅、鐵和錳均能促進黃曲霉菌絲生長,但是銅明顯抑制黃曲霉菌絲生長(P<0.05)[4]。目前的研究基本闡明了不同的飼料原料被AF污染存在差異性主要是由飼料中的營養(yǎng)成分的種類和含量所決定的,但這些營養(yǎng)成分的調(diào)控機制是什么,還需要進一步研究。因此本研究在課題組前期試驗結果的基礎上,選取對A. flavus產(chǎn)毒和生長影響較大的營養(yǎng)成分及水平,研究其對AF 生物合成過程中的關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM和aflP)的表達情況的影響。從而揭示飼料中不同營養(yǎng)成分對A. flavus產(chǎn)毒影響的作用機制。本研究結果將對指導飼料生產(chǎn)以及控制飼料AFB1污染提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    黃曲霉產(chǎn)毒菌株(Aspergillus flavusNRRL-3357)由中山大學賀竹梅教授實驗室贈送。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Detrose Agar,PDA)(青島海博生物技術有限公司)。DNA Marker(大連寶生物)、瓊脂糖(Biowest,法國)、TRizol 試劑(Invitrogin,美國)、反轉錄試劑盒(Takara,日本)、RNase Inhibitor(Vazyme Biotech,美國)、Premix Taq(Takara,日本)、iTaq Universal SYBR Green Super mix(Bio-Rad,美國)。本試驗用到的所有化學試劑無特殊說明均為分析純。

    試驗所用的基礎培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基:0.3%NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4·7H2O和3.0% 蔗糖。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌株保存活化及孢子懸浮液的制備

    將A. flavusNRRL-3357菌株保存在20%甘油中,然后保藏于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)研究。待用時,將保存的菌株在PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng),于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d。然后在培養(yǎng)皿中加入約20 ml孢子洗滌液(含有0.05% 吐溫-80的無菌生理鹽水)[5],用無菌棉棒輕輕洗下黃曲霉孢子,然后將含有孢子的洗滌液經(jīng)過4層無菌紗布過濾,收集濾液于含有玻璃珠的無菌藍蓋試劑瓶中,振蕩搖勻,讓孢子均勻分布在孢子洗滌液中。吸取適量的孢子液小心置于血球計數(shù)板(25×16)的計數(shù)室內(nèi),蓋上蓋玻片,靜置片刻,在顯微鏡下計數(shù)。然后將孢子液稀釋到需要的濃度備用[6]。

    1.2.2 菌絲體的收集

    參考前期研究的結果[4]及國內(nèi)外研究數(shù)據(jù),選擇可溶性糖:蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖;氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸;微量元素:鋅(七水硫酸鋅ZnSO4·7H2O)和銅(五水硫酸銅CuSO4·5H2O)作為試驗材料??扇苄蕴堑奶砑恿繛?.0、3.0 g/100 ml;氨基酸的添加量為0.5 g/100 ml;微量元素的添加量為50 mg/l。用6.0 mol/l的鹽酸和5.0 mol/l的NaOH將每組培養(yǎng)基的pH 值調(diào)至6.0。然后將培養(yǎng)基分裝到100 ml 三角瓶中,每個三角瓶中培養(yǎng)基的體積為30 ml。用透氣封口膜封口后121 ℃高溫高壓滅菌20 min,待冷卻至室溫后,接種100 μl 黃曲霉孢子菌懸液(1×108個/ml)混勻,將三角瓶用透氣封口膜封口之后置于氣浴搖床中培養(yǎng)3 d 和5 d,培養(yǎng)溫度為30 ℃,搖床轉速為150 r/min。培養(yǎng)結束后將三角瓶中的培養(yǎng)基和菌絲體通過濾紙過濾,收集菌絲體,菌絲體保存于-80 ℃用于基因表達量的測定。每組5個重復。

    1.2.3 AFB1合成相關基因表達量測定

    總RNA 的 提 取 采 用TRIzol Reagent(InvitrogenTM, USA),并參考曾麗梅[7]的方法。RNA 反轉錄使用的是Takara PrimeScript反轉錄試劑盒,反轉錄反應條件:37 ℃15 min;85 ℃5 s;結束后保持4 ℃。

    1.2.4 Real-time PCR基因表達量的檢測

    1.2.4.1 引物設計

    利用Primer 5.0引物分析軟件分別設計此次試驗所用的特異性上下游引物,beta-tubulin基因作為內(nèi)參基因。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物用超純水配置成10 μmol/l的工作溶液,-20 ℃保存。各引物序列如表1所示。

    1.2.4.2 cDNA質量檢測

    將提取的總RNA 進行反轉錄后,通過PCR 擴增檢測反轉錄得到的cDNA 的質量。并對設計的引物用cDNA進行PCR擴增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產(chǎn)物。

    表1 試驗所涉及的引物

    PCR 反應程序:98 ℃,5 min;98 ℃,10 s;55 ℃,30 s;72 ℃,45 s;72 ℃,10 min;40 個循環(huán),反應結束后保持在4 ℃。

    1.2.4.3 Real-time PCR

    確定了模板cDNA 和各對引物的質量后,Realtime PCR 試驗使用BIO-RAD 公司的iTaq Universal SYBR Green Supermix,在BIO-RAD CFX 系列Realtime PCR檢測系統(tǒng)上完成。

    反應程序:95 ℃,4 min;95 ℃,10 s;57 ℃,10 s;72 ℃,20 s;40 個循環(huán)。熔解曲線條件:55 ℃升溫至93.5 ℃,每0.5 ℃讀5 s。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    圖1 可溶性糖對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    本試驗的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理之后,結果按照“平均值±標準差(SD)”的方式表示。然后利用SPASS 22.0(Chicago,USA)軟件進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析。使用Duncan′s 檢驗對各處理組間平均值進行多重比較,P<0.05為差異顯著?;虻南鄬Ρ磉_量用2-△△Ct方法進行計算。

    2 結果

    本試驗研究了不同的營養(yǎng)成分對AF合成過程中相關基因表達的影響。試驗選擇了5個關鍵基因,分別是AF 合成過程中最關鍵的兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS,以及3 個結構基因aflD、aflM和aflP,這3 個結構基因分別代表了AF合成的前、中、后期3個階段。

    2.1 可溶性糖對AF合成中關鍵基因表達的影響(見圖1)

    根據(jù)前期試驗結果,由于果糖和棉子糖對AFB1 合成的促進作用不如其它4 種可溶性糖明顯,所以選擇了蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖作用試驗材料,而且1.0%和3.0%的可溶性糖對黃曲霉產(chǎn)毒的影響差異很明顯,所以本試驗選擇1.0%和3.0%兩個濃度。在培養(yǎng)5 d 時,4 種可溶性糖對AF合成相關基因的表達的影響見圖1。相比于1.0%的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖,當這4 種可溶性糖的含量增加到3.0%時,能明顯促進基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,同時3.0%葡萄糖(P<0.01)和水蘇糖(P<0.001)也顯著促進了aflP基因的表達。對于蔗糖、葡萄糖和麥芽糖,基因aflP表達量增加最為明顯,增加了近百倍,而在水蘇糖中基因aflS的表達量增加最為明顯。

    2.2 氨基酸對AF 合成中關鍵基因表達的影響(見圖2~圖3)

    圖2 天冬氨酸(A)、谷氨酸(B)、精氨酸(C)對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    圖3 天冬氨酸(A)、谷氨酸(B)、精氨酸(C)對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(3 d)

    根據(jù)前期試驗結果得知,由于丙氨酸和甘氨酸對AFB1 合成的促進作用不如天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸明顯,所以選擇了0.5%天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸進行研究。3 種氨基酸對AF 合成相關基因的表達見圖2(培養(yǎng)5 d)。培養(yǎng)5 d時,天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定促進作用,但差異不顯著;而在培養(yǎng)3d時,天冬氨酸可以明顯促進這5個關鍵基因的表達,見圖3A。培養(yǎng)5 d 時,谷氨酸明顯提高了基因aflP、aflD和aflM的表達量(P<0.05),同時對基因aflS和aflP的表達也有一定的促進作用,差異不顯著;但在培養(yǎng)3 d 時,谷氨酸顯著上調(diào)了基因aflP的表達(P<0.01),見圖3B。同樣在培養(yǎng)5 d時,精氨酸可以顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP(P<0.05)和aflS(P<0.001)的表達量,但是同時也抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達(P<0.01),而在培養(yǎng)3 d 時精氨酸對基因aflD、aflM和aflP的表達有一定的促進作用見圖3C。

    2.3 銅和鋅對AF 合成過程中關鍵基因表達的影響(見圖4~圖5)

    圖4 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    圖5 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(3 d)

    根據(jù)課題組前期的試驗結果,鋅能夠明顯促進AFB1合成,銅不僅顯著抑制了AFB1合成還抑制了黃曲霉菌絲生長,所以選擇50 mg/l 的鋅和銅作為研究對象。鋅和銅對AF合成相關基因的表達見圖4(培養(yǎng)5 d)。與對照組相比,鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,同時銅明顯抑制aflP、aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達。雖然在培養(yǎng)5 d 后,鋅對AF合成關鍵基因的表達都是抑制狀態(tài),但是在培養(yǎng)3 d時,鋅能夠極顯著地促進這5 個關鍵基因的表達(P<0.001),尤其是基因aflP,表達量上調(diào)200 多倍,見圖5A;銅依然顯著抑制了基因aflP和aflS的表達見圖5B。

    3 討論

    AF生物合成的初始階段類似于脂肪酸的生物合成,即乙酰CoA(Acetyl-CoA)作為其起始單位,而丙二酸單酰CoA作為延長單位,在聚酮化合物合成酶的催化作用下形成AF 的聚酮骨架[8-10]。AF 的生物合成調(diào)控是一個復雜的多個途徑相互作用的過程,AF 合成通路基因成簇排列在70 kb的DNA序列上,其序列上包含了25個已定義明確的基因[11]。如基因aflP和aflS是AF 合成基因簇中相鄰的兩個調(diào)節(jié)基因,直接調(diào)控著AF 和ST(sterigmatocystin)的合成。aflD基因編碼的酮還原酶,可以將NOR(norsolorinic acid)轉化為AVN(averantin)[12];aflM參 與DMST(demethyl-sterigmatocystin)的合成[13];aflP參與ST 到OMST(O-methylsterigmatocystin)以及DMST 到DHOMST(dihydro-demethyl-sterigmatocystin)的轉化過程[14]?;騛flD、aflM、aflP分別代表了AF 合成途徑中的前中后段[15]。因此,本試驗一共選取這5個關鍵基因作為代表來研究這些營養(yǎng)元素對AF合成相關基因表達的影響。

    天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生,而銅不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1[4]。本試驗選擇了1.0%和3.0%的蔗糖、果糖、麥芽糖和水蘇糖作為研究對象。結果表明,3.0%的可溶性糖都能明顯促進aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達,3.0%葡萄糖和水蘇糖促進了aflP基因的表達,但是蔗糖和麥芽糖中aflP基因的表達卻受到了抑制,可能是因為末端產(chǎn)物(AF)積累過多從而反饋阻遏了aflP基因的表達。本試驗選擇了0.5%的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸作用試驗材料。培養(yǎng)5 d時,天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定的促進作用,但是差異不顯著;谷氨酸明顯提高基因aflP、aflD和aflM的表達量,但基因aflS和aflP差異不顯著,精氨酸顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達量,同時抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達。但是在培養(yǎng)3 d時,AFB1在培養(yǎng)基中還沒有大量積累,3種氨基酸均明顯刺激了5 個關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM、aflP)的表達。同樣,這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在了微量元素的試驗中,培養(yǎng)5 d 時鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,但是在培養(yǎng)3 d時,鋅極顯著地促進了這5 個關鍵基因的表達。這個現(xiàn)象也進一步證實了AFB1 的積累會反饋阻遏AF 合成相關基因的表達,這種反饋阻遏首先是抑制結構基因的表達,然后再抑制調(diào)節(jié)基因的表達。銅不利于AFB1 的合成[4],首先是抑制了兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達,然后再抑制結構基因的表達。本試驗結果表明,這些營養(yǎng)元素通過促進關鍵基因的表達,從而加強AFB1合成,其中對結構基因aflM和aflP影響尤為顯著,同時調(diào)節(jié)基因aflP和aflS在AFB1合成過程中起關鍵作用。

    4 結論

    不同飼料原料中AFB1污染存在差異是由各種成分共同作用的結果,因此,通過調(diào)控原料中單一營養(yǎng)成分來控制飼料原料中AFB1的污染很難實現(xiàn)??扇苄蕴?、氨基酸和微量元素均可通過對AF 合成關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM、aflP)不同程度的上調(diào),從而促進AFB1 合成。所以可以尋求物理、化學或生物的方法,抑制AF 合成調(diào)節(jié)基因(aflP、aflS)的表達,從而控制黃曲霉毒素的污染。

    猜你喜歡
    水蘇天冬氨酸精氨酸
    天冬氨酸酶的催化特性及應用進展
    設計優(yōu)化微波輔助法提取草石蠶中水蘇糖
    水蘇糖的研究現(xiàn)狀
    不同金屬離子對天冬氨酸酶基因工程菌活性影響的研究
    山東化工(2017年22期)2017-12-20 02:43:37
    綠色水處理劑聚天冬氨酸的研究進展
    精氨酸聯(lián)合谷氨酰胺腸內(nèi)營養(yǎng)對燒傷患者的支持作用
    失神經(jīng)支配環(huán)杓后肌形態(tài)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表達的研究
    精氨酸、可樂定、精氨酸聯(lián)合左旋多巴不同激發(fā)試驗對GH分泌的影響
    高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定婦康寧片中鹽酸水蘇堿含量
    精氨酸甲基轉移酶在癌癥發(fā)病機制中的作用
    久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日本中文国产一区发布| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 在线观看免费高清a一片| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99精品久久久久人妻精品| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线天堂中文资源库| 成人手机av| 男女高潮啪啪啪动态图| 成年版毛片免费区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲人成电影观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成年版毛片免费区| 国产不卡av网站在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品免费大片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av视频免费观看在线观看| 欧美在线一区亚洲| 一级片'在线观看视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品美女久久av网站| 国产色视频综合| 搡老乐熟女国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲五月天丁香| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲,欧美精品.| 99riav亚洲国产免费| 正在播放国产对白刺激| 不卡一级毛片| 一个人免费在线观看的高清视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 91九色精品人成在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 久久中文字幕一级| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 在线观看免费高清a一片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天天添夜夜摸| 成人三级做爰电影| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 丰满的人妻完整版| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 麻豆乱淫一区二区| 日本黄色日本黄色录像| 老司机午夜十八禁免费视频| 超碰成人久久| 在线视频色国产色| 中文字幕人妻丝袜制服| 十八禁网站免费在线| 久久久久国内视频| 一级毛片女人18水好多| 少妇粗大呻吟视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 不卡av一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 一级,二级,三级黄色视频| 正在播放国产对白刺激| 国产高清视频在线播放一区| 成年人免费黄色播放视频| 久久香蕉激情| 中文字幕高清在线视频| 亚洲第一av免费看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产99久久九九免费精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成年人免费黄色播放视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 韩国av一区二区三区四区| 国产男靠女视频免费网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久久国产成人精品二区 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 看片在线看免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | av线在线观看网站| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精华国产精华精| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线观看一区二区三区激情| 女人久久www免费人成看片| 久久九九热精品免费| 99久久综合精品五月天人人| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲欧美激情在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品在线美女| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 午夜福利在线免费观看网站| 国产亚洲欧美98| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 韩国精品一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 18在线观看网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久热在线av| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲视频免费观看视频| cao死你这个sao货| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久国产乱子伦精品免费另类| 美女高潮到喷水免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| av网站在线播放免费| 咕卡用的链子| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利,免费看| 一级片免费观看大全| 久久久国产成人精品二区 | 怎么达到女性高潮| 一级黄色大片毛片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看日韩欧美| 制服人妻中文乱码| 国产精品1区2区在线观看. | 午夜福利在线观看吧| 亚洲综合色网址| 色播在线永久视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| www日本在线高清视频| 在线观看一区二区三区激情| 在线看a的网站| 婷婷丁香在线五月| 咕卡用的链子| 日韩欧美国产一区二区入口| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| a级毛片在线看网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美激情极品国产一区二区三区| 超色免费av| 黑人猛操日本美女一级片| 女性被躁到高潮视频| 国产深夜福利视频在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| a级毛片在线看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| av电影中文网址| 亚洲 国产 在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久久久国内视频| 在线播放国产精品三级| 欧美激情久久久久久爽电影 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲久久久国产精品| 免费观看a级毛片全部| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 丰满的人妻完整版| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美激情极品国产一区二区三区| 看片在线看免费视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一区二区三区精品91| 黑人操中国人逼视频| 精品人妻在线不人妻| av福利片在线| 麻豆成人av在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久ye,这里只有精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜福利在线观看吧| 男男h啪啪无遮挡| 欧美黑人精品巨大| 99久久国产精品久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜福利在线免费观看网站| 中文字幕最新亚洲高清| 国产xxxxx性猛交| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 午夜影院日韩av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 女人精品久久久久毛片| 成年人午夜在线观看视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产又爽黄色视频| 一夜夜www| 女人被狂操c到高潮| 咕卡用的链子| tube8黄色片| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲,欧美精品.| 欧美乱妇无乱码| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 丝袜在线中文字幕| 19禁男女啪啪无遮挡网站| av福利片在线| 午夜福利影视在线免费观看| av欧美777| 在线观看午夜福利视频| 一级毛片精品| 精品人妻1区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 最新在线观看一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 很黄的视频免费| 午夜91福利影院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 色精品久久人妻99蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 午夜激情av网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一级作爱视频免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产xxxxx性猛交| 中亚洲国语对白在线视频| 精品第一国产精品| 丝袜在线中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| 首页视频小说图片口味搜索| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 多毛熟女@视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 人妻一区二区av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 成年人免费黄色播放视频| 夫妻午夜视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 后天国语完整版免费观看| 亚洲色图av天堂| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久久久久久免费视频了| a级片在线免费高清观看视频| 大码成人一级视频| 精品亚洲成国产av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品av久久久久免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久精品免费免费高清| 久久久国产成人精品二区 | 女人久久www免费人成看片| 在线播放国产精品三级| 精品人妻在线不人妻| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产男靠女视频免费网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 97人妻天天添夜夜摸| 香蕉丝袜av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 1024香蕉在线观看| 国产精品免费大片| 精品视频人人做人人爽| 高清av免费在线| 村上凉子中文字幕在线| x7x7x7水蜜桃| 国产精品影院久久| 精品无人区乱码1区二区| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩视频精品一区| 丰满饥渴人妻一区二区三| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品久久久久久久毛片微露脸| av国产精品久久久久影院| 亚洲成人国产一区在线观看| 伦理电影免费视频| 久久亚洲精品不卡| 欧美黄色淫秽网站| av中文乱码字幕在线| 操出白浆在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看www视频免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人精品久久二区二区91| 在线观看舔阴道视频| 女人久久www免费人成看片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 1024香蕉在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久久视频综合| 免费少妇av软件| 亚洲成国产人片在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲精品国产区一区二| 久久久国产成人免费| 国产99白浆流出| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久精品区二区三区| 香蕉国产在线看| 国产精品免费视频内射| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品在线美女| 香蕉丝袜av| 看黄色毛片网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲在线自拍视频| 久久久久精品人妻al黑| 国精品久久久久久国模美| 亚洲久久久国产精品| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲伊人色综图| 午夜福利在线观看吧| 亚洲色图av天堂| 国产成人精品无人区| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 不卡av一区二区三区| 91av网站免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 黄色成人免费大全| 午夜免费观看网址| 亚洲国产欧美一区二区综合| 91大片在线观看| 午夜影院日韩av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 又紧又爽又黄一区二区| 大陆偷拍与自拍| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久国产欧美日韩av| 两性夫妻黄色片| 色老头精品视频在线观看| 捣出白浆h1v1| svipshipincom国产片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产综合久久久| 亚洲第一青青草原| 很黄的视频免费| 97人妻天天添夜夜摸| 老司机影院毛片| 欧美大码av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久99久视频精品免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产男女超爽视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲欧美激情在线| 制服诱惑二区| 国产深夜福利视频在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 嫩草影视91久久| 美女 人体艺术 gogo| av中文乱码字幕在线| bbb黄色大片| 老司机靠b影院| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 99热网站在线观看| 男女午夜视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美黑人精品巨大| 国产在线精品亚洲第一网站| 五月开心婷婷网| 9191精品国产免费久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 曰老女人黄片| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品电影一区二区在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 嫩草影视91久久| 女人精品久久久久毛片| 日本欧美视频一区| 正在播放国产对白刺激| 精品乱码久久久久久99久播| 看片在线看免费视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久久久国内视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲九九香蕉| 欧美不卡视频在线免费观看 | 人人澡人人妻人| 亚洲熟妇熟女久久| 9191精品国产免费久久| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 青草久久国产| 99久久人妻综合| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 在线播放国产精品三级| 捣出白浆h1v1| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲欧美激情在线| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产精品sss在线观看 | 在线国产一区二区在线| 日韩欧美免费精品| 久久中文看片网| 成人影院久久| 女人久久www免费人成看片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色视频,在线免费观看| 91老司机精品| 91成年电影在线观看| 在线观看舔阴道视频| 国产成人精品无人区| 国产视频一区二区在线看| 后天国语完整版免费观看| 丝瓜视频免费看黄片| 精品久久蜜臀av无| 18禁国产床啪视频网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲熟妇熟女久久| 一本综合久久免费| 一级,二级,三级黄色视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 女警被强在线播放| 亚洲第一av免费看| av天堂久久9| 国产欧美亚洲国产| 不卡av一区二区三区| 免费看十八禁软件| 亚洲全国av大片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 人妻 亚洲 视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 男女下面插进去视频免费观看| 麻豆成人av在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产日韩欧美亚洲二区| www.熟女人妻精品国产| 久久久国产精品麻豆| 欧美性长视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 在线看a的网站| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲欧美激情在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产在线精品亚洲第一网站| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一区在线观看完整版| 亚洲成人免费av在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99在线人妻在线中文字幕 | 一区二区三区精品91| 好男人电影高清在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩欧美三级三区| 黑人操中国人逼视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 深夜精品福利| 又黄又粗又硬又大视频| 桃红色精品国产亚洲av| 99国产极品粉嫩在线观看| 多毛熟女@视频| 久久香蕉国产精品| www日本在线高清视频| 成人手机av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| √禁漫天堂资源中文www| 啦啦啦 在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产欧美日韩一区二区精品| 在线观看一区二区三区激情| 午夜免费鲁丝| 亚洲七黄色美女视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 两人在一起打扑克的视频| 久久久国产欧美日韩av| 高清av免费在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黑人猛操日本美女一级片| 精品人妻在线不人妻| 中出人妻视频一区二区| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 丁香欧美五月| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一a级毛片在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 精品亚洲成国产av| 成年女人毛片免费观看观看9 | 18在线观看网站| 国产亚洲一区二区精品| 免费观看a级毛片全部| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产成人av教育| 日本五十路高清| 久久久久视频综合| 一a级毛片在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 窝窝影院91人妻| 久久久久久久午夜电影 | 又紧又爽又黄一区二区| 久久性视频一级片| 三上悠亚av全集在线观看| 人人妻人人澡人人看| 村上凉子中文字幕在线| 精品欧美一区二区三区在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 一a级毛片在线观看| 正在播放国产对白刺激| 免费少妇av软件| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一二三四社区在线视频社区8| 男男h啪啪无遮挡| 一夜夜www| 亚洲专区国产一区二区| 中文欧美无线码| 韩国精品一区二区三区| 中文字幕色久视频| 精品人妻在线不人妻| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品一区二区在线观看99| 99国产精品一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 操出白浆在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久草成人影院| 久久久久精品人妻al黑| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 三级毛片av免费| 18禁国产床啪视频网站| av不卡在线播放| 一区在线观看完整版| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲午夜理论影院| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美在线黄色| 中文字幕高清在线视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 又大又爽又粗| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 交换朋友夫妻互换小说| av天堂在线播放| 久久久久久久久免费视频了| 欧美在线一区亚洲| 乱人伦中国视频| 国产成人av激情在线播放| 国产成人精品在线电影| 热99国产精品久久久久久7| 十八禁人妻一区二区| 精品电影一区二区在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 91成人精品电影| 夫妻午夜视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 色播在线永久视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 免费日韩欧美在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费日韩欧美在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品久久久av美女十八| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区|