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    飼料原料基質中不同營養(yǎng)成分對黃曲霉毒素B1合成關鍵基因表達影響的研究

    2020-11-05 09:58:42余保寧張妮婭齊德生
    飼料工業(yè) 2020年20期
    關鍵詞:水蘇天冬氨酸精氨酸

    ■劉 婕 余保寧 李 理 張妮婭 齊德生*

    (1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州510641;2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司,廣東廣州511356;3.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,湖北武漢430070)

    據(jù)世界糧農(nóng)組織估計,目前世界范圍內(nèi)至少有25%的農(nóng)作物受到了真菌毒素的污染[1],其中黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)的污染最嚴重。不同的飼料原料被黃曲霉毒素污染的程度會有差別,如同為能量飼料的玉米和小麥,玉米更容易被AF污染;且同為蛋白質飼料的豆粕和花生粕,花生粕更易被AF污染[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),在油料種子中AF 的污染要更嚴重[2],Mellon 等[3]發(fā)現(xiàn),在玉米胚中A. flavus產(chǎn)生AFB1的量遠遠高于玉米胚乳中的產(chǎn)毒量。且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),除了油脂含量能顯著影響AFB1合成以外,飼料原料基質成分的差異也會造成AF污染水平的不同[2,4]。天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生,而銅、鐵和錳不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1。隨著可溶性糖、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量增加,均能明顯促進黃曲霉菌絲生長(P<0.05);而鋅、鐵和錳均能促進黃曲霉菌絲生長,但是銅明顯抑制黃曲霉菌絲生長(P<0.05)[4]。目前的研究基本闡明了不同的飼料原料被AF污染存在差異性主要是由飼料中的營養(yǎng)成分的種類和含量所決定的,但這些營養(yǎng)成分的調(diào)控機制是什么,還需要進一步研究。因此本研究在課題組前期試驗結果的基礎上,選取對A. flavus產(chǎn)毒和生長影響較大的營養(yǎng)成分及水平,研究其對AF 生物合成過程中的關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM和aflP)的表達情況的影響。從而揭示飼料中不同營養(yǎng)成分對A. flavus產(chǎn)毒影響的作用機制。本研究結果將對指導飼料生產(chǎn)以及控制飼料AFB1污染提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    黃曲霉產(chǎn)毒菌株(Aspergillus flavusNRRL-3357)由中山大學賀竹梅教授實驗室贈送。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Detrose Agar,PDA)(青島海博生物技術有限公司)。DNA Marker(大連寶生物)、瓊脂糖(Biowest,法國)、TRizol 試劑(Invitrogin,美國)、反轉錄試劑盒(Takara,日本)、RNase Inhibitor(Vazyme Biotech,美國)、Premix Taq(Takara,日本)、iTaq Universal SYBR Green Super mix(Bio-Rad,美國)。本試驗用到的所有化學試劑無特殊說明均為分析純。

    試驗所用的基礎培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基:0.3%NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4·7H2O和3.0% 蔗糖。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌株保存活化及孢子懸浮液的制備

    將A. flavusNRRL-3357菌株保存在20%甘油中,然后保藏于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)研究。待用時,將保存的菌株在PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng),于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d。然后在培養(yǎng)皿中加入約20 ml孢子洗滌液(含有0.05% 吐溫-80的無菌生理鹽水)[5],用無菌棉棒輕輕洗下黃曲霉孢子,然后將含有孢子的洗滌液經(jīng)過4層無菌紗布過濾,收集濾液于含有玻璃珠的無菌藍蓋試劑瓶中,振蕩搖勻,讓孢子均勻分布在孢子洗滌液中。吸取適量的孢子液小心置于血球計數(shù)板(25×16)的計數(shù)室內(nèi),蓋上蓋玻片,靜置片刻,在顯微鏡下計數(shù)。然后將孢子液稀釋到需要的濃度備用[6]。

    1.2.2 菌絲體的收集

    參考前期研究的結果[4]及國內(nèi)外研究數(shù)據(jù),選擇可溶性糖:蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖;氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸;微量元素:鋅(七水硫酸鋅ZnSO4·7H2O)和銅(五水硫酸銅CuSO4·5H2O)作為試驗材料??扇苄蕴堑奶砑恿繛?.0、3.0 g/100 ml;氨基酸的添加量為0.5 g/100 ml;微量元素的添加量為50 mg/l。用6.0 mol/l的鹽酸和5.0 mol/l的NaOH將每組培養(yǎng)基的pH 值調(diào)至6.0。然后將培養(yǎng)基分裝到100 ml 三角瓶中,每個三角瓶中培養(yǎng)基的體積為30 ml。用透氣封口膜封口后121 ℃高溫高壓滅菌20 min,待冷卻至室溫后,接種100 μl 黃曲霉孢子菌懸液(1×108個/ml)混勻,將三角瓶用透氣封口膜封口之后置于氣浴搖床中培養(yǎng)3 d 和5 d,培養(yǎng)溫度為30 ℃,搖床轉速為150 r/min。培養(yǎng)結束后將三角瓶中的培養(yǎng)基和菌絲體通過濾紙過濾,收集菌絲體,菌絲體保存于-80 ℃用于基因表達量的測定。每組5個重復。

    1.2.3 AFB1合成相關基因表達量測定

    總RNA 的 提 取 采 用TRIzol Reagent(InvitrogenTM, USA),并參考曾麗梅[7]的方法。RNA 反轉錄使用的是Takara PrimeScript反轉錄試劑盒,反轉錄反應條件:37 ℃15 min;85 ℃5 s;結束后保持4 ℃。

    1.2.4 Real-time PCR基因表達量的檢測

    1.2.4.1 引物設計

    利用Primer 5.0引物分析軟件分別設計此次試驗所用的特異性上下游引物,beta-tubulin基因作為內(nèi)參基因。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物用超純水配置成10 μmol/l的工作溶液,-20 ℃保存。各引物序列如表1所示。

    1.2.4.2 cDNA質量檢測

    將提取的總RNA 進行反轉錄后,通過PCR 擴增檢測反轉錄得到的cDNA 的質量。并對設計的引物用cDNA進行PCR擴增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產(chǎn)物。

    表1 試驗所涉及的引物

    PCR 反應程序:98 ℃,5 min;98 ℃,10 s;55 ℃,30 s;72 ℃,45 s;72 ℃,10 min;40 個循環(huán),反應結束后保持在4 ℃。

    1.2.4.3 Real-time PCR

    確定了模板cDNA 和各對引物的質量后,Realtime PCR 試驗使用BIO-RAD 公司的iTaq Universal SYBR Green Supermix,在BIO-RAD CFX 系列Realtime PCR檢測系統(tǒng)上完成。

    反應程序:95 ℃,4 min;95 ℃,10 s;57 ℃,10 s;72 ℃,20 s;40 個循環(huán)。熔解曲線條件:55 ℃升溫至93.5 ℃,每0.5 ℃讀5 s。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    圖1 可溶性糖對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    本試驗的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理之后,結果按照“平均值±標準差(SD)”的方式表示。然后利用SPASS 22.0(Chicago,USA)軟件進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析。使用Duncan′s 檢驗對各處理組間平均值進行多重比較,P<0.05為差異顯著?;虻南鄬Ρ磉_量用2-△△Ct方法進行計算。

    2 結果

    本試驗研究了不同的營養(yǎng)成分對AF合成過程中相關基因表達的影響。試驗選擇了5個關鍵基因,分別是AF 合成過程中最關鍵的兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS,以及3 個結構基因aflD、aflM和aflP,這3 個結構基因分別代表了AF合成的前、中、后期3個階段。

    2.1 可溶性糖對AF合成中關鍵基因表達的影響(見圖1)

    根據(jù)前期試驗結果,由于果糖和棉子糖對AFB1 合成的促進作用不如其它4 種可溶性糖明顯,所以選擇了蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖作用試驗材料,而且1.0%和3.0%的可溶性糖對黃曲霉產(chǎn)毒的影響差異很明顯,所以本試驗選擇1.0%和3.0%兩個濃度。在培養(yǎng)5 d 時,4 種可溶性糖對AF合成相關基因的表達的影響見圖1。相比于1.0%的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖,當這4 種可溶性糖的含量增加到3.0%時,能明顯促進基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,同時3.0%葡萄糖(P<0.01)和水蘇糖(P<0.001)也顯著促進了aflP基因的表達。對于蔗糖、葡萄糖和麥芽糖,基因aflP表達量增加最為明顯,增加了近百倍,而在水蘇糖中基因aflS的表達量增加最為明顯。

    2.2 氨基酸對AF 合成中關鍵基因表達的影響(見圖2~圖3)

    圖2 天冬氨酸(A)、谷氨酸(B)、精氨酸(C)對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    圖3 天冬氨酸(A)、谷氨酸(B)、精氨酸(C)對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(3 d)

    根據(jù)前期試驗結果得知,由于丙氨酸和甘氨酸對AFB1 合成的促進作用不如天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸明顯,所以選擇了0.5%天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸進行研究。3 種氨基酸對AF 合成相關基因的表達見圖2(培養(yǎng)5 d)。培養(yǎng)5 d時,天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定促進作用,但差異不顯著;而在培養(yǎng)3d時,天冬氨酸可以明顯促進這5個關鍵基因的表達,見圖3A。培養(yǎng)5 d 時,谷氨酸明顯提高了基因aflP、aflD和aflM的表達量(P<0.05),同時對基因aflS和aflP的表達也有一定的促進作用,差異不顯著;但在培養(yǎng)3 d 時,谷氨酸顯著上調(diào)了基因aflP的表達(P<0.01),見圖3B。同樣在培養(yǎng)5 d時,精氨酸可以顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP(P<0.05)和aflS(P<0.001)的表達量,但是同時也抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達(P<0.01),而在培養(yǎng)3 d 時精氨酸對基因aflD、aflM和aflP的表達有一定的促進作用見圖3C。

    2.3 銅和鋅對AF 合成過程中關鍵基因表達的影響(見圖4~圖5)

    圖4 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(5 d)

    圖5 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響(3 d)

    根據(jù)課題組前期的試驗結果,鋅能夠明顯促進AFB1合成,銅不僅顯著抑制了AFB1合成還抑制了黃曲霉菌絲生長,所以選擇50 mg/l 的鋅和銅作為研究對象。鋅和銅對AF合成相關基因的表達見圖4(培養(yǎng)5 d)。與對照組相比,鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,同時銅明顯抑制aflP、aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達。雖然在培養(yǎng)5 d 后,鋅對AF合成關鍵基因的表達都是抑制狀態(tài),但是在培養(yǎng)3 d時,鋅能夠極顯著地促進這5 個關鍵基因的表達(P<0.001),尤其是基因aflP,表達量上調(diào)200 多倍,見圖5A;銅依然顯著抑制了基因aflP和aflS的表達見圖5B。

    3 討論

    AF生物合成的初始階段類似于脂肪酸的生物合成,即乙酰CoA(Acetyl-CoA)作為其起始單位,而丙二酸單酰CoA作為延長單位,在聚酮化合物合成酶的催化作用下形成AF 的聚酮骨架[8-10]。AF 的生物合成調(diào)控是一個復雜的多個途徑相互作用的過程,AF 合成通路基因成簇排列在70 kb的DNA序列上,其序列上包含了25個已定義明確的基因[11]。如基因aflP和aflS是AF 合成基因簇中相鄰的兩個調(diào)節(jié)基因,直接調(diào)控著AF 和ST(sterigmatocystin)的合成。aflD基因編碼的酮還原酶,可以將NOR(norsolorinic acid)轉化為AVN(averantin)[12];aflM參 與DMST(demethyl-sterigmatocystin)的合成[13];aflP參與ST 到OMST(O-methylsterigmatocystin)以及DMST 到DHOMST(dihydro-demethyl-sterigmatocystin)的轉化過程[14]?;騛flD、aflM、aflP分別代表了AF 合成途徑中的前中后段[15]。因此,本試驗一共選取這5個關鍵基因作為代表來研究這些營養(yǎng)元素對AF合成相關基因表達的影響。

    天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生,而銅不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1[4]。本試驗選擇了1.0%和3.0%的蔗糖、果糖、麥芽糖和水蘇糖作為研究對象。結果表明,3.0%的可溶性糖都能明顯促進aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達,3.0%葡萄糖和水蘇糖促進了aflP基因的表達,但是蔗糖和麥芽糖中aflP基因的表達卻受到了抑制,可能是因為末端產(chǎn)物(AF)積累過多從而反饋阻遏了aflP基因的表達。本試驗選擇了0.5%的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸作用試驗材料。培養(yǎng)5 d時,天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定的促進作用,但是差異不顯著;谷氨酸明顯提高基因aflP、aflD和aflM的表達量,但基因aflS和aflP差異不顯著,精氨酸顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達量,同時抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達。但是在培養(yǎng)3 d時,AFB1在培養(yǎng)基中還沒有大量積累,3種氨基酸均明顯刺激了5 個關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM、aflP)的表達。同樣,這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在了微量元素的試驗中,培養(yǎng)5 d 時鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達,但是在培養(yǎng)3 d時,鋅極顯著地促進了這5 個關鍵基因的表達。這個現(xiàn)象也進一步證實了AFB1 的積累會反饋阻遏AF 合成相關基因的表達,這種反饋阻遏首先是抑制結構基因的表達,然后再抑制調(diào)節(jié)基因的表達。銅不利于AFB1 的合成[4],首先是抑制了兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達,然后再抑制結構基因的表達。本試驗結果表明,這些營養(yǎng)元素通過促進關鍵基因的表達,從而加強AFB1合成,其中對結構基因aflM和aflP影響尤為顯著,同時調(diào)節(jié)基因aflP和aflS在AFB1合成過程中起關鍵作用。

    4 結論

    不同飼料原料中AFB1污染存在差異是由各種成分共同作用的結果,因此,通過調(diào)控原料中單一營養(yǎng)成分來控制飼料原料中AFB1的污染很難實現(xiàn)??扇苄蕴?、氨基酸和微量元素均可通過對AF 合成關鍵基因(aflP、aflS、aflD、aflM、aflP)不同程度的上調(diào),從而促進AFB1 合成。所以可以尋求物理、化學或生物的方法,抑制AF 合成調(diào)節(jié)基因(aflP、aflS)的表達,從而控制黃曲霉毒素的污染。

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