利用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)研制降解黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的復(fù)合益生菌

■周 璞 王 濤 劉 碩 張保平 常 娟 王 平 尹清強(qiáng)*

（1.河南省舞鋼市畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，河南舞鋼462599；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450046；3.河南省葉縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南葉縣467200；4.鶴壁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，河南鶴壁458000）

自1960 年英國(guó)火雞暴發(fā)霉菌毒素(Mycotoxin)事件，世界各地對(duì)霉菌毒素中毒癥進(jìn)行了大量調(diào)查研究。據(jù)報(bào)道，每年因?yàn)槭艿矫咕舅匚廴镜淖魑锖娃r(nóng)產(chǎn)品所造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)數(shù)千億美元[1]。霉菌毒素是霉菌在其所污染的谷物或飼料中所產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。含有霉菌毒素的飼料或其原料能夠?qū)π笄蒺B(yǎng)殖業(yè)以及飼料行業(yè)造成嚴(yán)重影響，已知的霉菌毒素有300多種，其中對(duì)人和動(dòng)物有較嚴(yán)重危害的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和嘔吐毒素(DON)等[2]。

黃曲霉毒素是由黃曲霉、溜曲霉、集蜂曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生，黃曲霉毒素對(duì)作物和糧食的污染一般是在田間生長(zhǎng)階段就會(huì)污染，當(dāng)貯藏條件不好或所處環(huán)境濕度較高，也會(huì)導(dǎo)致霉菌爆發(fā)生長(zhǎng)，對(duì)糧食、飼料和食物均可導(dǎo)致毒素污染。霉菌毒素污染問(wèn)題關(guān)系到飼料安全、動(dòng)物生產(chǎn)和食品安全，甚至還威脅到人類自身健康。防治霉菌毒素危害已成為養(yǎng)殖場(chǎng)、飼料廠以及食品廠生產(chǎn)管理的重中之重。據(jù)報(bào)道，2018年上半年收集到的166份小麥、玉米、魚粉、豆粕和麩皮等飼料原料樣品中AFB1 的檢出率為100%，最高值達(dá)79.55 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)，是由禾谷鐮刀菌和半裸鐮孢等真菌產(chǎn)生，具有類雌激素活性，可導(dǎo)致畜禽的繁殖障礙。通過(guò)調(diào)查結(jié)果表明，ZEA是我國(guó)飼料原料以及配合飼料檢出含量最高的霉菌毒素之一[4]。一般情況下，玉米赤霉烯酮的污染主要是通過(guò)農(nóng)作物收割前感染霉菌所致，因此ZEA 也被稱為“田間毒素”[5]。ZEA 污染糧食后，在加工過(guò)程中不易消滅，跟隨相應(yīng)體系進(jìn)入飼料行業(yè)、動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)甚至食品加工領(lǐng)域，引起嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題最終甚至危害人類的自身健康[6]。龔阿瓊等[7]從黑龍江、廣西、重慶和河北等地共收集樣品63 份，在飼料及飼料原料中ZEA 檢出率為80%，玉米副產(chǎn)物ZEA 檢出率高達(dá)100%，含量最高值為794.06 μg/kg。

霉菌毒素的脫毒法有物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，研究證實(shí)生物降解法避免了物理法和化學(xué)法的諸多不足，是一種最理想的霉菌毒素解毒法。據(jù)報(bào)道，乳酸菌發(fā)酵脫毒的反應(yīng)條件溫和，可以保持樣品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不變，改善風(fēng)味，在降解毒素的同時(shí)沒(méi)有有毒的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等[8]。Cho等[9]從ZEA污染較高的谷物、污水、土壤中篩選得到一株枯草芽孢桿菌亞種，對(duì)ZEA具有較好的降解作用。劉暢等[10]篩選到了對(duì)AFB1吸附效果較好的釀酒酵母，取得了比較滿意的結(jié)果。本研究通過(guò)響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，得到最佳的復(fù)合益生菌配伍分別對(duì)AFB1 和ZEA 進(jìn)行生物降解，為消除霉菌毒素的危害及維護(hù)動(dòng)物健康提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、NaCl 1%、酵母浸粉0.5%，用蒸餾水定容至1 L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)使pH值為7.0。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨2%、葡萄糖2%、酵母浸粉1%，用蒸餾水定容至1 L。

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、酵母浸粉1%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.2%、檸檬酸二銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80 1 ml，用蒸餾水定容至1 L。

上述三種培養(yǎng)基在121 ℃、1.034×105Pa 條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種的活化與培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別接種到LB和YPD培養(yǎng)基上，分別在37 ℃和30 ℃及200 r/min條件下培養(yǎng)24 h；干酪乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基上，37 ℃靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)24 h。三種菌分別按2%的接種量接入以上對(duì)應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)。

1.3 復(fù)合益生菌體外降解霉菌毒素的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)

將枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、干酪乳桿菌的活菌數(shù)皆調(diào)至1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/ml，利用表1的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，測(cè)定不同益生菌組合降解霉菌毒素的效果。

霉菌毒素的降解率（%）=（對(duì)照組中霉菌毒素含量-試驗(yàn)組中霉菌毒素含量）/對(duì)照組中霉菌毒素含量×100

利用Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計(jì)、模型擬合和數(shù)據(jù)分析，得出回歸方程。根據(jù)線性回歸方程，得出降解霉菌毒素的最佳益生菌組合。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平(CFU/ml)

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項(xiàng)方程進(jìn)行擬合，預(yù)測(cè)二次多項(xiàng)方程式如下：

1.4 復(fù)合益生菌對(duì)ZEA生物降解的設(shè)計(jì)

1.4.1 ZEA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將3 mg ZEA 標(biāo)準(zhǔn)品溶解到3 ml 甲醇中，混勻后取0.1 ml 溶于1.9 ml 甲醇中，使ZEA 濃度為50 mg/l，放于-20 ℃冰箱中備用。

1.4.2 復(fù)合益生菌降解ZEA的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)

對(duì)照組：1.95 ml 生理鹽水+ 3 ml MRS 培養(yǎng)基+0.05 ml ZEA標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg/l)。試驗(yàn)組：不同體積的三種益生菌，分別加入0.05 ml ZEA 標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg/l)及3 ml MRS 培養(yǎng)基，再加生理鹽水補(bǔ)足5 ml。該設(shè)計(jì)共有18 個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)定ZEA含量為500 μg/l。

1.4.3 降解ZEA的測(cè)定

各處理組在37 ℃及200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，然后在4 ℃及10 000 r/min 的離心機(jī)中離心5 min，取一定量上清液，按ZEA試劑盒推薦的操作步驟進(jìn)行霉菌毒素含量測(cè)定。

1.5 復(fù)合益生菌對(duì)AFB1生物降解的設(shè)計(jì)

1.5.1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將3 mg AFB1 標(biāo)準(zhǔn)品溶到3 ml 的甲醇中，混勻后取0.1 ml 溶于0.9 ml 的甲醇中，使得溶液濃度為100 mg/l，再用甲醇稀釋10 倍，使?jié)舛葹?0 mg/l，放于-20 ℃冰箱中待用。

1.5.2 復(fù)合益生菌體外降解AFB1的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)

對(duì)照組：1.975 ml 生理鹽水+3 ml MRS 培養(yǎng)基+0.025 ml AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg/l)。試驗(yàn)組：不同體積的三種益生菌，分別加入0.025 ml AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(10 mg/l)及3 ml MRS 培養(yǎng)基，再加生理鹽水補(bǔ)足5 ml。該設(shè)計(jì)共18 個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)定AFB1含量為50 μg/l。

1.5.3 降解AFB1的測(cè)定

利用AFB1試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)及操作步驟同上。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用SPSS17統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan's法多重比較，差異顯著性用P＜0.05 表示，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 降解ZEA的最佳益生菌組合

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件中Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了18個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中對(duì)照組24 h后ZEA含量為511.53 μg/l，計(jì)算試驗(yàn)組ZEA的降解率，并對(duì)其進(jìn)行回歸建立響應(yīng)面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程方差分析見(jiàn)表2和表3。利用Design-Expert 8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得出回歸模型方程為：Y=-22.65-58.73X1+27.00X2+39.87X3+5.40X12-0.57X1X2+0.86X1X3-1.95X22-0.30X2X3-3.52X32。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)參數(shù)與ZEA降解率

從表3 可以看出，上述模型P=0.000 2，表明該模型統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性，有意義。在顯著水平(P＜0.05)條件下，總ZEA 降解率回歸模型中枯草芽孢桿菌X1(P＜0.000 1)、干酪乳桿菌X2(P=0.031 9)，這兩種因素對(duì)響應(yīng)值有顯著影響。X12(P=0.000 4)與X32(P=0.004 2)表現(xiàn)顯著，表明在枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母?jìng)€(gè)體間有較好的降解ZEA 作用。回歸模型的決定系數(shù)為R2=0.968 1和R2adj=0.927 1，說(shuō)明回歸方程的擬合度較好，可以較好地解釋模型的變化。因此，可用此模型對(duì)復(fù)合益生菌降解ZEA 的效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)?；陧憫?yīng)面分析，通過(guò)軟件模擬尋優(yōu)，當(dāng)枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為1×107、1×105CFU/ml和1×106CFU/ml時(shí)，降解毒素ZEA效果最好，實(shí)測(cè)降解率為36.42%，預(yù)測(cè)值為34.50%。

2.2 最佳益生菌組合降解AFB1響應(yīng)面分析

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件 中Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了18個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中對(duì)照組24 h 后AFB1 含量為43.63 μg/l，計(jì)算試驗(yàn)組AFB1 的降解率并對(duì)其進(jìn)行回歸，建立響應(yīng)面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程方差分析見(jiàn)表4 和表5。利用Design-Expert 8.0.6 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得出回歸模型方程為：Y=80.346-10.64X1-17.86X2+5.51X3+1.13X12-0.38X1X2+0.16X1X3+1.57X22+1.02X2X3-0.83X32。

表3 ZEA降解率響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)參數(shù)與AFB1降解率

從表5 可以看出，上述模型P=0.002 2，表明該模型統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性，有意義。在顯著水平(P＜0.05)條件下，回歸模型中枯草芽孢桿菌X1(P=0.032 7)、干酪乳桿菌X2(P＜0.000 1)、產(chǎn)朊假絲酵母X3(P=0.003 2)，這些因素對(duì)響應(yīng)值有顯著影響。失擬項(xiàng)P=0.021 0，即方程模型失擬不是極顯著，說(shuō)明方程的擬合度可以?；貧w模型的決定系數(shù)為R2=0.935 0和R2adj=0.851 4，說(shuō)明回歸方程的擬合度好，可以較好地解釋模型的變化。因此，可用此模型對(duì)復(fù)合益生菌組合對(duì)AFB1 降解效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

基于響應(yīng)面分析，通過(guò)軟件模擬尋優(yōu)，當(dāng)枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為1×106、1×107CFU/ml與1×107CFU/ml時(shí)，降解毒素AFB1效果最好，實(shí)測(cè)降解率為49.58%，預(yù)測(cè)值為47.58%。

3 討論

關(guān)于利用單一微生物進(jìn)行降解ZEA 的研究有很多。據(jù)報(bào)道，研究人員從霉變玉米以及玉米地土壤中篩選出了4 株可降解ZEA 的芽孢桿菌[11]。Lei 等[12]得到一株枯草芽孢桿菌，具有高效降解ZEA 的能力，該菌株對(duì)飼料以及霉變玉米中ZEA 的降解率在84%以上。通過(guò)研究枯草芽孢桿菌降解ZEA的特性，發(fā)現(xiàn)該菌所產(chǎn)的一種胞外酶是降解ZEA作用的活性物質(zhì)[13]。冼嘉雯[14]篩選出一株酵母菌，在含有ZEA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，ZEA殘留量只有3.4%。本研究選用的是三個(gè)不同菌屬的菌種組合，雖然對(duì)ZEA的降解率不是非常高，但對(duì)于下一步益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

表5 AFB1降解率響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析

有文獻(xiàn)報(bào)道，AFB1 與乳酸菌細(xì)胞壁的多聚糖等成分相結(jié)合，通過(guò)非共價(jià)方式形成AFB1-乳酸菌復(fù)合物[15]。李志剛等[16]用8 株乳酸桿菌與AFB1 和生理鹽水混合培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h和2 h后檢測(cè)AFB1含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌吸附效果最好。Bluma 等[17]篩選出的多株芽孢桿菌，皆對(duì)黃曲霉以及寄生曲霉類的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。本研究制備的復(fù)合益生菌對(duì)AFB1降解率達(dá)到了49.58%，其中可能包括酶解和吸附兩種作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母以不同的比例組合可顯著地降解AFB1和ZEA，為畜禽生產(chǎn)中霉菌毒素的生物降解及畜產(chǎn)品的安全生產(chǎn)提供了一種新型的微生物飼料添加劑。