微核試驗的改進

馬寶良，魯克慶（.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所，甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；.甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730030）

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微核試驗的改進

馬寶良1，魯克慶2
（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所，甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；2.甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730030）

【摘要】目的 將傳統(tǒng)的骨髓采集方法與改良的方法進行比較，明確兩種方法在細胞數(shù)量、組織污染情況和涂片染色背景的差異，為以后微核試驗的應(yīng)用提供參考。方法 將處死小鼠的胸骨取出，一部分，使用傳統(tǒng)的骨髓采集方法，將小鼠的骨髓擠壓于含胎牛血清的載玻片上，常規(guī)涂片；另一部分，用1 mL注射器抽取胎牛血清100 μL刺入胸骨中，將骨髓沖出，涂環(huán)形薄片。結(jié)果 兩種方法均能達到實驗要求，但是改良骨髓采集法，采集的細胞數(shù)量更多，組織污染細胞少，制片背景更加清晰。結(jié)論 與傳統(tǒng)的骨髓采集方法相比較，改良的骨髓采集法更具優(yōu)勢，使微核試驗的細胞計數(shù)簡易。

【關(guān)鍵詞】骨髓采集；胎牛血清；細胞；小鼠

微核是存在于細胞核以外的異常染色體或染色體片段，與細胞核的染色一致，直徑小于主核的1/3，能夠被光學(xué)顯微鏡觀察。當(dāng)外來有害因素（物理，化學(xué)，生物）作用于細胞后，染色體發(fā)生斷裂或丟失，細胞胞漿中出現(xiàn)一個或多個小核，這些微核是檢測遺傳毒的一種重要的手段。微核試驗是一種檢測基因染色體斷裂或丟失的一種基本的遺傳學(xué)毒性試驗，它主要是應(yīng)用于檢測藥物和化學(xué)物質(zhì)對基因的損傷，明確這些物質(zhì)的遺傳毒性，目前的微核試驗已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)境衛(wèi)生、臨床疾病和病毒的遺傳毒性的檢測［1］。對于能夠引起染色體斷裂和有絲分裂紊亂的藥物、射線、疾病均可以使用微核試驗進行檢測［2］，微核試驗是最為公認(rèn)的遺傳毒性檢測方法。

在藥物臨床前期的遺傳毒性檢測過程中，推薦使用的動物為嚙齒類，以大小鼠最為常用［3］，以骨髓染色計數(shù)微核細胞數(shù)為公認(rèn)的檢測手段，但是小鼠的骨髓腔較細，無法直接抽取，因此骨髓的采集成為實驗成敗的關(guān)鍵性的一步。如采集的細胞存在較多的雜質(zhì)或其他的細胞如脂肪細胞，將會為后續(xù)的細胞計數(shù)增加難度，或是無法進行計數(shù)。目前推薦的兩種方法，一種是胸骨［4］取材，使用鉗子將胸骨中的骨髓擠出骨髓腔，另為一種采集股骨的骨骺段［4－6］，用1 mL的注射器吸胎牛血清將骨髓沖出，反復(fù)吹打過濾或離心制成懸液，涂片。但是兩種采集制片方法均容易受到雜質(zhì)和其他細胞的污染，對于操作者的要求較高。我們在進行微核試驗的過程中，為了克服污染問題，探討了一種新的骨髓采集方式，骨髓的采集部位為胸骨，使用1 mL的注射器改帶5號鋼化針頭吸入胎牛血清后穿刺入骨髓腔中，沖出骨髓，涂環(huán)形薄片，顯微鏡下評估細胞數(shù)后，自然干燥，甲醇固定，Giemsa染色。

1　材料和方法

1.1動物

清潔級的昆明小鼠12只，體重18～21 g，1. 5月齡，購于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心【SCXK（甘）2011－0006】，飼養(yǎng)于其屏障動物實驗設(shè)施【SYXK（甘）2011－0002】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。隨機分成A、B兩組，每組6只。A組使用傳統(tǒng)的方法采集骨髓；B組采用改良的采集方法采集骨髓。

1.2儀器和試劑

剪刀、鑷子、止血鉗、1 mL注射器，鋼化針頭、胎牛血清、光學(xué)顯微鏡、載玻片，Giemsa染液

1.3方法

A組：最后一次染毒后，在確定時間行3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干凈紗布擦拭，剪去每節(jié)骨骺端，用小型彎止血鉗擠出骨髓液，點在載玻片一端預(yù)先滴好的一滴胎牛血清中?；靹蚝笸破?。長度為2～3 cm。

B組：3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，迅速剪去其胸骨，剔去肌肉。用微濕潤或干燥的脫脂棉簽擦拭，除去胸骨周圍殘留的肌肉組織，以上步驟均在濾紙上操作。用規(guī)格為5號鋼化針頭、1 mL一次性無菌注射器吸取100 μL的胎牛血清，在近劍突段剪去軟骨段至顯露骨髓處。從遠軟骨段的一側(cè)骨骺端用5號針頭垂直穿刺進入骨膜后水平繼續(xù)穿刺至針頭微外顯，倒針至穿刺點1/3處，打出針內(nèi)少量胎牛血清沖出腔內(nèi)骨髓，點在潔凈的載玻片上，用針頭環(huán)形涂直徑為1 cm的圓形薄片即可。對中間段胸骨，可剪去每節(jié)骨骺端，將針頭直接從骨髓腔隙邊穿刺邊回抽骨髓，然后輕輕打出吸取的骨髓滴1小滴在載玻片上，用針頭環(huán)形涂直徑為1 cm的薄片即可。

1.4染色：使用磷酸鹽緩沖液，將Giemsa染液配成10%的應(yīng)用液，染色10 min。

2　結(jié)果

涂好的濕片可在顯微鏡下及時直接觀察，分別在×20，×40物鏡下看細胞分布及相對密度。以尿沉渣鏡檢細胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)為參考［7］，將×20物鏡下細胞分布均勻，細胞數(shù)滿視野（+ + +—+ + + +）；在×40物鏡下細胞分布均勻，細胞數(shù)達50～100 個/視野。染色后油鏡下細胞數(shù)可達到30～50個/視野為制片合格。在油鏡下按一定順序進行PCE和微核計數(shù)。PCE細胞呈灰藍色、成熟紅細胞呈橘黃色。微核多數(shù)為圓形，邊緣整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍紫色。PCE細胞中微核多為一個，也可有兩個或以上微核，此時仍按有微核的PCE計算。

3　討論

微核試驗是細胞基因損傷檢測的生物學(xué)標(biāo)志之一［8］，小鼠骨髓微核實驗是最常用的微核實驗。美國食品藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA），歐洲藥監(jiān)局（European medicines agency，EMA）等部門均要求：基因毒性的檢測為藥物安全性評估的必須一部分［9］。在過去的幾十年里，此實驗被廣泛應(yīng)用于藥品、食品等的遺傳毒性的檢測，以及環(huán)境污染的檢測、臨床疾病的診斷等。但是如何獲取滿意的骨髓涂片，進行有效的細胞計數(shù)，仍有一定的困難。

我們采用穿刺取骨髓細胞和擠壓取骨髓細胞，都能獲得滿意的細胞數(shù)。但擠壓后點滴采集的骨髓，雖然方法相對容易和迅速獲得骨髓細胞，但因擠壓過程中在胸骨上殘留很少的組織細胞等也會一起被點滴收集，有一定的組織污染，增加額外的細胞背景。穿刺法或抽吸骨髓法可很好地減少污染，相對顯示好的細胞染色背景。另我們借鑒血液制片厚滴法［7］和細菌涂片技術(shù)中菌落制片方法［10］，采取環(huán)形涂直徑為1 cm的圓形骨髓細胞薄片，較常規(guī)推片制片技術(shù)，在獲取骨髓細胞量一定的情況下，通過減小制片面積，增加細胞密度，還可在顯微鏡下及時直接評估采集的骨髓細胞數(shù)，對細胞量少的制片補充穿刺一次增加細胞量。

參考文獻：

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［3］ Araldi RP，Rechiutti BM，Mendes TB，et al. Mutagenic potential of Cordia ecalyculata alone and in association with Spirulina maxima for their evaluation as candidate anti-obesity drugs［J］. Genetics and molecular research，2014，13（3）：5207 －5220.

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［5］ 白殿卿，鄭穎.藏藥旺拉毒理學(xué)安全性試驗研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，12（7）：740－742

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［9］ Massey ED，Hinchliffe S. 2-Aminoanthracene，diethylstilboestrol and vinblastine tested in the in vitro mammalian cell micronucleus test at British American Tobacco UK in support of the OECD draft Test Guideline 487［J］. Mutation research 2010，702（2）：208－ 211.

［10］ 倪語星，尚紅.臨床微生物學(xué)與檢驗（第4版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007. 39.

〔修回日期〕2016－01－13

Experience exchange in vitro micronucleus assay

MA Bao-liang1，LU Ke-qing2
（1. Institute of Urology，Second Hospital，Lanzhou University，Gansu Provincial Key Laboratory of Urological Diseases，Lanzhou 730030，China；2. Gansu Nephro-Urological Clinical Center，Lanzhou 730030，China）

【Abstract】Objective To compare the conventional marrow collection with new marrow collection，in the number of cell，other tissues pollution and the background of the smear，providing the reference for future micronucleus test. Methods The mice was enthanasia and the sternums were taken. One group，using the conventional method of marrow collection，squeezing the marrow to the slide with fetal bovine serum；the other group，using 1-mL injector extracting fetal bovine serum 100μL，injecting into mice sternums and rushing out the bone marrow for circle smear. Results Two methods can meet the requirement of test，but the new marrow collection can acquire more number of cells，less the tissues pollution and more clear in the background of smear. Conclusions Comparing with the conventional marrow collection，the new method has more superiority to simplify the next cell counting.

【Key words】Marrow collection；Fetal bovine serum；Cell；Mice

【中圖分類號】R-332

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0086-03

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 017

［作者簡介］馬寶良（1979－），主管檢驗師，主要從事動物試驗，微生物檢驗。Email：mabl@ lzu. edu. cn。